《流式基础原理》PPT课件.ppt

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1、 BD BD公司生物科学部公司生物科学部流式基础原理流式基础原理流式基本概念流式基本概念BD BiosciencesImmune Function流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念流式细胞术流式细胞术（Flow Flow CytometryCytometry,简称简称FCMFCM）是一种可以快速、是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态流动状态中的中的单单个细胞个细胞的多项物理及生物学特性，加以的多项物理及生物学特性，加以分析分析定量的技术，定量的技术，同时可以对特定群体加以同时可以对特定群体加以分选分选。流式细胞仪流式细胞仪（Fl

2、ow Cytometer）集激光技术、电子物理技术、）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。BD BiosciencesImmune Function流式细胞术的特点流式细胞术的特点检测速度快，分析样本量大：检测速度快，分析样本量大：在极短时间内可分析大量细胞，在极短时间内可分析大量细胞，这是流式不同于其他细胞分这是流式不同于其他细胞分析仪器的主要特点，析仪器的主要特点，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞只要标本中的细胞数量足够

3、，流式细胞仪可以每秒钟成千上万个细胞的速率进行测量，测量的细胞仪可以每秒钟成千上万个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个总数可达数千、数万乃至数百万个 可同时分析单个细胞的多种特征：可同时分析单个细胞的多种特征：使用不同荧光素标记的单克隆抗体或荧光染料对细胞进行多使用不同荧光素标记的单克隆抗体或荧光染料对细胞进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，可获得单细胞的多种信息，色荧光染色，通过流式细胞分析，可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确使细胞亚群的识别、计数更为准确强大的分选功能：强大的分选功能：在分析的同时可以对特定群体加以分选在分析的同时可以对特定群体

4、加以分选BD BiosciencesImmune Function流式检测的样本流式检测的样本可检测的样本种类多样：可检测的样本种类多样：各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等球等New!New!血清、血浆、培养上清、细胞裂解液血清、血浆、培养上清、细胞裂解液样本制备：样本制备：单细胞悬液（天然，机械研磨单细胞悬液（天然，机械研磨/消化）消化）5 510105 51 110107 7cells/mlcells/ml，约，约0.50.51m

5、l1ml，300300目筛网过滤目筛网过滤BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围 细胞结构细胞结构细胞大小细胞大小细胞颗粒度细胞颗粒度细胞表面积细胞表面积核浆比例核浆比例DNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期RNARNA含量含量蛋白质含量蛋白质含量 细胞功能细胞功能细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核的特异性抗原核的特异性抗原细胞活性细胞活性细胞内细胞内/外的细胞因子外的细胞因子激素结合位点、细胞受体激素结合位点、细胞受体蛋白磷酸化蛋白磷酸化pHpH值值钙离子浓度钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位细胞膜电位、线粒体膜电位 流式细胞仪流式细

6、胞仪的检测信号的检测信号BD BiosciencesImmune Function散射光信号散射光信号 当细胞颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束当细胞颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束 方向同轴的称前向角散射光信号（方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称为）。与激光束垂直的称为 侧向角散射光信号（侧向角散射光信号（SSC）。）。BD BiosciencesImmune Function散射光信号散射光信号Right Angle Light Right Angle Light Detector Detector Cell Complexity

7、 Cell ComplexitySSCSSCForward Light Detector Forward Light Detector Cell Surface Area Cell Surface Area FSCFSCIncident Incident Light Light SourceSource=前向角散射光（前向角散射光（FSC,Forward ScatterFSC,Forward Scatter）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 =侧向角散射光（侧向角散射光（SSC,Side ScatterSSC,Side Scatter）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性细胞颗粒度

8、及细胞内细胞器的相对复杂性BD BiosciencesImmune Function前向角散射光信号前向角散射光信号BD BiosciencesImmune Function侧向角散射光信号侧向角散射光信号BD BiosciencesImmune Function外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）（红细胞溶解后）颗粒杂质、气泡颗粒杂质、气泡对检测的影响对检测的影响BD BiosciencesImmune Function荧光信号荧光信号使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表

9、达含量荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量BD BiosciencesImmune Function荧光样本制备荧光样本制备双色直接染色双色直接染色BD BiosciencesImmune Function荧光素的激发和发射光谱荧光素的激发和发射光谱任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱（任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱（nm）激发光谱（激发光谱（Excitation，Ex）：）：是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。吸收光谱。吸收波峰（最大吸收波长）：吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max发

