云南柠檬生产区衰退病检测与分析_董家红.pdf

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1、云南 大学 学报(自然 科学 版),2008,30(S1):73 76CN 53-1045/N ISSN 0258-7971Journal of Yunnan UniversityX云南柠檬生产区衰退病检测与分析董家红1,岳建强2,尹跃艳1,高俊燕2,陈 伟3,张仲凯1(1.云南省农业科学院 生物技术与种质资源研究所,云南省农业生物技术重点实验室,云南 昆明 650223;2.云南省农业科学院 红瑞柠檬研究所,云南 瑞丽 678600;3.云南省农业科学院 园艺作物研究所,云南 昆明 650205)摘要:用柑橘衰退病毒 DAS-ELISA 试剂盒对采自德宏的柠檬样品进行测定.以阳性样品的总 R

2、NA 为模本,用 RT-PCR 扩增柑橘衰退病毒外壳蛋白基因的部分序列并克隆测序.检测结果表明云南瑞丽柠檬受到柑橘衰退病毒的感染.16 个柑橘衰退病毒柠檬分离物与其它柑橘衰退病毒分离物进行了 CP 基因部分序列组群分析,分析表明为害德宏柠檬的柑橘衰退病有 3 种类型,即速衰型、茎陷点型和苗黄型.关键词:柠檬;柑橘衰退病毒;检测;分析中图分类号:S 436.661.1 文献标识码:A 文章编号:0258-7971(2008)S1-0073-04 柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)侵染大多数柑橘属植物,引起衰退病,是柑橘属类水果优质高产的严重威胁 1.CTV 能通过

3、嫁接传播,可随带毒苗木和接穗的调运在柑橘类水果种植区扩散蔓延,通过蚜虫以非循环型半持久性方式传播发生流行 2.CT V 属长线型病毒科(Closterovir-idae)长线型病毒属(Closterovirus),病毒粒子弯曲线状(2 000 11 nm),基因组为单链正义 RNA 病毒,长约 19.3 kb3,4.CT V 存在复杂的株系分化现象,不同的 CT V 分离物能引起茎陷点、速衰、脉明、黄化等多种症状,分析 CTV 分离物的分子进行,明确其优势流行株系是柑橘属类水果产业健康发展的保障.柠檬是亚热带地区种植的柑橘属类水果,在云南德宏,柠檬产业已发展成为一个具有地方特色的经济产业.调查

4、发现,衰退病已成为德宏柠檬产业的主要威胁之一,并有逐年加重的趋势.严格检疫,使用无毒苗木是防治该病害的有效措施.鉴于 RT-PCR 及序列分析的准确性和灵敏性,RT-PCR已被建立来检测和诊断 CTV5,6.本研究应用DAS-ELISA 对云南德宏柠檬上发生的衰退病进行了初步检测,再应用 RT-PCR对 CTV 的 CP 部分序列扩增、克隆、测定,并进行了 CTV 株系变异分析.1 病害调查及样品采集130 个柠檬样品主要采自云南省德宏州瑞丽市.2 DAS-ELISA检测对采集的柠檬病样,用购自 AGDIA 的柑桔速衰病毒 DAS-ELISA 检 测试 剂 盒(Cat.SRA78900)进行了

5、检测,具体检测方法参照试剂盒说明书.3 RT-PCR检测3.1 病叶总 RNA 的提取 取 0.5 g 病样叶片在液氮中研磨成粉末,转入 2.0 mL Eppendorf 管中,分别加入 600 L L 苯酚/氯仿(V(水饱和酚)BV(氯仿)BV(异戊醇)=25B24B1)和 2 RNA 抽提Buffer(20 mmol/L Tris-HCl,pH 7.8;1%SDS;20mmol/L NaCl;5 mmol/L EDTA,pH 7.8),振荡 2X收稿日期:2008-02-18 基金项目:云南省科技攻关计划(农业与社会发展部份)资助(2005NG 02).作者简介:董家红(1974-),男,

6、副研究员,主要从事植物病毒学方面的研究.通讯作者:张仲凯(1966-),男,彝族,研究员,主要从事植物病毒学方面的研究,E-mail:zhongkai99 .min,4 e 下 12000r/min 离心15 min,取上清,加入600 LL 苯酚/氯仿,摇匀,4 e 下 12 000 r/min 离心5min,取上清,加入等体积的 4 moL/L LiCl,摇匀,4 e 沉淀 4 h 以上,4 e 下 12 000 r/min 离心 15min,弃上清液,用 70%乙醇洗 2 次,-20 e 保存备用,或风干后溶于 20 LL ddH2O 中立即使用.3.2 RT-PCR 参照余冬冬等 7并

