生物大分子的电子显微镜技术幻灯片.ppt

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1、生物大分子的电子显微镜技术第1页，共32页，编辑于2022年，星期一n关于生物大分子：蛋白质，酶，核酸，多糖，脂类关于生物大分子：蛋白质，酶，核酸，多糖，脂类n研究生物大分子的意义：理化特性及空间构像与功能研究生物大分子的意义：理化特性及空间构像与功能n研究生物大分子的方法研究生物大分子的方法 物理化学方法探讨理化特性物理化学方法探讨理化特性 X X射线衍射技术分析结晶样品射线衍射技术分析结晶样品 电子显微镜的直接观察技术电子显微镜的直接观察技术第2页，共32页，编辑于2022年，星期一核酸的电子显微镜研究技术核酸的电子显微镜研究技术n核酸的分类核酸的分类：n核小体核小体DNA 与蛋白质聚合一

2、起构成的染色体的单位DNA 双链dsDNA、线性的，超螺旋的，单链 ssDNARNA 单链 ssRNA 、线性的，三叶草形的 双链dsRNA第3页，共32页，编辑于2022年，星期一核酸分子电镜观察的要求核酸分子电镜观察的要求:n核酸分子需要打开超螺旋成为二维伸展的长链核酸分子需要打开超螺旋成为二维伸展的长链;n核酸分子太细需要加粗；核酸分子太细需要加粗；n提高电子反差。提高电子反差。第4页，共32页，编辑于2022年，星期一分子长度测量及计算分子长度测量及计算n对已知的标准分子进行观察和计算，完整的分子对已知的标准分子进行观察和计算，完整的分子的长度应相对一致。的长度应相对一致。n观察观察1

3、00100个以上的分子，拍像记录；个以上的分子，拍像记录；n矫正电镜放大倍数；矫正电镜放大倍数；n测量分子，测量分子，5020050200份单分子；份单分子；n统计学方法计算平均值，作出长度分布图；统计学方法计算平均值，作出长度分布图；n用已知的标准分子进行对照测算用已知的标准分子进行对照测算n经验公式：经验公式：ds 1um=2.07X10ds 1um=2.07X106 6DaDa s s 1um=1.20X10 s s 1um=1.20X106 6DaDa第5页，共32页，编辑于2022年，星期一特点和应用n样品量少；操作简便；制备样品时间短。样品量少；操作简便；制备样品时间短。n适合观察

4、核酸分子的形状和长度、双链或单链适合观察核酸分子的形状和长度、双链或单链的区分、根据长度计算核酸的分子量；的区分、根据长度计算核酸的分子量；n进行异源双链分子分析、分子杂交、转录复合进行异源双链分子分析、分子杂交、转录复合体、核酸蛋白质复合体等研究；体、核酸蛋白质复合体等研究；n基因组织结构、基因片段的缺失、断裂基因、基因组织结构、基因片段的缺失、断裂基因、插入或倒置、基因定位及碱基组成特征等方面插入或倒置、基因定位及碱基组成特征等方面的研究。的研究。第6页，共32页，编辑于2022年，星期一蛋白质单分子展层操作n对核酸样品和试剂的要求：对核酸样品和试剂的要求：1.核酸样品纯度高，去除其他混杂

5、的核酸和蛋白质成份；核酸样品纯度高，去除其他混杂的核酸和蛋白质成份；2.核酸样品为新鲜制备核酸样品为新鲜制备,并尽量保持其长链的完整性并尽量保持其长链的完整性;3.样品浓度在样品浓度在5ugml以上以上;4.样品溶液中无表面活性剂及变性剂等其他污染样品溶液中无表面活性剂及变性剂等其他污染;5.溶液的溶液的PH在在610之间之间;6.展层的碱性蛋白常选择细胞色素展层的碱性蛋白常选择细胞色素C,电泳纯电泳纯;7.所用试剂为分析纯所用试剂为分析纯,器具洁净器具洁净,无去污剂等残留无去污剂等残留;8.制备制备RNA样品的试剂与器具须高温烘烤样品的试剂与器具须高温烘烤,使使RNA酶失活酶失活.第7页，共

