饲料中非蛋白氮20090516.ppt

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1、饲料中非蛋白氮的饲料中非蛋白氮的掺假及其检测掺假及其检测 北京北京 2009-5-16杨曙明杨曙明 博士博士国家饲料质量监督检验中心国家饲料质量监督检验中心中国农科院农业质量标准与检测技术研究所中国农科院农业质量标准与检测技术研究所1 1Institute of quality standards and testing technology for agri-food,CAAS.2 2为什么用非蛋白氮掺假？为什么用非蛋白氮掺假？l现有蛋白测定方法的缺陷：现有蛋白测定方法的缺陷：l重要假设为，所有氮来自于蛋白质，蛋重要假设为，所有氮来自于蛋白质，蛋白质含氮量固定。白质含氮量固定。3 3The

2、sample is digested to convert the protein nitrogen The sample is digested to convert the protein nitrogen into ammonium sulfate,which is treated with an alkali,into ammonium sulfate,which is treated with an alkali,thus liberating ammonia.The ammonia is received by an thus liberating ammonia.The ammo

3、nia is received by an acid and quantified through acid and quantified through titrationquantifiedtitrationquantified titration.titration.4 45 56 6lUreaUrealammonium sulfatelBiuret lMelamineMelaminelmelamine formaledehyde resin,Urea-farmaldehyde resinlMixed compounds lNext?曾经用于掺假的物质曾经用于掺假的物质:7 7适宜于掺假

4、的化合物特性：适宜于掺假的化合物特性：l价低价低 l高含氮量高含氮量l没有刺激性气味没有刺激性气味 l对动物无毒对动物无毒/或实际无毒或实际无毒l不溶于水不溶于水/酸酸/碱碱8 8无机氮化合物无机氮化合物 l磷酸氢铵，硫酸铵，碳酸铵等磷酸氢铵，硫酸铵，碳酸铵等l其其N:17.7%，20.6%，21.2%。l价格：价格：300-1000元元/吨吨l问题：已被检测问题：已被检测9 9尿素尿素lN%N%：46.7,46.7,l白色固体，无臭，但有刺激性气味。白色固体，无臭，但有刺激性气味。l熔点熔点:132.7135 Cl由无机物合成的第一个有机物。由无机物合成的第一个有机物。1010尿素加热所生成

5、的物质尿素加热所生成的物质ureaheatingtrichloroisocyanuric acid Cyanuric acid meliminebiuretpolymertriuret1111l2分子尿素在加热至其熔点温度时，分子尿素在加热至其熔点温度时，释放出释放出1个分子氨气，生成个分子氨气，生成1分子缩二分子缩二脲：脲：n2 CO(NH2)2 H2N-CO-NH-CO-NH2+NH3 白色固体，溶于热水，白色固体，溶于热水，在在 186189 C时降解时降解.l液态位蓝色，遇蛋白或多肽时变成紫液态位蓝色，遇蛋白或多肽时变成紫色。色。1212三聚氰酸三聚氰酸l首次合成于首次合成于1829年

6、，通过尿素和氰酸热解重年，通过尿素和氰酸热解重组。目前工业合成路线为组。目前工业合成路线为3个分子尿素热解重个分子尿素热解重组，释放组，释放3个分子氨，生成个分子氨，生成1个分子三聚氰酸。个分子三聚氰酸。反应温度约为反应温度约为 175：3 H2N-CO-NH2 C(O)NH3+3 NH3 l在三聚氰胺粗品结晶过程中，通过水解产生在三聚氰胺粗品结晶过程中，通过水解产生三聚氰酸。三聚氰酸一旦产生将与三聚氰胺三聚氰酸。三聚氰酸一旦产生将与三聚氰胺结合，产生沉淀。结合，产生沉淀。1313l中间产物与杂质：中间产物与杂质：l在脱水的过程中将产生氰酸、缩二脲、缩三脲：在脱水的过程中将产生氰酸、缩二脲、缩