7、有修改设计CTV 特异性引物 CTV-1:5c-ATGACGAC(G/A)CCACGGGTATAACGTACACT C-3 c,CTV-2:5c-TGACATT(A/G)GTAACTACGAC(A/T)T CA TCAGCCC-3 c,该引物对能扩出 CTV CP 基因部分序列大小为 354 bp 的片段.RT-PCR 采用T aKaRa的 One step RNA PCR(AMV)试剂盒进行.反应体系为 50LL,其中 RNase Free H2O 7LL,10 Buffer 5 LL,25 mmol/L MgCl210 LL,10mmol/L dNT Ps 5 LL,5 u/LL AMV

8、Reverse Tran-scriptase XL 1 LL,40 u/LL RNase Inhibitor 1 LL,5u/LL AMV-Optimized Taq 1 L L,0.1Lg/LL 引物CTV-1和 CTV-2 各 1 L L,模板 RNA 18 LL.反应条件为:50 e 孵育 30 min,94 e 预变性 5 min,PCR 反应分 2 个阶段进行,先进行前 5 个循环(94e 变性40s,55 e 退火40s,72 e 延伸 1min),再进行 30 个循环(94 e 变性 40s,60 e 退火 40 s,72 e延伸 1 min)30 个循环,最后 72 e 延伸

9、10 min.用1%的琼脂糖进行电泳分析.3.3 克隆、测序和序列分析 RT-PCR 扩增经DNA 回收试 剂盒 回收(Sangon),连 接到 载体pMD18-T(T aKaRa)上,转化 大 肠杆 菌(Es-cherichia coli)DH5A感受态细胞,涂布在含有氨苄青霉素的 LB 平板上,筛选阳性克隆.对所筛选的克隆进行双向测序,序列测定在ABI 377 型全自动测序仪上进行.利用 DNAMANVersion 5.0 进行序列处理、分析.多序列比较采用MEGA3.1,进化树构建采用邻近相连法(Neighbor-joining),自展重复 l 000 次.用于序列分析的其它CTV 的1

10、7个分离物分别为:美国佛罗里达速衰型 强 毒 株T 36(U16304)、弱 毒 株T30(AF260651)、美国加利福尼亚茎陷点型强毒株SY568(AF001623)、西 班 牙 茎陷 点 型 强 毒 株T318A(DQ151548)和弱毒株 T385(Y18420)、以色列茎陷点型强毒株 VT(U56902)、日本苗黄型强毒株 NuagA(AB046398)、墨西哥茎陷点型和速衰型强毒株 Mexico-ctv(DQ272579)、韩国 Cheju(AF339088)、葡萄牙 19-21(AF184114)、埃及Qaha(AY340974)、印度 Bangalore(AF501867),克

11、罗地亚茎陷点型 SWO(AY791844),印度茎陷点型 Bangalore(AF501867),中国江 西 JX-1-1(AY953983),中国江西 JX-2-7(AY953980),中国海南 hn-k(AY953982).4 结果与分析4.1 DAS-ELISA 检测 对采自德宏州的 130 个样品进行了CTV 的DAS-ELISA 测定,检测出 33个样品为阳性.4.2 RT-PCR 检测、克隆测序 对 DAS-ELISA检测为阳性的 16 个样品用特异性引物进行 RT-PCR扩增,获得的 CP 基因部分序列,进行序列测定,片 段 均 长 354 bp(图 略).应 用 NCBI 的B

12、LASTn 程序进行同源性检索分析发现,获得的片段为 CTV 外壳蛋白基因的部分序列.4.3 序列分析 对测定的 16 个序列与其他已报道的 17 个 CTV 分离物构建了 CP 基因核苷酸序列的系统发育树(图 1),从图 1 中可见 33 个 CTV分离物可分为 5 个组群.组群间核苷酸同源性在93%94%,组群内同源型高 于 96%.CTV-RL1、CTV-RL2、CTV-RL15、CTV-RL16 与葡萄牙 19-21、韩国的 Cheju 聚类在第 组群.第 组群与在第组群的美国佛罗里达速衰型强毒株T36、埃及强毒株 Qaha、墨西哥茎陷点型和速衰型强毒株 Mexico-ctv 亲缘关系