6、32页，编辑于2022年，星期一染色与投影n染色染色-增加核酸分子的电子密度增加核酸分子的电子密度 样品展层后样品展层后,粘取至铜网上粘取至铜网上,经过染色和金属投影经过染色和金属投影以增强反差以增强反差.染色液为染色液为12%12%的的PTA,(PTA,(用用90%90%乙乙醇配制醇配制,100ml,100ml染液中含染液中含1ml1ml的浓硫酸的浓硫酸)或醋酸双或醋酸双氧铀氧铀,染色染色10301030秒后秒后.自然晾干自然晾干.n投影投影-使核酸细分子的直径加粗使核酸细分子的直径加粗 染色后的样品以投影角度染色后的样品以投影角度5959,用铂用铂 钯合金进钯合金进行旋转投影行旋转投影,或

7、再加喷一薄层碳膜或再加喷一薄层碳膜,以增加强度以增加强度.第8页，共32页，编辑于2022年，星期一染色与投影n染色染色-增加核酸分子的电子密度增加核酸分子的电子密度 样品展层后样品展层后,粘取至铜网上粘取至铜网上,经过染色和金属投影经过染色和金属投影以增强反差以增强反差.染色液为染色液为12%12%的的PTA,(PTA,(用用90%90%乙乙醇配制醇配制,100ml,100ml染液中含染液中含1ml1ml的浓硫酸的浓硫酸)或醋酸双或醋酸双氧铀氧铀,染色染色10301030秒后秒后.自然晾干自然晾干.n投影投影-使核酸细分子的直径加粗使核酸细分子的直径加粗 染色后的样品以投影角度染色后的样品以

8、投影角度5959,用铂用铂 钯合金进钯合金进行旋转投影行旋转投影,或再加喷一薄层碳膜或再加喷一薄层碳膜,以增加强度以增加强度.第9页，共32页，编辑于2022年，星期一电镜观察要求n染色，投影后，核酸分子的直径从染色，投影后，核酸分子的直径从20A增至增至80100A，故在，故在10万倍以下可以观察到；万倍以下可以观察到；第10页，共32页，编辑于2022年，星期一蛋白质单分子膜展层技术的原理蛋白质单分子膜展层技术的原理n某些碱性蛋白质在低盐溶液或水的表面形成不溶性变性某些碱性蛋白质在低盐溶液或水的表面形成不溶性变性薄膜，单浓度和加到溶液表面的量合适，该膜就展开成薄膜，单浓度和加到溶液表面的量

9、合适，该膜就展开成为单分子层，也就是一个多肽链构成的分子网。如果将为单分子层，也就是一个多肽链构成的分子网。如果将核酸样品混合在溶液中，碱性蛋白上的氨基酸碱性基团核酸样品混合在溶液中，碱性蛋白上的氨基酸碱性基团便与核酸分子链上的酸性基团以水合键结合，核酸分子便与核酸分子链上的酸性基团以水合键结合，核酸分子相对稳定地固着在蛋白质分子上。展层时，核酸分子随相对稳定地固着在蛋白质分子上。展层时，核酸分子随着蛋白质在溶液表面的展开而被拉开伸展为弯曲的二维着蛋白质在溶液表面的展开而被拉开伸展为弯曲的二维结构。由于蛋白质单分子膜作基础，使核酸分子保持完结构。由于蛋白质单分子膜作基础，使核酸分子保持完整性，

10、经捞网，染色，金属投影，电镜观察。整性，经捞网，染色，金属投影，电镜观察。第11页，共32页，编辑于2022年，星期一特点和应用n样品量少；操作简便；制备样品时间短。样品量少；操作简便；制备样品时间短。n适合观察核酸分子的形状和长度、双链或单链适合观察核酸分子的形状和长度、双链或单链的区分、根据长度计算核酸的分子量；的区分、根据长度计算核酸的分子量；n进行异源双链分子分析、分子杂交、转录复合进行异源双链分子分析、分子杂交、转录复合体、核酸蛋白质复合体等研究；体、核酸蛋白质复合体等研究；n基因组织结构、基因片段的缺失、断裂基因、基因组织结构、基因片段的缺失、断裂基因、插入或倒置、基因定位及碱基组