10、射光谱（发射光谱（Emission，Em）：）：是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光发射波峰（最大发射波长）：发射波峰（最大发射波长）：Em-Max荧光素的使用：荧光素的使用：选择正确的激光器选择正确的激光器确定所需探测器（确定所需探测器（PMT）区别区别488nm 520nm异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITC）BD BiosciencesImmune Function光学系统：滤光片光学系统：滤光片如何将一束混合的荧光区分开来，分别进行收集呢？如何将一束混合的荧光区分开来，分别进行收集呢？滤光片置于荧光探测器前，限

11、定其接收的荧光的波长范围滤光片置于荧光探测器前，限定其接收的荧光的波长范围 Longpass(LP)Shortpass(SP)Bandpass(BP)460 500 540460 500 540460 500 540SP 500SP 500LP 500LP 500BP 500/50BP 500/50BD BiosciencesImmune FunctionFACSCalibur光学滤片光学滤片检测器组检测器组（激光器）（激光器）PMT位置位置带通带通/长通透镜长通透镜适用染料适用染料488nm蓝色激光蓝色激光FL1530/30FITCFL2585/42PE,PIFL3670 LPPerCP,P

12、erCP-Cy5.5,PE-Cy7635nm红色激光红色激光FL4661/16APCBD BiosciencesImmune FunctionFluorescence Spectrum Viewer BD BiosciencesImmune FunctionFluorescence Spectrum Viewer BD BiosciencesImmune FunctionFluorescence Spectrum Viewer BD BiosciencesImmune FunctionFluorescence Spectrum Viewer BD BiosciencesImmune Funct

13、ionFluorescence Spectrum Viewer BD BiosciencesImmune FunctionFluorescence Spectrum Viewer BD BiosciencesImmune FunctionFluorescence Spectrum Viewer 流式数据分析形式流式数据分析形式BD BiosciencesImmune Function数据存储数据存储FCS 2.0格式格式常以列表模式（常以列表模式（LIST MODE)：将每个细胞的每个检测参：将每个细胞的每个检测参量依次排列顺序存储量依次排列顺序存储FITC/PE双染样本双染样本BD Bios

14、ciencesImmune FunctionBD BiosciencesImmune Function数据显示数据显示直方图（直方图（Histogram）二维点图（二维点图（Dot Plot）等高线图（等高线图（Contour Plot）密度图（密度图（Density）三维图（三维图（3D Plot）等）等BD BiosciencesImmune Function单参数直方图分析单参数直方图分析l 荧光峰的高低即在纵轴对应的高度反映了？荧光峰的高低即在纵轴对应的高度反映了？l 荧光峰的高低即在纵轴对应的高度反映了具荧光峰的高低即在纵轴对应的高度反映了具有此种荧光强度的细胞在样本中所占比例的相有

15、此种荧光强度的细胞在样本中所占比例的相对多少，而非绝对数目对多少，而非绝对数目BD BiosciencesImmune Function双参数散点图分析双参数散点图分析BD BiosciencesImmune Function等高图和密度图等高图和密度图流式细胞仪的组成流式细胞仪的组成和工作原理和工作原理BD BiosciencesImmune FunctionBD BiosciencesImmune Function液流系统：鞘液包绕着单行排列的细胞依次高速通过流动池，液流系统：鞘液包绕着单行排列的细胞依次高速通过流动池，而激光聚焦于流动池中心的样本流上，随后经检测的样本和而激光聚焦于流动池

16、中心的样本流上，随后经检测的样本和鞘液流向废液桶。鞘液流向废液桶。BD BiosciencesImmune Function光学系统：经荧光染色的细胞在激光的照射下产生散射光学系统：经荧光染色的细胞在激光的照射下产生散射光和荧光信号，同时被前向光电二极管和一组光电倍增光和荧光信号，同时被前向光电二极管和一组光电倍增管（管（PMT）接收，荧光信号经一系列双色性反射镜和带）接收，荧光信号经一系列双色性反射镜和带通或长通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号通或长通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号BD BiosciencesImmune Function电子系统：荧光信号和散射光信号经二极