13、较近,而与其他组群亲缘关系较远.CTV-RL7、CTV-RL8、CT V-RL11 与克罗地亚茎陷点型、印度茎陷点型 Banga-lore、中国江西 JX-1-1 属于第 组群.CTV-RL14与美国弱毒株 T30、西班牙弱毒株 T385 聚类于第组群.其余 8个分离物与西班牙茎陷点型强毒株 T 318A、以色列茎陷点型强毒株 VT、日本苗黄型强毒株 NuagA、中国江西 JX-2-7、中国海南 hn-k 聚于第 组群.74云南大学学报(自然科学版)第 30 卷 图 1 CTV33个分离物 CP 基因部分序列系统发育树(由 500次循环检验的邻近法构建,数值表示支持百分比)Fig.1 Phyl

14、ogenetic tree of CPgene partial nulecotide sequences for 33 CTV 33 isolates(Bootstrap values on the branches repre-sent the percentage of 500 bootstrap replicates)5 讨 论柑橘衰退病是世界上柑橘属植物的主要病害,在我国也普遍发生8.本研究首次对云南瑞丽柠檬感染 CTV 情况及分离物组群特征进行了研究报道.用 DAS-ELISA 和 RT-PCR 对从瑞丽采集的 130 个柠檬样品进行了 CTV 检测,结果表明衰退病已成为云南瑞丽柠檬

15、的主要病毒病害,从随机75第 S1期 董家红等:云南柠檬生产区衰退病检测与分析采集的 130 个样品中检测到 33 为CTV 阳性,检出率为 25.4%.CTV 基因组高度变异,但 CP 基因相对保守,本研究的瑞丽柠檬的 16 个 CTV 分离物与国内外报道的 17 个 CTV 在 CP 基因部分核苷酸序列上同源性达 92%100%,与张建坤等 9报道的 CP全序列核苷酸同源性在 91%100%的结果一致,说明了 CP 基因部分核苷酸序列也可对 CTV 不同分离物进行聚类分析.CTV 株系分化复杂,根据致病性差异,衰退病被分为速衰型、茎陷点型和苗黄型,16个 CTV 瑞丽柠檬分离物的 CP 基

16、因核苷酸部分序列的组群分析表明云南瑞丽柠檬上有这 3种衰退病,其中以茎陷点型为主,16 个分离物中有11个,其次是速衰型,弱毒株型有 1 个分离物.瑞丽柠檬上发生的衰退病复杂,为有效监控防治衰退病的蔓延增加了难度.分析鉴定 CT V 株系的方法有指示植物鉴定、血清学检测、dsRNA 电泳图谱分析 10、限制性片段长度多态性(RFLP)分析 11、单链构象多态性(SSCP)分析12及 RT-PCR 等方法5,6,本研究采用的 CTV 抗血清能检测出所有株系的 CTV,但不能鉴定到病毒的株系.对 CTV CP 基因部分序列检测虽不能像全基因组序列测定那样提供较全面的遗传信息,但相对于上述方法能够提

17、供更多更有用的遗传信息,可以对感染瑞丽柠檬 CTV 的株系进行初步的组群分析,为进一步研究该地区的CTV 及有效防控提供参考.参考文献:1 BAR-JOSEPH M,MARCUS R,LEE RF.The continu-ous challenge of citrus tristeza virus control J.AnnualReview of Phytopathology 1989,27:291-316.2 ROISM EHER C N,BAR-JOEPH M.Aphid transmis-sion of citrus tristeza virus:a review J.Phytophy

18、hc-tica,1987,19:163-167.3 FAUQUET C M,MAYO M A,MANILOFF J,et al.Virus Taxonomy,VIIIth Report of the ICTV M.SanDiego:Elsevier/Academic Press,2005.4 KARAS AV,BOYKOV P,GOWDA S,et al.Completesequence of the citrus tristeza virus RNA genome J.Virology,1995,208:511-520.5 HILF ME,KARASEV A V,ALBIACH-MARTI

19、M R,et al.Two paths of sequence divergence in the Citrustristeza Virus complex J.Phytopathology,1999,89:336-342.6 CEVIK B,PAPPU S S,LEE R F,et a1.Detection anddifferentiation of citrus tristesa closterovirus using apoint mutation andminor sequence differences in theircoat proteingenes J.Phytopatholo