11、成特征等方面插入或倒置、基因定位及碱基组成特征等方面的研究。的研究。第12页，共32页，编辑于2022年，星期一蛋白质单分子展层操作n对核酸样品和试剂的要求：对核酸样品和试剂的要求：1.核酸样品纯度高，去除其他混杂的核酸和蛋白质成份；核酸样品纯度高，去除其他混杂的核酸和蛋白质成份；2.核酸样品为新鲜制备核酸样品为新鲜制备,并尽量保持其长链的完整性并尽量保持其长链的完整性;3.样品浓度在样品浓度在5ugml以上以上;4.样品溶液中无表面活性剂及变性剂等其他污染样品溶液中无表面活性剂及变性剂等其他污染;5.溶液的溶液的PH在在610之间之间;6.展层的碱性蛋白常选择细胞色素展层的碱性蛋白常选择细胞

12、色素C,电泳纯电泳纯;7.所用试剂为分析纯所用试剂为分析纯,器具洁净器具洁净,无去污剂等残留无去污剂等残留;8.制备制备RNA样品的试剂与器具须高温烘烤样品的试剂与器具须高温烘烤,使使RNA酶失活酶失活.第13页，共32页，编辑于2022年，星期一样品配制样品配制n醋酸铵法醋酸铵法:上相液组成上相液组成:醋酸铵醋酸铵 (终浓度终浓度)0.52Mol(PH7.5)核酸样品核酸样品 0.51ugml 总体积总体积50ul 细胞色素细胞色素C 0.050.1mgml下相液下相液:0.050.25M醋酸铵水溶液或双蒸水醋酸铵水溶液或双蒸水甲酰铵法甲酰铵法:上相液组成上相液组成:Tris-Na3EDTA

13、(PH8.5)0.10.01M 核酸样品核酸样品 0.51ugml 细胞色素细胞色素C 0.050.1mgml 甲酰铵甲酰铵 4050%下相液下相液:0.1MTris0.01MNa3EDTA(PH8.5),20%甲酰铵甲酰铵.第14页，共32页，编辑于2022年，星期一第15页，共32页，编辑于2022年，星期一展层方法及步骤展层展层1.样品溶液样品溶液(上相溶液上相溶液)2.展层液展层液(下相溶液下相溶液)3.滑石粉滑石粉 4.载玻片载玻片 5.加样器加样器12345.沾网沾网:将铜网的膜面朝下将铜网的膜面朝下,沾取液面上的样品沾取液面上的样品脱水与染色脱水与染色铜网以铜网以45角插入无水角

14、插入无水乙醇片刻乙醇片刻,进行脱水进行脱水,以以同样方法在同样方法在2%PTA中中染色染色金属投影金属投影:在真空喷镀仪中对在真空喷镀仪中对样品进行重金属旋样品进行重金属旋转投影转投影.第16页，共32页，编辑于2022年，星期一微滴扩散法及单滴展开法适合微量样品的操作适合微量样品的操作,单滴展开法单滴展开法的展层样品液只需的展层样品液只需510ul,操作操作方法与展层方法相同方法与展层方法相同,可用可用16孔酶标孔酶标板代用展层容器板代用展层容器第17页，共32页，编辑于2022年，星期一一步释放法一步释放法 病毒，噬菌体等含核酸的细胞器，不进行提取核酸，利病毒，噬菌体等含核酸的细胞器，不进

15、行提取核酸，利用展层上相用展层上相液液（2M2M醋酸铵），下醋酸铵），下相相液液（0.2M醋酸铵或水溶液）醋酸铵或水溶液）盐浓度的巨大差异，高盐中的病毒遇到低渗溶液而破裂，盐浓度的巨大差异，高盐中的病毒遇到低渗溶液而破裂，核酸分子核酸分子释放，并与细胞色素释放，并与细胞色素CC结合，随着单分子层展开，因结合，随着单分子层展开，因此，释放与展层在一步完成此，释放与展层在一步完成第18页，共32页，编辑于2022年，星期一染色与投影n染色染色-增加核酸分子的电子密度增加核酸分子的电子密度 样品展层后样品展层后,粘取至铜网上粘取至铜网上,经过染色和金属投影经过染色和金属投影以增强反差以增强反差.染色