17、管和电子系统：荧光信号和散射光信号经二极管和PMT接收后接收后可转换为电信号，再通过模可转换为电信号，再通过模/数转换器转换为可被计算机识数转换器转换为可被计算机识别的数字信号，以列表模式存储，最终以图形形式呈现别的数字信号，以列表模式存储，最终以图形形式呈现BD BiosciencesImmune Function流式对照的设置流式对照的设置BD BiosciencesImmune Function荧光染色对照的设置荧光染色对照的设置1阴性对照阴性对照空白对照空白对照自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信

18、号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高自发荧光越强如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高自发荧光越强实验样本实验样本特异荧光，即抗体特异荧光，即抗体F(ab)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光光照发出的荧光非特异荧光，即抗体非特异荧光，即抗体Fc段与细胞表面的段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧受体非特异结合上的荧光染料受光照发

19、出的荧光光染料受光照发出的荧光自发荧光特异荧光非特异荧光自发荧光特异荧光非特异荧光同型对照（自发荧光非特异荧光）同型对照（自发荧光非特异荧光）合适？合适？BD BiosciencesImmune Function同型对照同型对照同型对照（同型对照（Isotype Control）：与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型 （即（即Fc段相同，段相同，F(ab)2段不同）段不同）与染色的单克隆抗体与染色的单克隆抗体 相同种属来源相同种属来源 相同免疫球蛋白及亚型相同免疫球蛋白及亚型 相同荧光素标记相同荧光素标记 相同剂量和浓度相同剂量和浓度

20、 但由未免疫动物血清纯化而来但由未免疫动物血清纯化而来用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景受体而产生的背景染色染色例如，标记例如，标记FITC的单克隆抗体为小鼠的单克隆抗体为小鼠IgG1亚类抗体，标记亚类抗体，标记PE的单的单克隆抗体为小鼠克隆抗体为小鼠IgG2a亚类抗体，同型对照应用相同浓度和剂量的亚类抗体，同型对照应用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化未免疫小鼠血清的纯化IgG1（1）和）和IgG2a（2a），并分别标记），并分别标记FITC和和PEBD BiosciencesImmune Function商业化荧光素的发射

21、光谱商业化荧光素的发射光谱spectral overlapBD BiosciencesImmune FunctionFluorescence Spectrum Viewer spectral overlap如何解决？如何解决？BD BiosciencesImmune Function荧光染色对照的设置荧光染色对照的设置2补偿对照（补偿对照（双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时）荧光补偿（荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠）是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（正荧光素发射光谱重叠（spectral overlap

22、）的过程，即从一）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号已染色样本？已染色样本？真双阳？假双阳？真双阳？假双阳？BD BiosciencesImmune Function荧光染色对照的设置荧光染色对照的设置2补偿对照（补偿对照（双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时）荧光补偿（荧光补偿（compensation）使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行染色抗体分别进行染色 几色分析需要制备几个补偿对照管几色

23、分析需要制备几个补偿对照管分析类型分析类型管管功能功能 加入的抗体加入的抗体双色分析双色分析1Isotype1-FITC2a-PE2Compensation1A-FITC2a-PE3Compensation21-FITCB-PE4Sample1,2A-FITCB-PENo.AntibodyIsotypeMouse anti-human未免疫未免疫Mouse血清纯化而来血清纯化而来1A-FITC（1）1-FITC2B-PE（2a）2a-PEBD BiosciencesImmune Function双色荧双色荧光补偿光补偿1 FL1单染补偿管单染补偿管BD BiosciencesImmune Fu

24、nction双色荧光补偿2 FL2单染补偿管单染补偿管BD BiosciencesImmune Function上机检测上机检测单色单色/双色双色/多色样本多色样本 参数调节参数调节电压电压阈值阈值设门设门补偿补偿 BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的应用领域流式细胞仪的应用领域临床研究临床研究:血液、肿瘤、药理、免疫血液、肿瘤、药理、免疫.生物学研究：生物学研究：遗传、生殖、微生物、细胞生物、毒理、分子生物遗传、生殖、微生物、细胞生物、毒理、分子生物.环境研究：环境研究：海洋生态研究海洋生态研究.制药工业制药工业食品工业食品工业农业畜牧业农业畜牧业BD BiosciencesImmune Function更多资源更多资源谢谢！谢谢！