低频脉冲超声干预膝骨关节炎模型兔关节软骨及滑膜水通.pdf

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1、中国组织工程研究与临床康复 第15卷 第11期 20110312 出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research March 12,2011 Vol.15,No.11 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN:ZLKHAH 1941Department of Orthopedics,the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China Tang Jin,Studying

2、 for masters degree,Physician,Department of Orthopedics,the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China Correspondence to:Chen Shi-rong,Doctor,Associate professor,Department of Orthopedics,the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing

3、400016,China Received:2010-09-12 Accepted:2010-10-25 重庆医科大学附属第二医院骨科，重庆市 400016 唐进，男，1984年生，重庆渝中人，汉族，重庆医科大学在读硕士，住院医师，主要从事骨外科学方面的研究。tangjin1010 通讯作者：陈世荣，博士，副教授，重庆医科大学附属第二医院骨科，重庆市 400016 chensr128 中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:1673-8225(2011)11-01941-04 收稿日期：2010-09-12 修回日期：2010-10-25(20100624015/WLMZ)低频脉冲超声

4、干预膝骨关节炎模型兔关节软骨及滑膜水通道蛋白3的表达 唐 进，黄良库，彭李华，李 东，陈世荣 Effect of low-frequency pulsed ultrasound on expression of articular cartilage and synovial aquaporin 3 in rabbit knee osteoarthritic models Tang Jin,Huang Liang-ku,Peng Li-hua,Li Dong,Chen Shi-rong Abstract BACKGROUND:Previous studies demonstrated that

5、,low-frequency pulsed ultrasound can promote repair of full-thickness articular cartilage defects,delay the progression of knee osteoarthritis.Aquaporin 3 exists on articular cartilage and synovial membrane,which plays an important role in osteoarthritis.OBJECTIVE:To observe the effect of low-freque

6、ncy pulsed ultrasound on the expression of articular cartilage and synovial aquaporin 3 in rabbits with knee osteoarthritis.METHODS:Experimental osteoarthritis was replicated in knees of mature New Zealand rabbits by fixing their left back knees straightenedly in plaster cast.The experimental animal

7、s received IFPUS therapy,of which the intensity was 2.0 W,and the frequency was 1 MHz.The IFPUS therapy was administered once a day and lasted for 15 minutes every time.For the control group,sham US therapy was administered.The immunohistochemistry was used to detect the expression of articular cart

8、ilage and synovial aquaporin 3 at 2,4 and 8 weeks after therapy.RESULTS AND CONCLUSION:With the modeling time prolonged,the expression of articular cartilage and synovial aquaporin 3 in each group were increased.Compared with the control group,the expression of articular cartilage and synovial aquap

9、orin 3 was lower in the experimental group(P 0.01).It is suggested that the low-frequency pulsed ultrasound might reduce the expression of aquaporin 3 in articular cartilage and synovial at protein leve1,relieve joint swelling,reduce the severity of articular cartilage and synovium degeneration,and

10、have a protective effect on cartilage and synovial membrane.Tang J,Huang LK,Peng LH,Li D,Chen SR.Effect of low-frequency pulsed ultrasound on expression of articular cartilage and synovial aquaporin 3 in rabbit knee osteoarthritic models.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu.2011;15(11

11、):1941-1944.http:/ http:/ 摘要 背景：研究表明，低频脉冲超声能促进全层关节软骨缺损修复，延缓实验性早期骨关节炎的病变进展。水通道蛋白 3 存在于关节软骨及滑膜上，并在骨关节炎的发病机制中发挥重要作用。目的：探讨低频脉冲超声对实验性膝骨关节炎兔关节软骨及滑膜水通道蛋白 3 表达的影响。方法：成年新西兰兔左后膝关节用管型石膏固定于伸直位制动 6 周制备实验性兔膝关节骨关节炎模型，造模成功后随机分为两组：实验组予以低频脉冲超声治疗(频率为 1 MHz，功率为 2.0 W)，1 次/d，15 min/次；对照组不接受超声治疗。分别于治疗后 2，4，8 周，采用免疫组织化学方法

12、观察兔关节软骨及滑膜水通道蛋白 3 的表达。结果与结论：随着造模后时间的延长，各组兔关节软骨及滑膜水通道蛋白 3 的表达均有所增加；与对照组比较，实验组兔关节软骨及滑膜水通道蛋白 3 表达明显降低(P 0.01)。说明低频脉冲超声能降低实验性兔膝骨关节炎关节软骨及滑膜水通道蛋白 3 的表达，从而缓解关节肿胀，延缓软骨及滑膜的退变，具有软骨及滑膜保护作用。关键词：低频脉冲超声；骨关节炎；关节软骨；滑膜；水通道蛋白 3 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.11.010 唐进，黄良库，彭李华，李东，陈世荣.低频脉冲超声干预膝骨关节炎模型兔关节软骨及滑膜水通道蛋白 3

