基因转染技术.ppt

《基因转染技术.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因转染技术.ppt（41页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、基因转染技术基因转染技术主要内容主要内容概 述1基因运载系统转染的基本过程外源基因的表达和检测2345主 要 应 用一一、概述概述v基因转染的定义：将具生物功能的核酸转移或基因转染的定义：将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。功能。v基因转染技术：将纯化的含有靶基因的质粒基因转染技术：将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。送入细胞内，并在细胞内表达。v基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物

2、等研究。物等研究。基因转染方法基因转染方法 转染转染转染转染 通过生化或者物理方法将目的基因导入真核细胞中。方法分类方法分类 感染感染感染感染 通过病毒介导，用基因组中携带有克隆目的片断的病毒来感染靶细胞。二二 、基因运载系统基因运载系统将某一特定的靶基因传递到靶细 胞，需要应用某一基因运载系统，目前将这一系统概括为两大类：非病毒方法非病毒方法和病毒方法病毒方法（一）非病毒方法（一）非病毒方法分类分类直接注射法 磷酸钙共沉淀法 脂质体染法 显微注射法 受体介导的基因转移 电穿孔法 微粒子轰击法 DEAE-葡聚糖和polybrene聚阳离子法 精子载体法 为什么需要应用转染试剂或其他方法为什么需

3、要应用转染试剂或其他方法?DNA:带负电荷、亲水No ionic interaction+Cationic macromolecule+Cationic ReagentMembrane:anionic and hydrophobic-Heparan Sulfate Proteoglycanes、1、直接注射法、直接注射法 将含有DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起邻近的细胞摄入DNA链进行表达，在肌细胞中，基因表达可持续数月。、2、磷酸钙共沉淀法、磷酸钙共沉淀法 将氯化钙、DNA和磷酸盐缓冲液混合，形成磷酸钙微沉淀，附着于细胞膜并经过细胞内吞作用进入细胞质。该方法的转化效率通常很低。影响因素：影

4、响因素：影响因素：影响因素：（1）DNA-磷酸磷酸钙共沉淀物中共沉淀物中DNA的数量（的数量（2）共沉淀物与）共沉淀物与细胞接触的保温胞接触的保温时间（3）甘油或）甘油或DMSO等促等促进因子作用的持因子作用的持续时间等。等。一般说来，在磷酸钙转染实验中要使用高浓度的一般说来，在磷酸钙转染实验中要使用高浓度的DNA(150ug/ml)。DNA磷酸钙共沉淀物同细胞接触磷酸钙共沉淀物同细胞接触的最适保温时间，因细胞的类型而异。促进因子的最适保温时间，因细胞的类型而异。促进因子通常是在通常是在DNA-磷酸钙共沉淀物被细胞吸收磷酸钙共沉淀物被细胞吸收48小小时之后再加入。时之后再加入。、3、脂质体转染

5、法、脂质体转染法脂质体能在体内或体外提供运载外源性遗传物质进入细胞的载体。制备程序比较简单，可以通过多聚碳酸脂滤膜制备程序比较简单，可以通过多聚碳酸脂滤膜制备程序比较简单，可以通过多聚碳酸脂滤膜制备程序比较简单，可以通过多聚碳酸脂滤膜(polycarbonate filter)(polycarbonate filter)消毒灭菌，用它包装的消毒灭菌，用它包装的消毒灭菌，用它包装的消毒灭菌，用它包装的 DNADNA在在在在4 4下可长期保存不失活性，以及毒性低、包装容下可长期保存不失活性，以及毒性低、包装容下可长期保存不失活性，以及毒性低、包装容下可长期保存不失活性，以及毒性低、包装容量大、可保

6、护量大、可保护量大、可保护量大、可保护DNADNA免受核酸酶的降解作用等等免受核酸酶的降解作用等等免受核酸酶的降解作用等等免受核酸酶的降解作用等等 脂质体介导的基因转移的最大优势在于脂质体介导的基因转移的最大优势在于能在活体内应用。能在活体内应用。、图图1.阳离子脂质体介导的转染、4、受体介导的基因转移、受体介导的基因转移依靠受体介导的细胞内吞途径以转移外源基因。受体介导的基因转移方法是在质粒DNA和某种特异的多肽（配体）之间形成复合体，而这种多肽能为细胞表面的受体所识别。如若将DNA在体内运送至肝内，可以选去唾液酸糖蛋白受体介导系统去唾液酸糖蛋白受体介导系统(肝.实质细胞)和甘露糖受体介导系

