《学士学位毕业答辩》PPT课件.ppt

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1、保加利亚乳杆菌蛋白质提保加利亚乳杆菌蛋白质提取方法研究取方法研究学生姓名：黄学生姓名：黄 宇宇所在院系：食品学院所在院系：食品学院所学专业：食品质量与安全所学专业：食品质量与安全目目 录录前前 言言材材 料料 与与 方方 法法结结 果果 与与 分分 析析实实 验验 结结 论论东北农业大学东北农业大学1234前前 言言东北农业大学东北农业大学 以裂解液为提取介质，分别采用反复冻融、超声破碎以及玻以裂解液为提取介质，分别采用反复冻融、超声破碎以及玻璃珠破碎璃珠破碎3 3种方法提取细菌蛋白质，通过分析细菌破碎程度、蛋白种方法提取细菌蛋白质，通过分析细菌破碎程度、蛋白质质SDS-PAGESDS-PAG

2、E电泳及蛋白质浓度测定，比较各提取方法的效果。电泳及蛋白质浓度测定，比较各提取方法的效果。筛筛选出一种稳定有效的保加利亚乳杆菌的蛋白质提取方法。选出一种稳定有效的保加利亚乳杆菌的蛋白质提取方法。实实 验验 材材 料料东北农业大学东北农业大学菌种菌种设备设备无菌工作台、全自动高压灭菌锅、生物显微镜无菌工作台、全自动高压灭菌锅、生物显微镜 、离、离心机、天平心机、天平 、真空冷冻干燥机、紫外可见分光光度、真空冷冻干燥机、紫外可见分光光度计、超声细胞破碎仪、计、超声细胞破碎仪、pHpH计、微量进样器。计、微量进样器。试剂试剂十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、SDS-PAGE SDS-PAGE 低分子量

3、标准蛋白、低分子量标准蛋白、-巯基乙醇、巯基乙醇、EDTA EDTA、丙烯酰胺、丙烯酰胺、30%30%丙烯酰胺溶液、甘丙烯酰胺溶液、甘氨酸、氨酸、MRSMRS培养基和蛋白质电泳储备液等。培养基和蛋白质电泳储备液等。德氏乳杆菌保加利亚亚种德氏乳杆菌保加利亚亚种(乳品科学教育部重点实验乳品科学教育部重点实验室提供室提供)。实实 验验 方方 法法东北农业大学东北农业大学保加利亚乳杆菌生长曲线的建立保加利亚乳杆菌生长曲线的建立菌株活化、保加利亚乳杆菌生长曲线的建立菌株活化、保加利亚乳杆菌生长曲线的建立无细胞提取物的制备无细胞提取物的制备l超超声声破破碎碎法法：将将细细菌菌沉沉淀淀加加入入裂裂解解液液，

4、在在冰冰浴浴中中用用超超声声波波破破碎碎仪仪破破壁壁。离心，得到无细胞提取物。离心，得到无细胞提取物。l反反复复冻冻融融法法：将将细细菌菌沉沉淀淀加加入入裂裂解解液液，液液氮氮中中反反复复冻冻融融后后，离离心心取取上上清清液备用。液备用。l玻玻璃璃珠珠法法：将将细细菌菌沉沉淀淀加加入入裂裂解解液液，放放入入适适量量酸酸洗洗玻玻璃璃珠珠，冰冰浴浴。高高速速涡旋振荡得到无细胞提取物。涡旋振荡得到无细胞提取物。实实 验验 方方 法法东北农业大学东北农业大学细菌裂解程度观察细菌裂解程度观察涂片涂片晾干晾干固定固定染色染色水洗水洗煤染煤染脱色脱色复染复染蛋白质定量蛋白质定量BCABCA试剂盒试剂盒(碧云

5、天碧云天)测定蛋白质浓度测定蛋白质浓度,根据标准曲线计算出样品的蛋根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。白浓度。SDS-PAGE蛋白电泳蛋白电泳垂垂直直平平板板电电泳泳槽槽的的安安装装分分离离胶胶的的制制备备浓浓缩缩胶胶的的制制备备样样品品处处理理及及加样加样电泳电泳染色及脱色染色及脱色菌菌 株株 活活 化化东北农业大学东北农业大学 11%(w/v)11%(w/v)脱脂乳脱脂乳培养基，培养基，3737，培养，培养36 h36 h后，凝固，革兰氏染色镜后，凝固，革兰氏染色镜检观察结果检观察结果(如图如图)，菌种，菌种纯，活力高，可用于下步纯，活力高，可用于下步实验。实验。保加利亚乳杆菌生长曲线的建立