13、的表达J.中国组织工程研究与临床康复，2011，15(11):1941-1944.http:/www.crter.org http:/ 0 引言 骨关节炎是以关节软骨代谢紊乱和降解为特征的慢性退行性疾病，病理变化包括软骨细胞水肿及软骨纤维化、关节周围组织炎性水肿及滑膜炎性水肿与增生肥大。前期研究表明，低频脉冲超声能促进全层关节软骨缺损修复，在缺损部位形成透明软骨样修复组织1-2，并能延缓实验性早期骨关节炎的病变进展3。临床研究发现，低频脉冲超声在缓解骨关节炎患者关节肿胀方面具有重要作用。水通道蛋白1、水通道蛋白3存在于关节软骨及滑膜上，并在骨关节炎的发病机制中发挥重要作用4-6，尤其是水通道蛋

14、白3，与关节软骨及滑膜退变、关节腔积液及关节周围组织肿胀密切相关7。鉴于此，实验在建立兔膝骨关节炎模型的基础上，应用低频脉冲超声进行干预，观察低频脉冲超声对骨关节炎兔关节软骨及滑膜水通道蛋白3表达的影响。1 材料和方法 设计：随机对照动物实验。唐进，等.低频脉冲超声干预膝骨关节炎模型兔关节软骨及滑膜水通道蛋白3的表达 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 1942 www.CRTER.org 时间及地点：于2009/2010在重庆医科大学动物实验中心及重庆医科大学附属第二医院病理科完成。材料：实验动物：清洁级健康成年纯种新西兰兔41只，雌雄不拘，体质量2.02.5 kg，由

15、重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(渝)2007-0001。实验中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部颁布的关于善待实验动物的指导性意见的相关要求8。低频脉冲超声治疗仪：又称超声关节炎治疗仪，由重庆融海超声医学工程研究中心有限公司提供。频率为 1 MHz，实验中采用的功率为2.0 W。主要试剂和仪器：方法：预实验：取5只白兔，左膝关节用管型石膏固定于伸直位制动6周，取股骨内髁及胫骨平台软骨和滑膜组织进行苏木精-伊红染色，可见软骨细胞有增生，排列不规则，部分软骨表面有裂隙、破坏、变薄，部分纤维化，软骨及滑膜有炎症细胞浸润，滑膜增生。符合骨关节炎的病理表现，说明造模成功。实验分组

16、、造模与干预：将36只兔左膝关节用管型石膏固定于伸直位制动6周制备实验性兔膝关节骨关节炎模型9。将造模成功的36只兔随机分为2组，每组18只。实验组予以低频脉冲超声治疗(频率为1 MHz，功率为2.0 W)，1次/d，15 min/次，直至实验结束；对照组不接受超声治疗，但操作过程同实验组，只是超声治疗仪不开机，探头无能量输出，整个治疗过程中不制动。低频脉冲超声治疗方法：治疗前均以镇静剂量(5%10%的麻醉剂量)的戊巴比妥钠肌肉注射，待治疗兔活动量明显减少时开始治疗。治疗由2人负责：1人按扶实验兔，1人持超声治疗头治疗。将成年新西兰兔左后膝关节局部脱毛，治疗时将治疗仪的探头紧贴兔膝关节关节间隙

17、部位皮肤，探头和皮肤之间涂以超声耦合剂，治疗过程中不移动探头的位置。对照组膝关节相同部位皮肤涂以超声耦合剂，将治疗仪的探头紧贴该处，进行不开功率源的假治疗。在治疗期间定期将兔左后肢脱毛，以免兔毛影响超声波穿入组织内。免疫组织化学染色：分别于治疗后2，4，8周，每组取6只兔麻醉处死，取股骨内髁及胫骨平台软骨和滑膜组织进行免疫组化检测。标本固定后，行3 m厚组织切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，微波修复抗原5 min，温度：95100。体积分数3%过氧化氢处理10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，正常羊血清孵育15 min封闭抗原以减少非特异性背景，滴加一抗，4 过夜。生物素化二抗孵育20 min

