单克隆抗体的制备ppt课件.ppt

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1、为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能第一节第一节 杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理 一、杂交瘤技术一、杂交瘤技术 二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存二、阳性杂交瘤

2、细胞的克隆化培养与冻存第二第二节节 单单克隆抗体的制克隆抗体的制备备 一、一、单单克隆抗体的克隆抗体的产产生生 二、二、单单克隆抗体的克隆抗体的纯纯化化 三、三、单单克隆抗体的性克隆抗体的性质鉴质鉴定定 四、四、单单克隆抗体的特性克隆抗体的特性为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能第三第三节节 基因工程抗体制基因工程抗体制备备 一、人源化抗体一、人源化抗体 二、小分子抗体二、小分子抗体 三、抗体融合蛋白三、抗体融合蛋白

3、 四、双特异性抗体四、双特异性抗体 五、噬菌体抗体五、噬菌体抗体库库技技术术第四第四节节 单单克隆抗体的克隆抗体的应应用用 一、一、检验检验医学医学诊诊断断试剂试剂 二、蛋白二、蛋白质质的提的提纯纯 三、小分子抗体的三、小分子抗体的应应用用 四、抗体融合蛋白的四、抗体融合蛋白的应应用用 五、双特异抗体的五、双特异抗体的应应用用 六、抗体六、抗体库库技技术术的的应应用和前景用和前景思考思考题题小小结结为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中

4、小学图书室育人功能第一节第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术原理：杂交瘤技术原理：聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）：）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合胞与小鼠骨髓瘤细胞融合HATHAT培养基的选择培养：培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤增殖的杂交瘤细胞系细胞系单克隆抗体生成：单克隆抗体生成：接种杂交瘤接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体中即可得到高效价的单克隆抗体为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平

5、新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能抗体种类：抗体种类：第一代抗体第一代抗体 多克隆抗体多克隆抗体（polyclonalantibody)第二代抗体第二代抗体单克隆抗体（单克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体第三代抗体基因工程抗体（基因工程抗体（geneticengineeringantibody)为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小

6、学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能B B淋巴细胞淋巴细胞:寿命短寿命短,分分泌特异系性抗体泌特异系性抗体骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：寿命长寿命长杂交瘤细胞：杂交瘤细胞：寿命长，寿命长，单克隆抗体单克隆抗体为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能流流程程一、杂交瘤技术一、杂交瘤技术为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神

7、贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能不产生不产生IgIg的重链和轻链的重链和轻链HGPRT-;TK-与提供淋巴细胞的动物品系相同与提供淋巴细胞的动物品系相同（一）小鼠骨髓瘤细胞（一）小鼠骨髓瘤细胞为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能动动物：物：BALB/BALB/c c小鼠小鼠7 71212周龄周龄20g20g25g25g体重体重（二）免疫脾细胞（二）免疫脾细胞为深入学习习近

8、平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能细胞性抗原：细胞性抗原：（1 12 2）10107 7/只，不加佐剂，只，不加佐剂，2 23 3周重复一次周重复一次可溶性抗原：可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂首次，完全福氏佐剂+100+100微克抗原，微克抗原，3 36 6周周100100200200微克抗原，融合前微克抗原，融合前3 3天，加强免疫天，加强免疫免疫小鼠免疫小鼠为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习

9、习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能。淋巴细胞淋巴细胞为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能。淋巴细胞发育淋巴细胞发育为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分

10、发挥中小学图书室育人功能。浆细胞浆细胞为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能。抗原接种抗原接种为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能培养液：培养液：RPM1640培养液培养液DMEM培养液培养液（三）细胞融合（三）细胞融合为深入学习习近平新时代

11、中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能细胞融合剂：细胞融合剂：PEG:分子量分子量4000的的PEG是最常用的细胞融合剂是最常用的细胞融合剂作用机理：作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合膜易打开而有助于细胞融合作用特点：作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEGPEG，其纯度与毒性有所不同，其纯度与毒性有所不同为深入学习习近平

