环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚.ppt

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1、环境样品中环境样品中DNA的分离的分离纯化纯化和和文库文库构建构建制作：林存刚制作：林存刚专业：专业：微生物微生物学号：学号：2003028基因文库基因文库gene library：将一个基因组的DNA用限制酶切割成适当大小的片段，并进行克隆化，包括其中每一种片段的汇总，称为基因文库。为防止用一种限制酶可能切断某个基因，应该用不同限制酶切割建立基因文库。对于一个大的基因组，通常这种基因文库是由霰弹法克隆构建的。根据基因文库的组成，可分为基因组文库和cDNA文库等。基因文库可用于研究基因的结构功能和筛选基因工程的目的基因。分离纯化和文库构建分离纯化和文库构建q从分子水平上研究微生物的意义q分离纯

2、化q文库构建q研究进展 从分子水平上研究微生物的意义从分子水平上研究微生物的意义l 传统微生物学发展l 微生物资源开发利用l 现代生物技术发展 BACK分分离离纯纯化化样品采集和材料准备分离和纯化DNA浓度测定 BACK样品研磨冻融抽提热处理离心抽提去除抑制剂离心TE溶解电洗脱分离纯化酶切要求浓度测定浓度测定粗制DNA浓度测定：已知DNA的酶切产物与待测DNA一起进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，比较荧光亮度，推测DNA的浓度。纯化DNA的浓度测定：利用DyNA Quant 200 荧光仪测定。返回文库构建和分析文库构建和分析v理论基础v实施方法v评估分析 文文库库构构建建EcoRI酶切位点富

3、含A/T(或PstI的酶切位点富含G/C），可以用来酶切建库。载体和酶切片段都用同一种酶酶切后，才会具有互补位点，才能连接。噬菌体菌落更容易保存。实实施施方方法法vEcoRI或PstI对纯化DNA进行酶切v琼脂糖电泳分离酶切产物vDEAE纤维素滤纸回收38kbEcoRI或PstI酶切段v载体处理（经EcoRI或PstI酶切和去磷酸化处理）v连接v连接产物转化大肠杆菌（病毒转染或氯化钙法）v蓝白斑筛选重组子v培养保存 返回策略策略实实施施方方法法评评估估分分析析l对阳性克隆插入片段进行单向测序l去载体部分处理l开放阅读框预测lBLAST同源性检索分析l推测开放阅读框可能编码的功能 BACK开放阅

4、读框开放阅读框 开放阅读框（ORF,open reading frame）是一个没有终止编码的密码子序列。在原核基因中，编码区是一个单独的ORF；而真核基因的编码区通常包含几个不相连的ORF（被非编码序列即内含子所分隔）。每条双链DNA有6个潜在的读框（reading frames）或称相位（phase）：一条链沿5-3方向有3个读框（forward），称为正向读框；则其互补链沿5-3方向的3个读框称为反向读框（reverse）。返回BLAST软件软件BLAST对一条或多条序列,在一个或多个核酸或蛋白序库中进行比对。同时还能发现具有缺口的可能比对上的序列。共有五种：1.（核酸序列到核酸库中的一种查询，库中存在的每条已知序列都将同所查序列作一对一地核酸序列比对。）2.3.4.5.BACK蓝蓝白白筛筛选选相关研究进展相关研究进展通过设计PCR引物直接从环境样品DNA中扩增得到已知蛋白类似物的基因。用分子克隆方法从环境样品中直接得到新酶。本实验方法适用于获得对分子操作敏感且能用来高效建库的基因DNA。可以获得相关的新的外源序列。从基因文库中获得完整基因。基于序列同源性或酶活性筛选方法寻找目的基因。