18、，链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物孵育20 min。DAB显色，自来水冲洗终止反应。苏木精复染，脱水，透明，封固。用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。每组选取10张制作优良的水通道蛋白3免疫组织化学染色切片，每张切片随机选取10个高倍视野进行图像分析，各组所选取部位相同。采用北航CM-2000型生物医学图像分析系统测定其染色的平均灰度值。主要观察指标：兔关节软骨及滑膜水通道蛋白3的表达。设计、实施、评估者：实验由通讯作者设计，所有作者参与实施和评估，均受过专业培训。统计学分析：所有计量数据均以x_s表示，采用SPSS 12.0统计软件对计量资料进行方差分析及配对t检验，P 0.05为差异有显著

19、性意义。2 结果 2.1 实验动物数量分析 实验纳入41只新西兰兔，5只用于预实验，由于腹泻死亡4只，其余实验兔健康，一般情况良好。死亡的实验兔剔除，并随机抽出4只兔予以补充，36只造模成功的新西兰兔进入结果分析。2.2 关节软骨及滑膜组织水通道蛋白3的表达 免疫组织化学染色显示水通道蛋白3阳性细胞呈棕黄色，主要位于关节软骨及滑膜细胞的胞膜上，随着造模时间的延长，兔关节软骨及滑膜水通道蛋白3阳性表达逐渐增多。统计学结果显示：与对照组比较，实验组软骨及滑膜细胞水通道蛋白3的表达明显降低(P 0.01)，见表1，2，图1。试剂及仪器 来源 水通道蛋白 3 多克隆抗体 低频脉冲超声治疗仪 北航 CM

20、-2000 型生物医学图像分析系统 DAB 显色试剂盒 美国 SANTAN 公司 重庆融海超声医学工程 研究中心有限公司 北京航空航天大学 北京中杉金桥生物技术 有限公司表 1 关节软骨水通道蛋白 3 的表达 Table 1 Expression of cartilage aquaporin 3 (x_s,n=6,A)aP 0.01,vs.experimental group Time(wk)Experimental group Control group 2 0.573 20.043 1 0.641 70.055 2a 4 0.776 40.059 3 0.872 30.061 3a 8 0

21、.872 60.087 4 0.978 10.093 7a 表 2 滑膜水通道蛋白 3 的表达 Table 2 Expression of synovial aquaporin 3 (x_s,n=6,A)aP 0.01,vs.experimental group Time(wk)Experimental group Control group 2 0.602 20.049 4 0.712 70.063 2a 4 0.801 20.052 3 0.902 50.073 5a 8 0.902 10.043 7 0.997 30.066 8a 唐进，等.低频脉冲超声干预膝骨关节炎模型兔关节软骨及滑膜

22、水通道蛋白3的表达 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN:ZLKHAH 1943www.CRTER.org 3 讨论 实验采用关节制动法建立膝骨关节炎模型，关节制动造成关节退变的机制与制动后软骨压力泵作用的丧失、滑膜向软骨浸润并与软骨粘连、关节囊与肌肉挛缩使关节面压力升高等因素造成软骨营养障碍有关，具有随造模时间延长，软骨退变逐渐加重的特点，是近年来国际上应用较多的一种骨关节炎模型。水通道蛋白分布于水分代谢活跃的器官中，在不同的器官中起重要而特定的作用10-11，主要介导自由水被动跨生物膜转运，对保持细胞内外环境的稳态平衡起重要作用，与水平衡紊乱所造成的一些疾病密

23、切相关。研究表明，水通道蛋白3也表达于关节软骨细胞和滑膜细胞上12。水通道蛋白3对水、尿素和甘油等中性介质是可通透的13。研究发现，随着骨关节炎病情的加重，水通道蛋白3的表达较正常组织明显升高7。关节软骨细胞负责合成软骨细胞外基质并维持其含量14。水占软骨细胞基质总质量的70%以上，并且骨关节炎早期以水增多所致的细胞肿胀为特点。因此软骨和滑膜细胞及其基质的水转运对软骨及滑膜细胞正常和病理状态的维持有非常重要的作用。水的异常转运会导致蛋白多糖的肿胀，从而增加了胶原蛋白网络自身的张力。这种机制降低了细胞外基质抵抗张力和剪切力的能力11。然而，随着骨关节炎的进展，软骨的蛋白聚糖大量减少，水储备能力也

24、随之降低。水通道蛋白3在骨关节炎软骨及滑膜上的过度表达提示其可能在骨关节炎的发病机制中起重要作用。它可能涉及水储备及水平衡失调两方面。软骨及滑膜细胞中的水转运影响软骨及滑膜细胞内外离子平衡及其渗透性，从而导致细胞形态及弹性改变，进而引起关节腔及周围组织水肿，最终影响软骨及滑膜细胞生长及代谢15-16。所以，水通道蛋白3在骨关节炎软骨及滑膜细胞的高水平表达7，提示水通道蛋白3在骨关节炎的发病中起重要作用。其与关节软骨及滑膜退变、关节腔积液及关节周围组织肿胀密切相关。实验结果表明，低频脉冲超声能降低实验性膝骨关节炎兔关节软骨及滑膜水通道蛋白3的表达，进而可缓解关节肿胀，延缓软骨及滑膜的退变，具有软

