遗传与分子生物学实验 (37).pdf

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1、脂质体介导的细胞转染实验脂质体介导的细胞转染实验 1 遗传与分子生物学实验遗传与分子生物学实验 常用的哺乳动物细胞基因转移方法常用的哺乳动物细胞基因转移方法 2 大肠杆菌大肠杆菌 酵母细胞酵母细胞 昆虫细胞昆虫细胞 哺乳动物细胞哺乳动物细胞 产率产率（以干重计算）0-60%0-10%0-30 0-1%蛋白酶消化蛋白酶消化 +/+/-+/+/-+糖基化糖基化 -+分泌分泌 +/+/-+折叠折叠 +/+/-+/+/-+磷酸化磷酸化 -+酰基化酰基化 -+酰胺化酰胺化 -+常用的重组蛋白表达系统常用的重组蛋白表达系统 3 常用的基因转移方法常用的基因转移方法 非病毒载体 (化学或物理方法)脂质体转染

2、 磷酸钙转染 电穿孔技术 显微注射。病毒载体 整合型病毒载体 非整合型病毒载体 4 瞬时表达瞬时表达 稳定表达稳定表达 目的目的 快速分析快速分析 获得稳定表达外源基因获得稳定表达外源基因的细胞克隆的细胞克隆 外源外源DNA存在状态存在状态 未整合未整合 整合整合 表达维持时间表达维持时间 随细胞分裂而稀释至丢随细胞分裂而稀释至丢失失，一般可表达一般可表达 4872小时小时 随宿主细胞本身基因组随宿主细胞本身基因组一样复制一样复制，转录转录，翻译翻译，并被稳定遗传并被稳定遗传 筛选办法筛选办法 抗生素抗性抗生素抗性 抗生素抗性抗生素抗性 外源基因在细胞中的表达方式外源基因在细胞中的表达方式 5

3、 脂质体转染的基本原理脂质体转染的基本原理 脂质体（liposome）是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，是一种人工生物膜。可用于外源物质进入细胞的载体。亲水基团亲水基团 疏水基团疏水基团 分散于水相并搅动后，磷脂分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相。而亲水头部暴露在水相。从而形成具有双分子层结构的的封闭囊泡，直径 251000 nm。6 脂质体转染的基本原理脂质体转染的基本原理 阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹，形成DNA/脂复合体脂复合体。该复合体可被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜融合或细胞的内吞作用，也可通过直接渗透作用，将DNA传递进入细

4、胞。7 pcDNA3：目前应用较广的真核质粒表达载体之一。主要特征：用于表达外源基因的CMV启动子；用于筛选的新霉素抗性基因；用于外源基因克隆的多克隆酶切位点（MCS）；提供转录终止信号的牛生长激素(BGH)多腺苷酸化信号序列。衍生出多种不同用途的载体，如含不同附加多肽（His、myc及V5等）以利于蛋白质检测或纯化；含不同选择标记Hyromycin和zeocin等）。哺乳动物表达质粒哺乳动物表达质粒 8 实实 验验 操操 作作 本次实验的目的：本次实验的目的：学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法脂质体介导的转染。9 主要实验材料：293细胞（人肾上皮细胞系）增强型绿色荧光蛋白（EGFP）

5、的哺乳动物细胞表达质粒，pN31-EGFP，报告基因表达质粒 DMEM基础培养基 DMEM完全培养基（10%胎牛血清，链霉素/青霉素）脂质体转染试剂 10 实验步骤：1.1.待转染细胞的准备：待转染细胞的准备：（1）取贴壁接近90%的293细胞，弃去原培养皿中的培养基，加入1mL Versene液洗细胞一次，弃去Versene液，再加入1mL 0.25%Trypsin消化2分钟（37，5%CO2)。（3）加入1 mL的含血清的DMEM完全培养基终止反应。（4）用吹管多次吹吸，使细胞完全分散开。（5）用DMEM完全培养基重悬细胞，计数，在24孔细胞培养板的每个孔中加入2*105个细胞。（6）细胞

6、摇匀后将培养板转入5%CO2培养箱中培养，准备第二天转染。以上所有步骤均在超净工作台中完成，确保进行无菌操作以上所有步骤均在超净工作台中完成，确保进行无菌操作 11 2.脂质体转染：脂质体转染：（1）脂质体/DNA复合物的制备：A.在一无菌0.5 mL离心管离心管A中，将20 L pN31-EGFP质粒（2 g）稀释于80 L无血清DMEM培养基中，轻轻混匀。B.在另一无菌的0.5 mL离心管离心管B中，将20 L 脂质体预稀释液再稀释于80 L无血清DMEM培养基中，轻轻混匀。C.脂质体稀释液（B管）滴加到表达质粒稀释液（A管）中，滴加后轻轻混匀。D室温静置30 min。以上所有步骤均在超净

7、工作台中完成，确保进行无菌操作以上所有步骤均在超净工作台中完成，确保进行无菌操作 12（2）静置期间，将提前铺好293细胞的24孔细胞培养板从CO2 培养箱中取出，在超净工作台中，弃去原培养基，用0.5 mL 基础培养基轻轻洗1次，弃去基础培养基，加入0.5 mL 完全培养基。（3）将步骤（1）C 的200 L 脂质体/表达质粒混合液滴加到培养板的孔中，轻轻摇动以均匀混合。（4）放入37 5%CO2 培养箱培养48小时。以上所有步骤均在超净工作台中完成，确保进行无菌操作以上所有步骤均在超净工作台中完成，确保进行无菌操作 13 3.转染结果观察转染结果观察：在倒置荧光显微镜通过蓝光激发观察EGFP的表达情况，评价转染效率。14 实验结果分析实验结果分析 1记录实验结果，估测转染效率。2简述脂质体转染的基本原理。3在转染实验中为提高转染效率需要注意哪些问题。15