12、新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能培养骨髓瘤细胞：培养骨髓瘤细胞：选择对数生长期的细胞进行传代培养选择对数生长期的细胞进行传代培养细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用避免细胞返祖：定期用8-AG8-AG处理细胞处理细胞注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于于-80-80或液氮及干冰中或液氮及干冰中免疫脾细胞的制备：免疫脾细胞

13、的制备：1110108 8的的淋巴细胞淋巴细胞 无菌手术无菌手术为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能饲养细胞：饲养细胞：细胞密度过低不利于细胞生长繁殖细胞密度过低不利于细胞生长繁殖常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞其中其中MQMQ还有清除死亡细胞的作用还有清除死亡细胞的作用饲养存活一般不超过饲养存活一般不超过2 2周，不影响杂交瘤细胞周，不影响杂交瘤细胞的纯化的纯化为深入学习习近平新时代中国特色社会

14、主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能。饲养细胞饲养细胞为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能骨髓瘤细胞与淋巴细胞骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3)(1:3)50%50%PEG 1minPEG 1min内加完内加完;2 2minmin内加内加1010mlml培养液培养液融合方法融合

15、方法为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能SP2/0SP2/0细胞与脾细胞的比例为细胞与脾细胞的比例为1 1：2 25 51ml 50%1ml 50%的的PEGPEG（无菌，预温（无菌，预温3737）在）在1 1分钟内滴完分钟内滴完,静置静置9090秒秒,时间一到时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止停止PEGPEG作用作用根据细胞数量加入根据细胞数量加入HATHAT培养基，使之分

16、加到培养基，使之分加到9696孔板中时每孔孔板中时每孔细胞数为（细胞数为（0.50.51.51.5）10105 5个。融合后个。融合后7 7天，换用天，换用HTHT培养液培养液细胞融合细胞融合为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能10102020天出现克隆天出现克隆HATHAT筛选筛选挑克隆挑克隆融合细胞的早期培养融合细胞的早期培养为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色

17、社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能HGPRTHGPRT酶与酶与TKTK酶酶：次黄嘌呤磷酸核糖转化酶次黄嘌呤磷酸核糖转化酶胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）杂交瘤细胞的选择性培养（四）杂交瘤细胞的选择性培养应用液：应用液：8-8-杂氮鸟嘌呤杂氮鸟嘌呤 聚乙二醇聚乙二醇为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能HATHAT培养基：

18、培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤次黄嘌呤A（Aminopterin）：）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断阻断DNA合成主要途径合成主要途径T(Thymidine)：胸胸腺嘧啶核苷；腺嘧啶核苷；“核苷酸前体核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成，供细胞通过替代途径合成DNADNA为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能HATHAT选择作用：选择作用：淋巴细胞：淋巴细胞：不能生长，不能生长，5

19、 57 7天死亡；天死亡；DNADNA合成的合成的主要途径被主要途径被A A阻断阻断骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：不能生长，不能生长，5 57 7天死亡；天死亡；HGPRTHGPRT缺缺乏，乏，DNADNA合成的替代途径受阻合成的替代途径受阻为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能SP2/O:HGPRT-，TK-;长长命命脾细胞脾细胞:HGPRT+，TK+;短命短命(7天天)杂交杂交瘤细胞瘤细胞:HGPRT+，TK+;长长命命

20、骨髓瘤细胞、脾细胞与骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交杂交瘤细胞瘤细胞为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能杂交瘤细胞：杂交瘤细胞：长期生长繁殖长期生长繁殖利用淋巴细胞的利用淋巴细胞的HGPRT，将，将H合成为嘌呤合成为嘌呤碱并最终与碱并最终与T一起合成一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力为深入学习习近平新时代中国特色社

21、会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能有限稀释法有限稀释法(limitingdilution)显微操作法显微操作法(micromanipulation)FACS法法（fluorescenceactivatedcellsorter）软琼脂平板法软琼脂平板法(softagarmethod)二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义

22、思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能特点：特点：不需任何特殊设备不需任何特殊设备克隆出现效率高克隆出现效率高实验室常用方法实验室常用方法方法：方法：细胞悬液通过系列稀释细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含每个培养孔含0.50.51 1个细胞个细胞有限稀释法有限稀释法为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能效率最高效率最高价格昂贵价格昂贵FAC

