(2.4.1)--1.4生物素-亲和素系统的原理和应用-生物素-亲和素体系测定雌酮.pdf

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1、2 x I】”芋5 9 rU 革l q j 化学学报、(1、IH【、I l【、I、I L、生物素一亲和素体系测定雌酮王永戎“李元宗“常文保8郭振最5慈云祥。J E t 人?化学与分子 荐学p：、I L 京凡学t-命科学中北京1 0 0 8 7 I j摘要庐刖j+血；f i H 蚩E j 其价站台，f 孙t 雌酬的屯争执味卡l H 此抗味免疫小鼠j 血细胞融合技术制备J-雌雕j j 上L L 克降C 4、蛩地化燕f l I 知，抗体是I 舢】型桐计，子邕为】“0 0 0J I 珂定抗f t J t 的褒和常数为81 I 1，m IH；均享化钓#L 鼠免崆球蚩自J 主竦州过氯化物酶h、l 已的链东

2、相索为衲、记体系通寸竞争扪】制口0 力式测定游离=J t l f l r+结县走J 日：岍龋 1 0 i 0O f f()P g，?l 止l 勺呈线性戈系关键词再i，呈Z 逢 t 鹭跃色j 乏嘎咐寸f 浩，三j 素、链末和熏D e t e r m i n a t i o no fE s t r o n eU s i n gB i o t i n s t r e p t a v i d i nC o m p l e x硒k N G、n g C h e n g“L I i u a n Z o n 9 4C|L 4 N G PT、一B a o“G L OZ h e n U IJ H“C Ig i l

3、 l lX i a t g。|“c t，8q t b m r、ar i dl l v h l“d t A n 8 n n e e n n g K k|P l f“C e，d t r P r k tr 峪tn l f r|H、，I P P 曜1 0 0 8 7 1 1A b s t r a c t：I I u l】t-(E 1h、水h dI o m v i n es(-、n l M Ia l b u m i u(B S A)mg e lac o m p l e t ea n t i g e nf 卜l B S、，I I I I K l【u l a lm l l i t H 小t、I L、I)s

4、D e c i f i I，f n r ：f、a st h e np,a H u e e dI J、【e l lf u s i o n n P IB A L B t )l O I I S t h a dl M，t?1 1i I I I l M I I z c d、i d lE l B、4 u a 、s i sr e v e a l e d1 l a ta n l iE 1M c A h(h M cU)w“ft i l t I 舢l l v 旷，d n di t 1 1 u I e(u l mn e i g h l、“1 6 40 0 0d a h o u sT h ea f f i n i t

5、 x【I l u s l a l l to fE I M(hr e a c t i n gv A t hc o a l c c lc o m p l e t ed 1 1 t i!P、8 二1 护1 w 7 r 1)n 1B i u l i n s l r e p t a v i d i nL o m p l e xw 拈m 一(b rt h ed e t e n l：i n a l f o i lo fF 1T h d l l b r a t i O l l【U P,P【1 ff l P P j 1L-(，、e r e dar g l l g e 1 0 1 0()0 0p g m 1 癌酮

6、cE，r i-体l q l 结合和游离琳j 种形式疗往茁孑掣占绝，、部圩怛不具牛物活件；游离型只占极少：二具自牛物活怍研究表明随着年龄的增长，j-冈1 7 邑的含量降，氐，肌肉含革减少骨质变脆l要r。过嘎q E 胖跟血清巾E，膏量高、睾州含量低有大V、啊影啊其生喧t o 性行为，影响其身体健康，p 一E，等量的尘化可以渗断某些激素依赖型的疾r e e lr f i z v m e l i n k P(1i I|l 1 l n)S O r b e n ta，s d v h I病34 蚰导健康向上R 生活力式川为E，有很强的，L 理功能，监控其在体内的岔量变化意义帚大免疫分析方法。删定E 1 的岔