16、液为染色液为12%12%的的PTA,PTA,(用用90%90%乙乙醇配制醇配制,100,100mlml染液中含染液中含1 1mlml的浓硫酸的浓硫酸)或醋酸双或醋酸双氧铀氧铀,染色染色10301030秒后秒后.自然晾干自然晾干.n投影投影-使核酸细分子的直径加粗使核酸细分子的直径加粗 染色后的样品以投影角度染色后的样品以投影角度5959,用铂用铂 钯合金进钯合金进行旋转投影行旋转投影,或再加喷一薄层碳膜或再加喷一薄层碳膜,以增加强度以增加强度.第19页，共32页，编辑于2022年，星期一电镜观察要求n染色，投影后，核酸分子的直径从染色，投影后，核酸分子的直径从20A增至增至80100A，故在，

17、故在10万倍以下可以观察到；万倍以下可以观察到；n样品不进行投影，只染色，分子的直径大小样品不进行投影，只染色，分子的直径大小改变不大，在视野中很难寻找。改变不大，在视野中很难寻找。第20页，共32页，编辑于2022年，星期一无蛋白展层法n用蛋白质单分子展层技术，核酸分子被细胞用蛋白质单分子展层技术，核酸分子被细胞色素色素CC覆盖，再经染色和投影，分子的直径从覆盖，再经染色和投影，分子的直径从100A100A，不适合观察酶或蛋白质与核酸的复，不适合观察酶或蛋白质与核酸的复合体，与核酸结合的蛋白质组分被细胞色素合体，与核酸结合的蛋白质组分被细胞色素CC覆盖，故建议用无蛋白展层技术。覆盖，故建议用

18、无蛋白展层技术。1.1.BACBAC法法 :用铵盐类低分子化合物氯化烃基二甲基苄基铵用铵盐类低分子化合物氯化烃基二甲基苄基铵代替细胞色素代替细胞色素C,C,能在下相液表面形成一层膜吸附核酸能在下相液表面形成一层膜吸附核酸,投影后投影后.核酸分子直径为核酸分子直径为4060A.4060A.2.2.加染料法加染料法:如溴乙啶、二碘丙啶加到如溴乙啶、二碘丙啶加到DNADNA的溶液中的溶液中,DNA,DNA分子分子吸附到云母片上吸附到云母片上,进行复型、投影进行复型、投影.第21页，共32页，编辑于2022年，星期一RNA的展层技术第22页，共32页，编辑于2022年，星期一第23页，共32页，编辑于

19、2022年，星期一从一种非洲蛙的卵母细胞核中提取的DNA的8个基因片段。第24页，共32页，编辑于2022年，星期一5SDNA5SDNA的部分变性的部分变性第25页，共32页，编辑于2022年，星期一杂交重复分子第26页，共32页，编辑于2022年，星期一X174的DNA,长度约1.8 m的环状DNA(双链DNA)第27页，共32页，编辑于2022年，星期一病毒病毒DNADNA在细菌中复制时，蛋白质结合在病毒在细菌中复制时，蛋白质结合在病毒DNADNA的特别部分，也就是的特别部分，也就是DNADNA复制的开始点。复制的开始点。第28页，共32页，编辑于2022年，星期一能够看到大肠杆菌染色体的二能够看到大肠杆菌染色体的二个片段，下边一个是活动中的。个片段，下边一个是活动中的。可以看到可以看到mRNAmRNA的转录和蛋白的转录和蛋白质的翻译过程。质的翻译过程。第29页，共32页，编辑于2022年，星期一基因上的RNA聚合酶第30页，共32页，编辑于2022年，星期一杂交的杂交的DNADNA分子分子 二条二条DNADNA分子分子 经过变性、退火处理形成缺失环和经过变性、退火处理形成缺失环和 置换置换泡泡第31页，共32页，编辑于2022年，星期一昆虫病毒的核酸分子展层图第32页，共32页，编辑于2022年，星期一