7、三脲：H2N-CO-NH2 HNCO+NH3 H2N-CO-NH2+HNCO H2N-CO-NH-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2+HNCO H2N-CO-NH-CO-NH-CO-NH2 l杂质之一为三聚氰酸一酰胺，判断这是由缩二脲降解重杂质之一为三聚氰酸一酰胺，判断这是由缩二脲降解重组而形成。当反应温度超过组而形成。当反应温度超过190 时时该杂质显著增加：该杂质显著增加：3 H2N-CO-NH-CO-NH2 C(O)2(CNH2)(NH)2N+2 NH3+H2O l当温度在当温度在325 和和 350 时，产生少量三聚氰胺。时，产生少量三聚氰胺。1414三聚氰胺三聚氰胺l目前

8、，工业合成的主要工艺为尿素的热反应：目前，工业合成的主要工艺为尿素的热反应：6(NH2)2CO C3H6N6+6 NH3+3 CO2 l反应过程分两个步骤反应过程分两个步骤.l首先，尿素在吸热反应中降解为氰酸和氨首先，尿素在吸热反应中降解为氰酸和氨:(NH2)2CO HCNO+NH3 l接着，氰酸聚合成三聚氰胺，并放出二氧化碳接着，氰酸聚合成三聚氰胺，并放出二氧化碳:6 HCNO C3H6N6+3 CO2 1515尿素土法加热处理：尿素土法加热处理：l为了避免尿素的刺激性气味和容易为了避免尿素的刺激性气味和容易检测的弊病，掺假者土法对其进行检测的弊病，掺假者土法对其进行加热处理后刺激性气味明显

9、减少，加热处理后刺激性气味明显减少，经检测：经检测：l真蛋白氮真蛋白氮2.56%，总氮，总氮41.32%，尿，尿素素28.8%，三聚氰酸，三聚氰酸55%，三聚氰，三聚氰胺胺4%，未知物？，未知物？1616l添加物经常变化添加物经常变化 l添加混合物添加混合物l难以通过感官来辨别难以通过感官来辨别l掺假者也不知道添加的物质掺假者也不知道添加的物质检测所要面临的问题：检测所要面临的问题：1717如何检测这些掺假如何检测这些掺假 目前饲料中非蛋白氮检测有诸多方目前饲料中非蛋白氮检测有诸多方法，归纳有三类法，归纳有三类:l目标物检测方法目标物检测方法l扣除分析法扣除分析法l蛋白质检测方法蛋白质检测方法

10、1818目标物检测目标物检测:l准确、精确、灵敏、适应性强，准确、精确、灵敏、适应性强，l分析费用昂贵（仪器分析费用昂贵（仪器/耗材），耗材），l明确掺假物后，才能建立方法。明确掺假物后，才能建立方法。l以下以三聚氰胺检测为例说明。以下以三聚氰胺检测为例说明。191920202121222223231 ppb1 ppb的三聚氰胺、三聚氰酸和其内标物的三聚氰胺、三聚氰酸和其内标物13C313C3标记标记的三聚氰胺和三聚氰酸的色谱图（由上至下依次为：三的三聚氰胺和三聚氰酸的色谱图（由上至下依次为：三聚氰酸、聚氰酸、13C313C3标记的三聚氰酸、三聚氰胺、标记的三聚氰酸、三聚氰胺、13C313C3

11、标记标记的三聚氰胺）的三聚氰胺）242413C313C3标记的三聚氰胺标记的三聚氰胺QED-MS/MSQED-MS/MS谱图，右图为三聚氰胺谱图，右图为三聚氰胺QED-QED-MS/MSMS/MS谱图谱图2525谁最高兴？谁最高兴？2626直接测定蛋白法直接测定蛋白法:l不受掺假物影响，不受掺假物影响，l方法相对简便、无需大型精密设备，方法相对简便、无需大型精密设备，l背景影响加大。背景影响加大。2727Estimation of quantities of protein using the dye eosin YA.A.A.A.WaheedWaheed,and P.D.Gupta(1996

12、),and P.D.Gupta(1996)la method for estimating submicrogram quantities of proteins using the dye eosin Y.The increase in sensitivity of this assay is approximately two fold under optimal assay condition.0.01 and 0.05%lThe proteindye complex formation is completed within 2 min and its absorbance is st