25、骨及滑膜保护作用。但低频脉冲超声降低兔膝骨关节炎软骨及滑膜水通道蛋白3表达的机制尚不清楚。可能与以下作用有关：由于水通道蛋白3既是通道又是渗透压受体，膝骨关节炎发生后，软骨及滑膜细胞电解质平衡紊乱，软骨及滑膜细胞胞膜上的水通道蛋白3表达增多，细胞内外水平衡紊乱，进一步引起或加重关节软骨及滑膜退变、关节软骨及滑膜炎症、关节腔积液及关节周围组织肿胀。低频脉冲超声可能通过适当的机械作用、空化效应、热效应、化学效应等，直接通过机械作用或引起细胞外基质成分改变，这些刺激或变化作为胞外刺激因素激活了第一信使，经过跨膜信号传导后，激活了第二信使的产生，进一步通过第二信使作用于调节顺式作用元件，通过第二信使基

26、因表达的改变17，影响水通道蛋白3 mRNA的表达，从而诱导了软骨及滑膜细胞胞膜上的水通道蛋白3表达减少，或使其自身发生蛋白磷酸化，Figure 1 Expression of articular cartilage and synovial aquaporin 3(Immunohistochemistry,400)图1 兔关节软骨及滑膜水通道蛋白3的表达(免疫组织化学染色，400)Experimental group Control group Synovial,2 wk Cartilage,2 wk Syno-vial,4 wkCartilage,4 wk Synovial,8 wk Ca

27、rtilage,8 wk 唐进，等.低频脉冲超声干预膝骨关节炎兔关节软骨及滑膜水通道蛋白3的表达 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 1944 www.CRTER.org 导致细胞膜上水通道蛋白结构发生改变，从而降低了细胞膜对水的通透性，导致关节腔积液减少及周围组织水肿减轻。低频脉冲超声可能通过调控胞外刺激因素而使第一信使激活增多，从而使骨关节炎软骨及滑膜水通道蛋白3表达减少。实验主要从水通道蛋白入手，从蛋白质水平证明了低频脉冲超声对骨关节炎的有效保护作用，为骨关节炎的治疗提供了一种新的方案，为阐明低频脉冲超声治疗骨关节炎的作用机制提供了实验依据。但目前对于低频超声下调水

28、通道蛋白3的具体分子生物学靶点及具体途径尚不完全清楚，这种作用的潜在机制目前知之甚少，还有待进一步研究。4 参考文献 1 Cook SD,Salkeld SL,Popich-Patron LS,et alImproved cartilage repair after treatment with low-intensity pulsed ultrasoundClin Orthop Relat Res.2001;(391 Suppl):S231-243.2 Jia XL,Chen WZ,Zhou K,et al.Effects of low-intensity pulsed ultrasound

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30、vial microvessels express aquaporin water channels;upregulation of AQP1 in rheumatoid arthritis.Histol Histopathol.2004;19(2):435-444.5 Mobasheri A,Trujillo E,Bell S,et al.Aquaporin water channels AQP1 and AQP3,are expressed in equine articular chondrocytes.Vet J.2004;168(2):143-150.6 Wang W,Hart PS

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37、2):720-727.17 Boucaud A,Garrigue MA,Machet L,et al.Effect of sonication parameters on transdermal delivery of insulin to hairless rats.J Control Release.2002;81(1-2):113-119.来自本文课题的更多信息-利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。课题的意义：实验在建立兔膝骨关节炎模型的基础上，应用低频脉冲超声进行干预，观察低频脉冲超声对骨关节炎兔关节软骨及滑膜水通道蛋白 3 表达的影响。旨在从缓解关节肿胀方面探讨低频脉冲超声对骨关节炎的保护作用。课题评估的“金标准”：应用免疫组织化学方法检测蛋白的表达可以半定量说明结果，但不如 Western blot 更准确。设计或课题的偏倚与不足：采用 Western blot 等定量方法检测水通道蛋白 3 的表达会更准确。提供临床借鉴的价值：实验主要从水通道蛋白入手，从蛋白质水平证明了低频脉冲超声对骨关节炎的有效保护作用，为骨关节炎的治疗提供了一种新的方案，为阐明低频脉冲超声治疗骨关节炎的作用机制提供了实验依据