7、量f JJ _ l I 抗原抗体的特异性相q：作用，口f 以直接删试生物样品避免厂传统的分析方法中耗时费力的舒离步骤单克隆抗体针对于单一抗原决定竣、特异H：强亲干丌性一致，是分析研究：，的物质基础标记物n l：h c n-h P f l【州、t t L t u rh q、m ah i l li f i：2 0)1 0 52 5 1 嘻日 j 朗2 0 0 10 72 0，t 请f 1 印I2 0 0 I 一0 82 1)旧家然p 学基金r2(W)7 5 0 3 1】赞助项 1H、H jM a,2 52 0 0l iJ I l】、2 0，2 0 0 1h,e l,l H l l】口l l2 0，

8、2 0 1；I】蕊 万方数据万方数据6 1 0一5 9 2 C O的多重标记是提高分析灵敏度的有效r 段，其叶1，生物素(B i o t i n)与链亲和索(s t r e p l a、i d i n)的相互作用强烈(亲和常数高达1 0”k m 0 1)，反应专一，结合物柱定、共有4 个结合位电是日前广泛推崇的多重标记的方法之一奉戈台啦r ：】的完令抗原E，一B S A)，通过细胞融合技术，制备r ：，的单克隆抗体(1 r A b)并对其进行r 表征通过EJ 与E I B S A 竞争有限量的、k b 以生物素一羊抗鼠l 舡结合物(B i o t i n I 击)j 链亲和素一辣根过氧化物酶结

9、合物(s A H t l P)作为标记体系，将生物素一亲和素放大体系应用到酶联免疫吸附分析法(E I J S A)中，列游离的：进行r分析测定1 实验部分1 1 仪器与试剂雌酮(E-)购自S i g m a 公司牛血清白蛋白(B S A)哟自I tM 公司，卵白蚩自(O V A)为中国科学院上海()_ 牛物化学研究昕东风，L 化技术公司的产品，生物素一羊抗鼠I 舢复合物(B i o l i n f 如)j 链合亲和索一辣根过氰化物酶(s A H R P)(原液浓度Im mJ)均昀自华美公司，其它试剂均为市售分析纯产品、3，3 5，5 一p qq 1 基联苯胺(r M B)显色液：0 In m

10、l Lp H60 磷酸缓冲液，T N B 储液(3 0m gT M B 溶F5r 1 1 L I)n,t S O 中)和H，0 1(3 0)按1 0 0：1：O1 5 的比例配制而成Y m n a t aM o d e lI P 一4 l 二氧化碳十百温培养箱；B i o R a d l 0 0 0 5 0 0 电泳仪；B i o R a d 3 5 5 0 酶标免疫检测仪I 2 雌酮完全抗原的制备参照I)h a r 等“的方法，按如下反应式从E，的c 3 位偶联载体蛋白，最大限度地暴露其特异性的D环合成雌酮一3 一羧甲基醚(E 一3 一C M I ：)：利用一羟基琥珀酰亚胺和二环己摹碳二亚胺

11、将E l 一3 一f：M E 活化为活泼酯，然后与载体蛋白偶联获得完仝抗原考码斯亮蓝法测定E 1 与B S A 的偶联率为F l：B S A=2 5：1 13E。的单克隆抗体的制备与表征E 一B S A 多次免疫小鼠后经细胞融合、阳性测定、克降筛选，扩大培养，得到稳定分泌E 单克隆抗体的阳性细胞株通过小鼠体内诱，E 的方法，得到大量的腹水经纯化得到单克隆抗体抗体的哑型通过议扩散测定抗体为I 如l；通过十二烷基硫酸钠一聚阿烯酰胺凝胶电泳法(S D S P A C E)测定抗体的分子量：抗体与固定化抗原的亲和常数按照l e a t t v 等“”提供的方法确定14 反应条件的优化1 0 0u k：

12、f L 包被一定浓度的E 一B S A 溶液到酶标板中4 过夜次口，洗板3 次后，加八2 0 0 血明皎溶液3 7 气封闭2h 洗板后，加入1 0 0p 1，E 的岫J 二酶杯板中免疫反应lh 洗板后，每孔加入1：5O o()稀释的I 击一H R P 于3 7 反应lh。加入1 0 0c Ln I B 显色液后，用5()f z L2m o l LH 2 s【k 终L 反J 主用H 沁R a r】酶标仪测定反应混合物在4 5 0n n-处的吸光度确定最住反应条件1 5 工作曲线的制作及交叉反应的考察1 3。,A N H 2N H SD【(0)B S A-H N 一(一LH o包被1 0 0“l