13、able up to 60 min with a variation of 4.0%.The interference due to sugars,reducing agents,glycerol and some neutral detergents like Triton X-100,NP-40 and Tween-20 is less than 12%lwhereas Brij-35,ethanol,acetone and chelators like EGTA and EDTA suppress the absorbance by about 1218%.However,basic b

14、uffers like Tris,urea,CHAPS and NaN3 interfere with the formation of the proteindye complex.2828扣除分析法扣除分析法l首先将蛋白氮与非蛋白氮分开，然首先将蛋白氮与非蛋白氮分开，然后测定蛋白氮，则得到非蛋白氮；后测定蛋白氮，则得到非蛋白氮；或测定非蛋白氮，得到蛋白氮。或测定非蛋白氮，得到蛋白氮。l关键：将蛋白氮与非蛋白氮分离。关键：将蛋白氮与非蛋白氮分离。l问题：动植物组织存在非蛋白氮，问题：动植物组织存在非蛋白氮，且含量不定。且含量不定。2929分离区分蛋白氮与尿素及无机氮化合物分离区分蛋白氮与尿素

15、及无机氮化合物l三氯乙酸、钨酸钠、酸性硫酸铜等三氯乙酸、钨酸钠、酸性硫酸铜等溶液用于沉淀蛋白。可以很好地将溶液用于沉淀蛋白。可以很好地将其与蛋白氮分离，测定。其与蛋白氮分离，测定。l尿素及无机氮化合物水溶液中完全尿素及无机氮化合物水溶液中完全溶解。溶解。3030分离区分蛋白氮与三聚氰酸分离区分蛋白氮与三聚氰酸/三聚氰胺三聚氰胺l碱性硫酸铜溶液可以沉淀蛋白，将其碱性硫酸铜溶液可以沉淀蛋白，将其与三聚氰胺、三聚氰酸、尿素、无机与三聚氰胺、三聚氰酸、尿素、无机氮化合物很好分离。氮化合物很好分离。l三聚氰胺、三聚氰酸不溶于水、酸，三聚氰胺、三聚氰酸不溶于水、酸，但溶于碱溶液。但溶于碱溶液。3131Se

16、paration by tricloroacetic acidSampleUrea(g)Melamine(g)Ammonium sulfate(g)True protein%0.462100022.120.47800.02120.0214033.250.45270.02110.0233036.540.4767000.034422.370.48370.024700.032122.220.49480.02500.0286037.40Separation by sodium tungstate 0.453800019.810.462100.02240.045830.160.47850.03410.0

17、211029.230.48000.03510.0351021.580.46510.02450.02450.036119.940.458200.02610.023532.26双汇公司的研究结果双汇公司的研究结果双汇公司的研究结果双汇公司的研究结果3232Separation by copper sulfate in alkaline solution0.459200018.50.45210.03210.0241018.00.47150.03380.02230.021118.40.469000.02100.025417.900.024600.021418.10.46610.031000.03411

18、7.63333A critical study of methods for the determination of nonprotein nitrogen Pamela M.BellPamela M.BelllSome twenty methods for the removal of protein from biological materials were used to prepare the nonprotein nitrogen fraction from skim milk,serum,a water extract of flour,and a water extract

19、of bran.The results obtained by different methods on one solution or the same methods on different solutions were not entirely concordant and showed that NPN fractions obtained in these ways cannot validly be compared.lDialysis or related techniques appeared to achieve separations most closely relat

20、ed to NPN as theoretically defined.lThe binding of amino acids to protein was demonstrated using isotopically labeled amino acids in flour-protein solutions,but it was concluded that reactions of this type would not significantly affect the determination of NPN.3434l如果掺假者使用无法使用沉淀法分如果掺假者使用无法使用沉淀法分离的物质例如脲醛树脂、三聚氰胺离的物质例如脲醛树脂、三聚氰胺甲醛树脂，还能使用扣除法吗？甲醛树脂，还能使用扣除法吗？3535其他间接方法其他间接方法3636373738383939结论：结论：l饲料中非蛋白氮掺假检测研究没有饲料中非蛋白氮掺假检测研究没有穷尽；穷尽；l目前尚没有完美的方法。目前尚没有完美的方法。4040