RAPD分析野生和栽培柴胡亲缘关系.pdf

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1、一5 7 4 一南京中医药大学学报2 0 1 2 年1 1 月第2 8 卷第6 期J 厥眦C Fn 硝n【r I G【n 椰压R S 兀Y O F 硎疆卜h 6N m 1 2R AP D 分析野生和栽培柴胡亲缘关系张永刚，韩梅+，刘翠晶，杨利民(吉林农业大学中药材学院，吉林长春1 3 0 1 1 8)摘要：目的探讨不同居群北柴胡及其近缘种狭叶柴胡、大叶柴胡亲缘关系，对其进行分子标记鉴定。方法采用R A P D 技术对柴胡属3 个栽培类型和4 个野生居群进行亲缘关系分析。D P sv 7 0 5 软件计算J a c c a r d 遗传距离，U P G M A 方法聚类，构建亲缘关系树系图。结果

2、7 条随机引物共扩增出7 1 条D N A 片段，其中9 1 5 的扩增条带表现出多态性，遗传距离在o 2 3 08 o 9 7 56。聚类分析结果表明利用R A P D 技术可将全部供试材料区分开。结论柴胡属种质资源在分子水平上存在较大差异。R A P D 分子标记法可以鉴定柴胡属种质资源并揭示其亲缘关系，为药材柴胡的栽培育种及资源保护提供重要参考。关键词：北柴胡；亲缘关系；遗传多样性；R A P D中图号：R 2 8 2 5文献标志码：A文章编号：1 6 7 2 一0 4 8 2(2 0 1 2)0 6 一0 5 7 4 一0 3G e n e t i cR e I a t i o n s

3、 h i pA n a l y s i sO fW i I da n dC u l t i v a t e dB H P Z P H r H mw i t hR A P DM a r k e rZ H A N GY o n g g n n g，H A NM e i L I UC u i j 抽g，Y A N GL t m t n(C o Z Z 已g Po 厂吼i 已s PM g d i f i 柙口ZM n P r i n Z 5，厂i Z i nA g r i c“Z“r 日ZU 咒i u P r s i y，C 以咒g f “以，1 3 0 11 8，C i 挖d)A B S T R A

4、 C T：0 B J E C T I V ET oa n a l y z et h eg e n e t i cr e l a t i o n s h i pa m o n gt h ed i f f e r e n tp o p u l a t i o n so f-召“户Z P“r“mf i 咒P 竹s PD C，B s r z o 理e r 帕Z i“mW i l l d a n dB Z o 诧譬i m d 如f“mT u r o z，a n dt od e t e r m i n et h e mi nm o J e c u】a rl e v e l M E T H O D S3c

5、u l t i v a r sa n d4w i l dg r o u p so fB“户Z P“r“，nw e r ec o l l e c t e dt os t u d yt h eg e n e t i cr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e mw i t hR A P Dm a r k e r s T h eJ a c c a r dg e n e t i cd i s t a n c ew a sc a l c u l a t e db y【)P SV 7 0 5；c l u s t e ra n a l y s e sw e r ec

6、 a r r i e do u ta n dt h eg e n e t i cd e n d r o g r a mw a se s t a b l i s h e db ym e a n so fU P G M A R E S U L T S7r a n d o mp r i m e r sa m p l i f i e d65b a n d s(91 5)a m o n gat o t a lo f71t h a tr e v e a l e dp o l y m o 卜p h i s m At o t a lo f71b a n d sw e r ea m p l i f i e d，

7、o fw h i c h91 5 b a n d sw e r ef o u n dt ob ep o l y m o r p h i c G e n e t i cd i s t a n c ew a sf r o mO 2 3 0 8t oO 9 7 5 6 T h er e s u l t so fc l u s t e ra n a l y s i ss h o w e dt h a ta l lt h et e s t e da c c e s s i o n sc o u l db ed i f f e r e n t i a t e db yR A P Dm a r k s C

8、O N C L U S I o NT h e r ea c t u a l l yeX i s t e dm u c hg e n e t i cd i v e r s i t ya m o n gt h eg e r m p l a s mr e s o u r c e so fB“声Z e“r“ma tt h em 0 1 e c u l a rl e v e l R A P DM a r k e r sc a nb eu s e dt od e t e r m i n eg e r m p l a s mr e s o u r c e so fB“户8“r“ma n di n d i c