6、保加利亚乳杆菌生长曲线的建立 东北农业大学东北农业大学 保加利亚乳杆菌在保加利亚乳杆菌在MRSMRS培养基中不同培养时间下的培养基中不同培养时间下的吸光值，并绘制其生长曲线。吸光值，并绘制其生长曲线。结果如图，保加利亚乳杆菌结果如图，保加利亚乳杆菌在在5 h5 h左右进入对数生长期，左右进入对数生长期，在在12 h12 h左右进入对数生长末左右进入对数生长末期，期，16 h16 h左右进入稳定期。左右进入稳定期。细菌破碎程度分析细菌破碎程度分析 东北农业大学东北农业大学超声破碎法处理保加超声破碎法处理保加利亚乳杆菌利亚乳杆菌 玻璃珠法处理保加利亚玻璃珠法处理保加利亚乳杆菌乳杆菌 反复冻融法处理

7、保加反复冻融法处理保加利亚乳杆菌利亚乳杆菌 镜下观察，玻璃珠法中细菌的破碎程度与超声破碎法相近，略低于超声破镜下观察，玻璃珠法中细菌的破碎程度与超声破碎法相近，略低于超声破碎法。仍有少量杆状未被充分破碎。反复冻融法中细菌破碎程度明显低于玻璃碎法。仍有少量杆状未被充分破碎。反复冻融法中细菌破碎程度明显低于玻璃珠法和超声法，有较多菌体仍然呈杆状未破碎，说明反复冻融法强度不够，不珠法和超声法，有较多菌体仍然呈杆状未破碎，说明反复冻融法强度不够，不能使保加利亚乳杆菌充分破碎释放出蛋白质。能使保加利亚乳杆菌充分破碎释放出蛋白质。蛋白质标准曲线蛋白质标准曲线 东北农业大学东北农业大学蛋白质质量浓度测定蛋白

8、质质量浓度测定 东北农业大学东北农业大学测定方法 超声破碎法 反复冻融法玻璃珠法BCA试剂盒法 1.730.220.67不同方法提取的保加利亚乳杆菌蛋白质质量浓度(g/uL)由表可以看出，超声破碎法提取的蛋白质质量浓度最高，其次由表可以看出，超声破碎法提取的蛋白质质量浓度最高，其次为玻璃珠法，反复冻融法提取的蛋白质质量浓度最低，进一步验证为玻璃珠法，反复冻融法提取的蛋白质质量浓度最低，进一步验证了实验结果。了实验结果。蛋白质SDS-PAGE图谱 东北农业大学东北农业大学用超声破碎法提取的3个平行细菌样本的蛋白质电泳图谱，由图可知，显示3个平行样本的蛋白质条带分部基本一致，重复电泳3次的谱图基本

9、相同。蛋白质SDS-PAGE图谱东北农业大学东北农业大学 3 3种方法提取的蛋白种方法提取的蛋白质条带分布和丰度有明显质条带分布和丰度有明显差异，超声破碎法和玻璃差异，超声破碎法和玻璃珠法提取蛋白质条带分布珠法提取蛋白质条带分布基本相同，但超声破碎法基本相同，但超声破碎法提取的蛋白质条带丰度明提取的蛋白质条带丰度明显较高，反复冻融法均最显较高，反复冻融法均最差。实验表明，超声破碎差。实验表明，超声破碎法的蛋白质提取方法最好。法的蛋白质提取方法最好。反复反复冻融冻融玻璃珠玻璃珠 超声法超声法结结 论论东北农业大学东北农业大学细菌破碎程度细菌破碎程度 提取蛋白质质量浓度提取蛋白质质量浓度 蛋白质蛋

10、白质SDS-PAGESDS-PAGE结果结果 超声法可有效提取超声法可有效提取超声法可有效提取超声法可有效提取保加利亚乳杆菌蛋白质，保加利亚乳杆菌蛋白质，保加利亚乳杆菌蛋白质，保加利亚乳杆菌蛋白质，具有较好的稳定性和重具有较好的稳定性和重具有较好的稳定性和重具有较好的稳定性和重复性，且操作简单，不复性，且操作简单，不复性，且操作简单，不复性，且操作简单，不需要特殊的仪器。该方需要特殊的仪器。该方需要特殊的仪器。该方需要特殊的仪器。该方法的建立为进一步开展法的建立为进一步开展法的建立为进一步开展法的建立为进一步开展保加利亚乳杆菌蛋白质保加利亚乳杆菌蛋白质保加利亚乳杆菌蛋白质保加利亚乳杆菌蛋白质的研究奠定了基础，同的研究奠定了基础，同的研究奠定了基础，同的研究奠定了基础，同时也为类似时也为类似时也为类似时也为类似G+G+G+G+细菌的蛋细菌的蛋细菌的蛋细菌的蛋白质提取提供参考。白质提取提供参考。白质提取提供参考。白质提取提供参考。