13、最佳浓度的E 1 一B S A 剑酶标板，经封闭洗板后，将5 0p L 系列稀释的E 一溶液(2 0n m I，l O 倍倍比稀释至2p g m L)与5 0,u L 合适浓度的M c A b，同加入包教板中，加八B i o t i n I 出，S AH P,P 后，完成整个E l，1 5 A 测定通过吸光度值与浓度的关系，确定E 洲定的拟合曲线同样，将F 的类似物同抗E，的M c A h 一起反应，做 h 的类似物的竞争抑制曲线考察F l 的类似物存：l 的分析测定中引起的交义反应2 结果与讨论2 1 纯化M c A b 纯度及相对分子量的确定在B i o R a d 电泳槽中，灌人1 2

14、分离胶匾流(，=1 2n n)侦电泳1 0r a i n 后，槽中灌人3 浓缩胶、f c A h 和低分子量标准蛋白(L M w)分别酣成1m n l L 的样品液，每个样品孔加入l Of z J 溶液样品在浓缩胶中恒流(I=2 0n l A)浓缩2 0m i n，然后在分离秽至(。I 十薯 万方数据万方数据币芏诛等：牛物素袁和东作乐洲也雌削曩中廿离】7 0m i n 舒离骰经划定、染色、脱色后分驾站果硼崮I 昕示根据蚩H 顷的柏对迂移率与重U 秀舒子基的关系、测定单抗的桕x _ j 分子 i 为J 6 4(X i O 其中每条直链为3 40 0 0，每条轻链为2 80 0 0：冈巾单抗绎电泳

15、,r f i,呈现出两条清晰的条苇没有其它的杂带m 趣，证明抗体的纯受是n f 靠7 4 二_，2 2 二1：4、f圈1卜j 0 卑克逢抗j 扛白】勺骶舒于量h、照蚩1r 10J j J S,一P c L 电l 永匿F 1 9 1 ，“P 1 一f。irn _ 一 f、h、t l l I】n l nJ“l l l t m t l gh 1、t m n H n jI 7 q 9,l、n n f l、u、一P、C ，r+lI J f nl n】l P-m l r iI h r l f _ _ l P(L l l 盯n f l d l I、；n d _ J J i 小 f 州a J _ f t 一，

16、、j r、h22 亲和常数的确定系列稀仔抗原和抗体通过E L l S 的，法得到j：1 奉日J 稀释曲拨如图二按照B l a i t、等提出的疗法i!-!E In；、1 t、扎与固定化抗味E i 一()、的亲和常数。，匀8 二x 1 0、l。l 退亲釉常数，晚明同芷 t：啄与单拄之问日0 结合能力是很强的同日当包阪E 一阶 口j j 驯j 七的足H 亦为82 1 0“】u 1 这型让明E、的、Ic 与b 的反应是特异睦的。J 载体盏订尢走-j I L 与抗结台稳定与占决定免疫分析的uJ叶睦税鼠源陀的单讥对抗的抗原辣根过氧化物冀H R P，际f 卫的羊抗鼠I 如(I 烈，一H P d)作为：抗接

17、i jB e a t h 建i 口力法确：Z 抗j【古j 定化抗的亲和可数匀69xm I m 一7 试叫机与抗的结台是巷-E j 7 主物奉f,A d 的抗r U I o 一抗稳定结行2 3 最佳包被抗原及M c A b 反应浓度的选择冬2 5I)6 2j 1 二j1 1#l 的h B S A 分圳以lL l【)一一1 儿色被 I 鹬h 板q J 1(X】，t I，孔48m g 1 l J 的jj j l 二比稀 F 再，制机蟓免疫眨苴加八1(M)r t【5U 0 0 侣怖释的B i o l i n I d；眨幢后盯人1 0 0i l L5 0 0 借稀释的A f l R t 完收E IJ 啦

