实时荧光定量PCR反应ppt课件.ppt

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1、为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能荧光定量荧光定量PCR技术技术生化教研室生化教研室研究生实验研究生实验为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能一、实验目的一、实验目的掌握荧光定量掌握荧光定量PCR的原理的原理熟悉荧光定量熟悉荧光定量PCR的操作步骤的操作步骤了解荧光定量了解荧光定量PCR的应用的应用为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能二、实验原理二、实验原理ABIPrism7

2、500型荧光定量型荧光定量PCR仪仪7500功能一览：功能一览：绝对定量绝对定量(AbsoluteQuantification)自动计算基线、阈值、自动计算基线、阈值、CT值、浓度、百值、浓度、百分比分比相对定量相对定量(RelativeQuantification)等位基因分型等位基因分型(AllelicDiscrimination)阴阳性鉴定阴阳性鉴定(Plus/MinuswithIPC)为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小

3、学图书室育人功能实时荧光定量实时荧光定量PCR技术原理技术原理聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）可对特定核苷酸可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增，扩增反应结束后，片断进行指数级的扩增，扩增反应结束后，可通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定可通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性分析，也可以通过放射性核素掺入标记性分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量分析。无论定后的光密度扫描来进行定量分析。无论定性还是定量分析，分析的都是性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。终产物。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育

4、人功能实时荧光定量实时荧光定量PCR通过对通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反反应中，引入一种荧光化学物质，随着应中，引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，可以通过荧光强度变化监测产物量

5、的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。从而得到一条荧光扩增曲线图。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能实时荧光定量实时荧光定量PCR技术：技术：荧光阈值和CT值荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的荧

6、光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是的缺省设置是315个循环的荧光信号的标个循环的荧光信号的标准偏差的准偏差的10倍。倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为时所经历的循环数被称为CT值（值（thresholdvalue）为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精

7、神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人

8、功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能三、三、为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义

9、思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发

10、挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能实验内容：定量细菌实验内容：定量细菌16SRNA基因基因引物F：TCCTACGGGAGGCAGCAGT引物R:GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能扩增片段扩增片段447bpStage19530s1cycleStage2955s6045s40cycleStage39515s601min9515s为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的

11、十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能实验分组实验分组按实验台分六组。按实验台分六组。第一组：做阴性对照和样品，各做第一组：做阴性对照和样品，各做2个重复。个重复。第二组：标准曲线一个浓度（第二组：标准曲线一个浓度（10-1），做），做2个重复。个重复。第三组：标准曲线一个浓度（第三组：标准曲线一个浓度（10-2），做），做2个重复。个重复。第四组：标准曲线一个浓度（第四组：标准曲线一个浓度（10-3），做），做2个重复。个重复。第五组：标准曲线一个浓度（第五组：标准曲线一个浓度（10-4），做），做2个重复。个重复。第六组：标准曲线一个浓度（第六组：标准曲线一个浓度（

12、10-5），做），做2个重复。个重复。操作步骤：（见下发的资料页）操作步骤：（见下发的资料页）为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能四、四、为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神

13、,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能五、实时荧光定量五、实时荧光定量PCR技术的应用技术的应用为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能六、思考题六、思考题1.荧光定量荧光定量PCR的原理和应用实的原理和应用实例。例。2.使用使用SYBRGreenI作荧光染料，作荧光染料，如何提高荧光定量如何提高荧光定量PCR结果可靠性结果可靠性？为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能七、实验报告七、实验报告每人写一份实验报告，交至：10号楼10楼1012室包括：目的、原理、操作注意事项、结果、讨论