9、 a t ei t sg e n e t i cr e l a t i o n s h i p，t h e np r o v i d ei m p o r t a n ti n f o r m a t i o nf o rc u l t i v a t i o n，b r e e d i n ga n dc o n s e r v a t i o no fB c 矗i，2 P 咒s 已K E YW o R D S：B“p Z e“r“mf i 挖8 规s 8D C；g e n e t i cr e l a t i o n s h i p；G e n e t i cd i v e r s i t

10、 y；R A P D北柴胡B“声z e 甜r“m 砌i n P 扎s PD C 和狭叶柴胡B s r 2 0，2 P r 咖z i“mW i l l d 为传统常用大宗中药柴胡R a d i xB u p l e u r i 的基原植物 1 。研究表明，北柴胡具有较高柴胡皂苷等药效成分，需求量较大心。为缓解野生北柴胡资源压力，各产地在北柴胡优良品种(类型)选育方面开展了卓有成效的研究工作 3 。吉林省作为北柴胡重要产区，在野生驯化栽培基础上，选育出长叶型、宽叶型、中间型3 个北柴胡新类型 4 。本研究利用R A P D 技术开展北柴胡栽培类型及野生柴胡分子水平分析，探讨其亲缘关系，为柴胡类药材

11、的分子鉴定提供依据。1 材料与方法1 1 供试材料北柴胡栽培类型3 个居群，野生柴胡属4 个居群(表1)。分取健康叶片硅胶干燥，置一7 0 冰箱备用。各样品均由吉林农业大学中药材学院杨利民教授鉴定。收稿日期：2 0 1 2 一0 6 1 l；修稿日期：2 0 1 2 一0 8 2 3基金项目：吉林省科技支撑计划重点项目(2 0 0 8 0 9 0 4)作者简介：张永刚(1 9 7 9 一)，男，内蒙古开鲁人，吉林农业大学讲师。*通信作者：y l m h 7 7 7 1 2 6 c o m万方数据张永刚，等：R A P D 分析野生和栽培柴胡亲缘关系第6 期表1 实验材料及来源样品学名产地北柴胡

12、(长叶型)B“声z P“r“mc i 行P n s P D C 北柴胡(宽叶型)B c 是i 佗明s 8D C 北柴胡(中间型)B 如i 咒e n s PD c 北柴胡B。c 矗i 他g”s eD C j E 柴胡B c i”P”s PD C 大叶柴胡B z o 咒g i m d 妇“mT u r o z狭叶柴胡B s r”P r i 加Z i“mW i l l d 吉林农业大学药植园(栽培)吉林农业大学药植园(栽培)吉林农业大学药植园(栽培)长春市净月潭(野生)吉林市左家(野生)吉林省和龙市(野生)吉林省洮南县(野生)1 2 仪器和试剂A B I9 7 0 0 P C R 扩增仪(A p p

13、 l i e dB i o s y s t e m s，美国)；D Y Y 一8 C 型电泳仪(北京市六一仪器厂)；G I S 一2 0 1 0 凝胶紫外成像系统(T a n o n，中国)；u V 一1 7 0 0紫外可见分光光度计(S h i m a d z u，日本)；D 一3 7 5 2 0型高速离心机(K e n d r o，美国)。U n i v e r s a lG e n o m i cD N AE x t r a c t i o nK i tV e r 3 o、r T a q 酶、1 0 P C Rb u f f e r、d N T PM i x t u r e、D N AM

14、 a r k e rD L 2 0 0 0 等均购自T a K a R a 公司；R A P D 随机引物购自上海生物工程有限公司；E B、T A E 购自北京鼎国生物技术有限责任公司；B i o w e s tA g a r o s e(西班牙)；其他试剂均为分析纯。1 3基因组D N A 提取柴胡叶片各取约1 5 0m g 液氮研磨成粉，U n i v e r s a lG e n o m i eD N AE x t r a c t i o nK i tV e r 3 O 提取基因组D N A。灭菌水稀释基因组D N A 后，U V 一1 7 0 0 紫外可见分光光度计检测D N A 浓度

15、和纯度。分别测波长2 6 0n m 和2 8 0n mO D 值，基因组D N AO D。O D：。值在1 8 1 1 8 5，蛋白质等杂质除去比较干净。并根据O D。值，将各基因组D N A 原液稀释成4 0n g”L，于一2 0 保存备用。1 4 反应体系及扩增程序扩增反应在2 5M L 体积中进行，1 0 P C RB u m一5 7 5 一p L；T a K a R aT a q 酶(5U p L)o 2p L；引物(1 0弘m 0 1 L)0 8p L；模板D N A(4 0n g 弘L)1p L；灭菌蒸馏水1 8 5 肚L。扩增程序为9 4 预变性3m i n，然后进入P C R循