23、S为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能配制方案：配制方案：杂交瘤细胞（杂交瘤细胞（1 15 5）x10 x106 6/ml)+/ml)+细胞冻存液细胞冻存液(30%(30%40%40%牛血清，牛血清，50%50%60%RPMI-164060%RPMI-1640培养液，培养液，10%DMSO)10%DMSO)“慢冻慢冻”：分步冷冻，分步冷冻，30-7030-70液氮液氮“快融快融”：取出立即浸入取出立即浸入373740

24、40水浴中，使其迅速融化、水浴中，使其迅速融化、复苏复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能防止污染防止污染避免染色体丢失避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡防止细胞密度过高而死亡细胞冷冻的意义细胞冷冻的意义为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯

25、彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能第二节第二节单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。备单克隆抗体。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神

26、为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能一、单克隆抗体的产生一、单克隆抗体的产生动物体内诱生方法：动物体内诱生方法：每次用每次用BALB/cBALB/c或或F1F1代小鼠，（代小鼠，（5 51010）10105 5/只只体外培养法：体外培养法：中空纤维培养系统中空纤维培养系统单抗含量不高，牛血清单抗含量不高，牛血清AbAb难以去除难以去除为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻

27、全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能腹腔注射法腹腔注射法为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能前前5 5天进行天进行,预先腹腔注射预先腹腔注射pristanepristane（1 15 5）10106 6细胞细胞1 13 3w w形成腹水形成腹水高滴度腹水高滴度腹水为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,

28、贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能可溶性抗原：可溶性抗原：ELISAELISA抗体捕获法抗体捕获法细胞、亚细胞结构上的抗原：细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法免疫荧光法（用丙酮和甲醇按（用丙酮和甲醇按1:11:1比例固定细胞）比例固定细胞）二、二、单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能ELISAELISA为深入学习习近平新

29、时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能ELISAELISA为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能多头加样枪多头加样枪为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国

30、教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能。免疫荧光法免疫荧光法为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能盐析沉淀盐析沉淀亲和层析亲和层析离子交换层析离子交换层析 McAb McAb的纯化的纯化 为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学

31、图书室育人功能IgIg类型、亚类测定：类型、亚类测定：双扩法或双扩法或ELISAELISA法法特异性测定：特异性测定：抗原类似物的交叉反应抗原类似物的交叉反应效价测定：效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示用腹水或培养液的稀释度表示表位测定：表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的几株单抗是否为不同表位特异的,用竞用竞争抑制争抑制法，相加指数法及微机集群分析法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：亲和性测定：测定亲和常数测定亲和常数K K杂交瘤细胞染色体：杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠秋水仙素裂解法，小鼠B B细胞染色体细胞染色体4040条，条，SP2/0SP2/0细胞细胞6868条，杂交

32、瘤细胞一般条，杂交瘤细胞一般100100多条多条McAbMcAb靶抗原分子量：靶抗原分子量：常用常用western blotwestern blot三、三、单克隆抗体的性质鉴定单克隆抗体的性质鉴定为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能四、单克隆抗体的特性四、单克隆抗体的特性高度特异性高度特异性高度的均一性和可重复性高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应弱凝集反应和不呈现沉淀反应对环境敏感性对环境敏感性（一）

33、单克隆抗体的特性（一）单克隆抗体的特性为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能优点优点 ：在体外在体外“永久永久”地存活并传代地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗（二）单克隆抗体的优点与局限性（二

34、）单克隆抗体的优点与局限性局限性局限性 ：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体反应强度不如多克隆抗体制备技术复杂、费时费工、价格较高制备技术复杂、费时费工、价格较高为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能 McAb McAb PcPcAbAb 抗原要求抗原要求 可以不纯可以不纯 纯度高纯度高得量得量 高高 低低特异性特异性 高高 低低 稳定稳定

35、 低低 高高 沉淀反应沉淀反应 无无 有有成本成本 高高 低低McAbMcAb与与PcPcAbAb的比较的比较为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能McAbandPcAb为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能第三节第三节基因工程抗体制备基因工程