18、尤l 望“i1 0、1 c 扎的稀释度的关乐如图3 比较不l _ i 3 抗1 泉乜破浓度时的最大吸收、啦光度7 尘化范隔的太小结粜丧明包傲浓度为6 25u 7 m L 时的最大呱4 t 一c J 1 峨光度变化最大，结合原料节约的哑o!i J，以6 25“为E，B S A 的包敲浓度址最佳的选择同1 3，j，执稀释曲线的趋势看、当抗体稀释l 芰3 4H j、吸比喧、小台适其变化趋势明显故选择5(3 0 0 侍稀释即浓度为09 67 t g IT I l，作为-厄、1 的F 乏应浓嗖2；J、1、!【f】I(J 1 1 u m】图2 同2 刊计=味包傲j 靠蔓川K 单克陋抗体的稀f 曲线F i

19、g 2、1 一hM r、l lr 川L n i f mL】n t，I i l l,t 1 0 1 5 1I a lJ。m d g e nr n l fP I l I r a t i o n、图34、M 浓，翌包被抗啄时E。t 砷电降扯f 本q l 弼f 刘”tF i g 3m Fd i h a i ，I Il l n J ia n l ir、l t _ n l L、I 小I I t“1h阶、f f f l n i l l i i _ r l i l t：i l l 一2 4B i o t i n l g G 与S A H R P 最佳浓度及反应时间的选择将4、1 司B i nJ i l l I

20、 西稀释崾的啦j I 己J 耍列c 1 _ jm ji 1阿，得到时叫曲线如罔4 从困中u I 看黼弹i 譬一拳l 藿一 万方数据万方数据1 6 1 2、0 15 9 2 0 0为l：1 00 0 0 和1：2 0 0 0 0 时，实验的吸光度值很低不能满足分析测定的需要；对于其它的稀释发，反应一开始吸光度就达到一定的值，说明B i o t i n 与s A 反应很快，当时间超过2 5n f i n 时，反应达到平衡，吸光度进入平台区考虑吸光度的大小及B i o t i n S A 反应的完全性对分析的影响选择B i o t i n I 酊的稀释度为1：50 0 0，与S A H R P 反应

21、时间3 0 f i n 包被1 0 0 止6 2 5n r n L 的E 1 一B S A 到酶标板中顺序加入O9 6”g m LM c A b 和50 0 0 倍稀释的B i o t i n I g G 免疫反应完成后加入2 倍倍比稀释的S A H R P(原浓度2f m 1)，反应3 0r a i n 后，完成E L I S A 制作吸光嚏与S A I I R P 稀释度关系图，结果如图5 昕示选择10 3 0 倍稀释，即1 0J t m l 作为S A H R P 的反应浓度是可取的_“15。0(1 f i。u 6Li oo o叫多0 1 f-r _，、一u 0，I()I2345678l

22、L)P 二(i 忙1(i)=20 0 0n g m L 图5F,A H m，的2 倍倍比稀释降ln g 5 w o l i m es o r l a ld i l u t i o nc u n P0 f 汕一H R P l i iE l I S A2 s 工作曲线的制作系列浓度的F 溶液(2 0r i g m L，1 0 倍倍比稀释至0 2p g m L)与等体积的25 0 0 倍稀释的M e A b(浓度为1 9 2“f r l L)混合后，1 0 0p J f L 加入包被有E，一B S A(】O O l z L f LX6 2，5 n g m L)的酶标扳中，进行竞争免疫反应在最佳条件下

23、，完成E 1 I S A，将吸光度与E 的稀释度作冈得y-0 工作曲线如同6 扶图巾可知：生物素一亲和素放大体系测定：，的线性范同为1 00 0 0 lp g m L，检测限为2 5 r l l L(空白值的2 倍标准偏差)，系内误差(i n t r a a s R S D)为1 2 -*1 2 2，系问误差(i m e r 一“s“R S D)勾05 一1 25 徭国6 物素一束和素复合物E u s 测定游离E 的拟台曲线与际准偏差 l i 线【n=5)n 2 6C a l i b r a t i o na n dR S Do u B e sf o rf r e cE lu h i n gb