16、环，条件为9 4 变性4 0s，3 7 复性1m i n，7 2 延伸1 5m i n，完成4 0 个循环后，7 2 5m i n 补齐。P C R 扩增产物T A E 缓冲液中2 0 琼脂糖凝胶电泳，D N AM a r k e rD L 2 0 0 0 分子标记，E B 染色检查，凝胶成像系统拍照。1 5 数据处理各样本扩增带按有(1)或无(O)记录，得到原始数据矩阵，计算多态性条带比率，用D P Sv 7 0 5 软件计算各样本间J a c c a r d 遗传距离，按非加权配对算术平均法(U P G M A)建立各样本间聚类图。2结果2 1扩增结果根据实验室具有的R A P D 引物筛

17、选出7 个有效随机引物，共扩增7 1 个D N A 片段，平均每个引物扩增1 0 1 个D N A 片段，7 1 个片段中多态性片段5 6 个，占9 1 5(表2)。扩增结果显示，所用?个随机扩增引物可以将北柴胡(野生及栽培类型)、狭叶柴胡、大叶柴胡等柴胡属植物完全区分开，同时表明柴胡属植物种内及种问遗传背景的复杂性和它们e r(M 9 2+P l u s)2 5 肚L；d N T P(各2 5m m 0 1 L)2之间的共同性。指纹图谱见图1。表2 供试随机引物及扩增结果号一射一。ooooo，万方数据一5 7 6 一熏臣焖MD N AM a r k e r；l 7 代表样品编号图1引物0 P

18、 A 0 1、o P C 0 6、O P C 0 8 的R A P D 扩增圈谱2 2 聚类分析柴胡属7 个样本间J a c c a r d 遗传距离如表3，并以此为依据，构建柴胡7 个样本的聚类图(图2)。统计结果表明，R A P D 分析的J a c c a r d 遗传距离为o 2 3 08 O 9 7 56。北柴胡栽培类型中的宽叶型与吉林市左家野生居群之间的遗传距离最小，为o 2 3 08；大叶柴胡与长春净月潭北柴胡野生居群之间的遗传距离最大，为o 9 7 56。大叶柴胡与其他6个柴胡样本间遗传距离均较大。除大叶柴胡外，6个柴胡样本两两间存在着不同程度的遗传相似性。由聚类图看出，7 个

19、柴胡样本明显划分为3 个类群：类群I 为北柴胡野生和栽培类型，其中北柴胡宽叶型与北柴胡野生居群先聚在一起，然后再与北柴胡长叶型和中间型聚在一起，亲缘关系较近；类群为狭叶柴胡；与其他6 个亲缘关系较远的大叶柴胡单独聚为类群。R A P D 约在0 2 3 时可将7 个柴胡样本区分。表37 个供试样本的R A P D 遗传距离编号12341O20 5 5 77O3O 5 3 06O。5 9 18O4O 5 4 720 3 9 13O 5 5 lOO5O 5 8 820 2 3 08O 5 9 57O 3 8 64O60 9 5 12O 9 7 44O 9 7 220 9 7 56O 9 7 22O

20、7O 6 7 35O 6 2 22O 7 9 59O 6 0 87O 5 9 52O 9 2 86O圈2 柴胡7 个样本聚类树状圈3 讨论本研究从D N A 水平上分析北柴胡野生和栽培居群的遗传多样性，并将北柴胡与其近缘种狭叶柴胡、大叶柴胡进行对比，探讨亲缘关系远近，证明柴胡属种质资源在分子水平上存在较大差异。北柴胡种内存在遗传与环境的交互作用，即表现型=基因型+环境条件。宽叶型与2 个荫蔽条件下生长的野生北柴胡居群更接近，而3 个栽培居群可能由于长期隔离在不同生态环境下，形成基因型的差异，从而导致同种异质。大叶柴胡及狭叶柴胡居群与北柴胡野生及栽培居群遗传背景差异较大，尤其是大叶柴胡很早即被分