20、gy,1996,86:101.7 余冬冬.柑桔衰退病毒的快速检测技术研究D.武汉:华中农业大学硕士学位论文,2004.8 周常勇.我国柑橘衰退病的发生概况与展望A/第一次植物病毒与病毒病防治学术讨论会论文集C.北京:农业科技出版社,1997.9 张建坤,洪霓,王国平.柑橘速衰病毒 CP 基因的序列变异性分析 J.农业生物技术学报,2006,14(2):259-264.10 MORENO P,GUERRI J,MUNOZ N.Identirfieationof Spanish strains of ccitrus tristeza virus by analysisofdouble-strand

21、e RNA J.Pbytopatholoy,1990,80:477-482.11 GILLINGS M,BROADBENT P,INDSTO J,et al.Characterization of isolates an d sualns of Citrus tris-teza closterovims using restriction an analysis of thecoat proteingene amplified by the polymerase chain re-action J.Journal of Virological Methods,1993,44:305-317.1

22、2 SAMBADE A,LOPEZ C,RUBIO L,et al.Polymor-phism of a specific region ingene p23 of Citrus tristezavirus allows discrimination between mild and severeiso-lates J.Archives of Virology,2003,148:2 325-2340.Detection and analysis of lemon tristeza diseases in YunnanDONG Jia-hong1,YUE Jian-qiang2,YIN Yue-

23、yan1,GAO Jun-yan2,CHEN Wei3,ZHANG Zhong-kai1(1.Yunnan Provincial Key Laboratory of Agr-i Biotechnology,Institute of Biotechnology andGenetic Resources,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming 650223,China;2.Hongrui Institute of Lemon,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Ruili 678600,China;

24、(下转第 80 页)76云南大学学报(自然科学版)第 30 卷参考文献:1 洪健,李德葆,周雪平,等.植物病毒分类图谱 M.北京:科学出版社,2001,156-159.2 Bar-Joseph M,MARCUS R,LEE R F.The continuouschallenge of citrus tristeza virus contro1.Annual ReviewPhytopathology J.1989,27:29-l 3l6.3 周常勇.我国柑橘衰退病的发生概况与展望 A.第一次全国植物病毒与病毒病防治研究学术研讨会论文集C.北京.中国农业科技出版社,北京,1997.4 董家红.小麦

25、黄花叶病毒侵染性 cDNA 克隆及细胞侵染体系的建立 D.北京:中国农业大学,博士论文.2004.5 于嘉林,李大伟,刘仪.甜菜坏死黄脉病毒 75 kDa 通读蛋白基因构建与表达.生物工程学报J.1995,11(1):6-12.6 江世益,张鲁雁.免疫化学 M.上海:上海医科大学出版社,1996.7 王彩霞,王国平,洪霓,等.柑橘衰退病毒多克隆抗体和单克隆抗体的制备及检测效果分析 J.生物工程学报,2006(4):630-634.Cloning and expression of the coat protein gene of thecitrus tristeza virus and pre

26、paration of virus specific antiserumYIN Yue-yan1,2,DONG Jia-hong2,YUE Jian-qiang3,LI Yan-qiong2,CHENG Wei4,ZHANG Zhong-kai2(1.Yunnan Agriculture University,Kunming 650201,China;2.Biotechnology&Genetic Resources Institute,Yunnan Academy of Agriculture Science,Kunming 650223,China;3.Hongrui Lemon Rese

27、arch Institute,Yunnan Academy of Agriculture Science,Ruili 678600,China;4.Horticulture Crop Research Institute,Yunnan Academy of Agriculture Science,Kunming 650205,China)Abstract:T he coat protein gene of citrus lemon isolate was cloned into expression vector pET-28a,andtransferred into E.coli BL21.

28、When induced with IPTG at 28 e for 6h,it can be expressed as fusion proteinwhich molecular weight is 25kDa.T his fusion protein was used as antigen to immue the rabbit and the spec-ificity antibody was obtained.ID-ELISA showed that the antibody had titer of 1:3000 with high specificity todisease pla

29、nt.Key words:citrus tristeza virus;coat protein;prokaryotic expression;antigen*(上接第 76 页)3.Institute of Horticultural Crop.,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming 650205,China)Abstract:Lemon samples were detected using Citrus tristeza virus(CTV)DAS-ELISA kit.Cloning andsequencing of partial

30、 nucleotide sequences of CTV CP gene suggested lemons in Ruili,Yunnan province wereinfected by CTV.Phylogenetic tree of 16 CTV isolates and other CTV isolates indicated that lemon tristezadiseases included three types:quick decline,stem pitting and seelding yellows.Key words:Lemon;Citrus tristeza virus;detection;analysis80云南大学学报(自然科学版)第 30 卷