36、抗体制备基因工程抗体基因工程抗体(Geneticengineeringantibody)根据研究者的意图，采用基因工程方法，在根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。价抗体和双特异性抗体。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯

37、彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能 将小鼠将小鼠IgIg基因敲除，转染人基因敲除，转染人IgIg基因，在基因，在小鼠体内产生人小鼠体内产生人AbAb，再经杂交瘤技术，产生，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体大量完全人源化抗体一、人源化抗体一、人源化抗体为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能方法：方法：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因

38、，与人IgIg恒定恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体特点：特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力（一）嵌合抗体（一）嵌合抗体为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能嵌合抗体嵌合抗体为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深

39、入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能定义：定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V V）中互补）中互补决定簇（决定簇（CDRCDR）序列改换成鼠源单抗）序列改换成鼠源单抗CDRCDR序列。重构成既具序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。RAbRAb亦叫亦叫“重构型抗体重构型抗体”，因其主要涉及，因其主要涉及CDRCDR的的“移植移植”，又可称为又可称为“CDRC

40、DR移植抗体移植抗体意义：意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗（二）改型抗体（二）改型抗体为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能FabFab：抗原结合片断抗原结合片断FvFv：可变区片段可变区片段ScFvScFv：单链可变区片段单链可变区片段SdAbSdAb：单区抗体单区抗体 二、小分子抗体二、小分子抗体为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习

41、近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能小分子抗体小分子抗体为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能其它生物活性蛋白融合其它生物活性蛋白融合三、抗体融合蛋白三、抗体融合蛋白为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国

42、教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能 许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。取得杀伤肿瘤细胞的作用。四、双特异性抗体四、双特异性抗体为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九

43、大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能 分别分离纯化两种不同的分别分离纯化两种不同的McAbMcAb，使各抗体，使各抗体解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，产物均一性不佳。产物均一性不佳。化学交联化学交联BsAb为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大

44、精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能 将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤融合，产生四源杂交瘤 (quadroma)。但二次杂交瘤细胞但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。BsAbBsAb在其中在其中的比例可为的比例可为10%10%50%50%不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAbBsAb的产量少且活性低，费时费

45、力，临床应用时存在人的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应抗鼠抗体免疫反应 (HAMA)(HAMA)，因此不适用于临床。，因此不适用于临床。细胞工程细胞工程BsAb为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能 多采用抗体分子片段多采用抗体分子片段,如如FabFab，FvFv或或ScFv,ScFv,经基因操作修饰后经基因操作修饰后,或体或体外组装为外组装为BsAb,BsAb,或直接表达分泌型或直接表达分泌

46、型的的BsAbBsAb。基因工程基因工程BsAb为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能定义：定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在人源性的抗体，在HIVHIV等病毒感染和肿瘤

47、的诊断与治等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性疗方面有其独特的优越性 五、噬菌体抗体库技术五、噬菌体抗体库技术为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能用用PCRPCR扩增人抗体重链可变区扩增人抗体重链可变区(VH)(VH)和轻链可变区和轻链可变区(VL)(VL)基因基因克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并

48、扩增。用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。抗体库：抗体库：组合抗体文库：在建库过程中如果将组合抗体文库：在建库过程中如果将VHVH和和VLVL随机组合随机组合 人天然抗体库：抗体人天然抗体库：抗体mRNAmRNA来源于未经免疫的正常人来源于未经免疫的正常人（一）基本原理和程序（一）基本原理和程序为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分

49、发挥中小学图书室育人功能噬菌体抗体库噬菌体抗体库为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能充分发挥中小学图书室育人功能从外周血或脾、淋巴结等组织中分离从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B B淋巴细胞，提取淋巴细胞，提取mRNAmRNA并逆转录为并逆转录为cDNAcDNA；应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCRPCR技术扩技术扩增不同的增不同的IgIg基因片段；基因片段；构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体

50、有构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有噬菌体、丝状噬噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库菌体抗体库(surface display antibody library)(surface display antibody library)常用载常用载体；体；表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附合吸附-洗脱洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。构建噬菌体抗体库构建噬菌体抗体库为深入学习习近平新时代中国特色社