21、开，这也表明R A P D 分子标记法用于种间分类差异更明显。柴胡属不同居群在R A P D 带中得到有效标识，其中北柴胡特异带较多，遗传分化较大。R A P D 法可为北柴胡新品种鉴定、筛选、种质培育和野生资源保护提供可靠的依据。另外，有学者对柴胡属属内植物进行分类研究后，建议将大叶柴胡单独列为一个亚属 5 ，本研究也证实大叶柴胡与北柴胡、狭叶柴胡等柴胡属植物的亲缘关系较远。参考文献：1 国家药典委员会中华人民共和国药典：一部 M 北京：中国医药科技出版社，2 0 1 j；2 6 3 2 6 4 P h a r m a c o p o e i ac o m m i s s i o no fp

22、 e o p l F sr e p u b l i co fC h i n a P h a r m a c o p o e i ao fP e o p l e sR e p u b l i co fc h i n a：1 n de d M B e 硒j n g：C h i n aM e d i c a lS c i e n c eP r e s s，2 0 1 0：2 6 3 2 6 4 2 李嫒嫒秦雪梅，王玉庆，等柱前衍生化法评价不同品种和产地柴胡药材和饮片的质量 J 中国中药杂志，2 0 0 8，3 3(3)：2 3 7 2 4 0 L iY Y Q i nX M，w a n gx Q，e

23、 ta 1 D e t e r m i n a t i o no c o n t e n t 缸s a i k o s i d ei nB u p l e u r u mC h i n e n s ef r o md i f f e r e n ts o u r c e s J C h i n aJC h i nM a t e rM e d，2 0 0 8，3 3(3)：2 3 7 2 4 0 3 郑亭亭。隋春，魏建和，等北柴胡二代新品种“中柴2 号”和“中柴3 号”的选育研究】中国中药杂志，2 0 1 0，3 5(1 5)：1 9 3 1 1 9 3 4 Z h e n gT T，S u i

24、C，W e i J H，e ta 1 B r e e d i n go fn e wv a r i e t i e s”Z h o n g c h a iN o 2”a n d”Z h o n g c h a iN o 3”o fB up I e u r u mc h i n e n s e J c h i n aJc h i nM a t e rM e d 2 0 1 0，3 5(1 5)：1 9 3 l 1 9 3 4 4 张永刚，韩梅，韩忠明，等北柴胡不同类型农艺性状比较与品质分析 J 东北林业大学学报，2 0 1 2，4 0(1)：3 6 3 8 7 2 Z h a n gY G，H

25、a nM，H a nZ M，e ta 1 A g r o n o m i ct r a i t sa n dq u a I i t yc h a r a c t e r so fd i f f e r e n tt y p e so fB u p l e u r u mc h i n e n s e J JN o r t h e a s tF o r e s t r yU n i v，2 0 1 2 4 0(2)；3 6 3 8，7 2 5 梁之桃，秦民坚，王峥涛，等巷胡属5 种植物R A P D 分析与分类鉴定口 中草药，2 0 0 2，3 3(1 2)：1 1 1 7 1 1 1 9 L

26、i a n gZ T，Q i nM J，W a n gZ T，e ta 1 1 d e n t i f i c a t i o no fB“户Z F“一r“mp I a n t sb yR A P Dt e c h n o l o g y J C h i nT r a d i tH e r bD r u 酗，(编辑：李伟东)万方数据RAPD分析野生和栽培柴胡亲缘关系RAPD分析野生和栽培柴胡亲缘关系作者：张永刚，韩梅，刘翠晶，杨利民，ZHANG Yong-gang，HAN Mei，LIU Cui-jing，YANG Li-min作者单位：吉林农业大学中药材学院,吉林长春,130118刊名：南京

27、中医药大学学报英文刊名：Journal of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine年，卷(期)：2012,28(6)参考文献(5条)参考文献(5条)1.国家药典委员会 中华人民共和国药典:一部 20102.李媛媛.秦雪梅.王玉庆 柱前衍生化法评价不同品种和产地柴胡药材和饮片的质量期刊论文-中国中药杂志 2008(03)3.郑亭亭.隋春.魏建和 北柴胡二代新品种中柴2号和中柴3号的选育研究期刊论文-中国中药杂志 2010(15)4.张永刚.韩梅.韩忠明 北柴胡不同类型农艺性状比较与品质分析期刊论文-东北林业大学学报 2012(01)5.梁之桃.秦民坚.王峥涛 柴胡属5种植物RAPD分析与分类鉴定期刊论文-中草药 2002(12)本文链接：http:/