24、 i o t i 一s t r e p l a 订d i nu o m p l e xi l lE L I S A(n=5)2 6E l 类似物交叉反应的测定将5 0“L 系列浓度(2 0 0n g m L，1 0 倍倍比稀释至02p g m 1)的E i，雌：醇(k)，雌三醇(E3)和孕酮(P)溶液，同5 0“1 19 2p g m L 的 I r A b 混合然后加入包被有E，一8 S A(1 0 0”L 孔6 2、5 g m L)f L中，在所优化的最佳条件下，完成比色测定，测定各个系列的吸光度值E，类似物的交义反应按蹦种方法给出“。即5 0 一替代法(5 0 一D)和1 0 一误差法(

25、1 0 一E)，并将结果列于F 表1 中从表中的结果可以看出：在研究的几种h 类似物中，P 引起的交叉反应最小。E 2 引起的交叉反应最大，这是因为：与E 2 的结构更类似说明交叉反应与分子结构桁切相关；在低浓度范围内，E 类似物的交叉反臆很小币影响E，的分析洲定”呲、万方数据万方数据表1 生物素一亲和素E 1 I S A 法测定E I 时E 2，n 和P 的交叉反应轰T a b l eIT h e r o n J u t i 1 1 F,o f ：，F、t 1T 1 l lPL p i n gI m，t i l l、I H l l t a、i d i m p l e xi nE L l s、

26、f fFJ【n zn I、r fa 1 l-t P I m IS 0；一I li C I q卜06 q02 r_ 0J q(Jn”，P()0】l J I t 3 结论抗体的特异眭决宣r 免疫分析的特异胜和疋敏夏持异性结台E，的抗体是分析测j 芷b 的物质犟酬我们道择在n 的c 3 处偶联以突出其特异件n，1 3 环台戎丁F，n g 完全抗味E 一B S A I-；，与B s、的：i 台率|I 2 5：l 经过动物免疫细胞融合、克隆筛、?大培养、动物体内诱q 等过程，最肝狱得J E a：晕电降抗体，、1c 扎)并x、j 纯化的抗体进行丁性质表E游离H jE 与也被的，一睽 竞争有限量的、I L、

27、l，。：声B i u l i n I 一，与抗隙抗体复合物免疫聒j、一H R P 与B i o t-1 一l 如生物素结合i5 1 _ 定游离的F”定E jj 0 线陴范丽为1【)0 0)1 0p g m 1 榆删限专二5l om L 空自值的二倍怀琳偏笙)本文为“庆祝邢其毅教授九十华诞暨执教六+年”征文R e f e r e n c e shH k h (H i i 1、n h v l”、i【I _、n【ir H H“1，j r 。，?2 F m、，H u!(小I nJ h n 仙l o，(1 1、。m、-c _|rF I I f I)1 川”一、h m l b iI；Zu I l h n

28、p、r I I j h I hI I【1 1 一#u ix|_、，l f l 哪J1 1JI h-，r mr j1 I,，_ I，二【H m私4“)11F。H d In ij (n j l P n t，f l H(-I I Ih】、1：l“、”，I,，|l t mr1 9 9 7 1，4m-口、I J、，1 1、R：I 川l H I，、一】1、I Ir，卜f，7 t 一，1 9 9 7“J 二n】5I I、岫Hh 1 卯一j、(h、t|1 1 I IC h 一k f 1Fr 心H 一_ 11 I,t【1 9 9 5 0I；、【_ l 一】fh n、l l。m】l。h I、f、I，“l【h hh

29、 t I j mt l q l t“n“n”、I l2 1 1 57l】、k n I l、lI I f 1I I h _、Jk 1I xJ i I PHf 1hJ I fK1 f I,i 一 ，r，-”，r 1 f，。一ji f,，my，1 9 9 7X 2】c X】1Sn 1 1“rh、1 m】t d、h、J I、f|M 小l 珊m纠5】q9、【。1、I m,a l l-r 1 1)，t f、，、|_ h。，R c v m、l W q、“)，1 6 7I f lB i H vJ1 1 f P j mBI r、I A 怖U 一，”，一l“r h n i s1 9 8 7f f 舯17 jI IP r a t t I，f，f，j n 1 9 7 82 4R f、0J jf，、h 万方数据万方数据