7、统甘露糖受体介导系统(肝.非实质细胞)、聚阳离子受体介导的转染过程聚阳离子受体介导的转染过程、5、显微注射法 在显微镜下，将DNA经同细胞玻璃针直接注入细胞，该法适合于各种培养生长的细胞，但需要一定的设备和操作技巧。、6、电穿孔法、电穿孔法 电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。即 利用脉冲场将DNA导入培养细胞。电脉冲和场强的优化电脉冲和场强的优化对于成功的转染很重要。在高压电场的作用下，细胞膜发生临时性破裂形成微孔在高压电场的作用下，细胞膜发生临时性破裂形成微孔 微孔的关闭：一种天然衰减的过程，在微孔的关闭：一种天然衰减的过程，在0下，这种过程会被下，这种过程会被延缓进行。延

8、缓进行。电穿孔之前若用秋水仙酞胺电穿孔之前若用秋水仙酞胺(colcemid)预处理细胞预处理细胞10小时，小时，可提高转化效率可提高转化效率310倍。倍。电穿孔转染效率主要取决于所用的细胞类型。主要征对不适电穿孔转染效率主要取决于所用的细胞类型。主要征对不适合用传统方法转染的细胞合用传统方法转染的细胞v准备DNA:构建提质粒线性化v准备细胞：0.51107v将细胞、DNA加入电极杯v冰上预冷（！）v设置电脉冲参数电脉冲参数电脉冲参数电脉冲参数电击v常温静置v转移细胞至培养皿v2436小时后加筛选药物如：如：G418筛选，45天天细胞开始死亡，胞开始死亡，2周后出周后出现阳阳性性细胞的克隆增殖，

9、胞的克隆增殖，45周后可以挑克隆周后可以挑克隆鉴定定、7、微粒子轰击法（基因枪）、微粒子轰击法（基因枪）在真空状态下，利用粒子加速器将外面包裹了外源基因DNA的金颗粒或钨粉微颗粒进行加速，打入完整的细胞中，从而使外源基因DNA得以在靶细胞中稳定转化并有可能获得表达。实验结果表明，用这种方法靶基因可在皮肤、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等细胞中表达。美國美國Bio-Rad公司公司PDS-1000型型/He基因槍基因槍、8、DEAE-葡聚糖和polybrene聚阳 离子法二乙氨乙基葡聚糖二乙氨乙基葡聚糖(diethyl-aminoethyl-dextran)带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚

10、体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。DEAE葡聚糖仅限于瞬时转染。、9、精子载体法、精子载体法 用精子和NDA（吡啶核甘酸辅酶）-剂孵育，可捕获得DNA。通过受精过程，将外源性基因导入受精卵，大大简化了转基因动物的制备过程。这项转染方法是近年来才发展出来应用在鱼类转殖的最新技术，它最大有点就是简单方便。、病毒作为基因转移是基因递送良好的工病毒作为基因转移是基因递送良好的工具，病毒载体的优点有：（具，病毒载体的优点有：（1）在转化）在转化的细胞中传播重组的的细胞中传播重组的DNA分子作为稳定分子作为稳定的遗传成分；（的

11、遗传成分；（2）可能将有缺陷的或）可能将有缺陷的或突变的基因置于病毒调节信号的控制下突变的基因置于病毒调节信号的控制下以进行研究；（以进行研究；（3）能将克隆的基因作）能将克隆的基因作为病毒微染色体的一部分为病毒微染色体的一部分，并能进行分，并能进行分离；（离；（4）转移效率较高。其主要缺点）转移效率较高。其主要缺点是病毒载体对外源基因的最大容纳量只是病毒载体对外源基因的最大容纳量只有有2500bp。目前常用的病毒载体有下。目前常用的病毒载体有下列几种。列几种。（二）基因转移的病毒的方法（二）基因转移的病毒的方法、1、逆转录病毒载体、逆转录病毒载体 逆转录病毒为RNA病毒，它们的基因组编码在一

12、条单链RNA上，病毒进入细胞通过逆转录作用，病毒RNA即转变为双链DNA分子，DNA进入细胞核并整合在细胞染色体中，这种整合的病毒称为原病毒。在原病毒的两端各有一长末端重复序列（LTR）,LTR内侧还有为复制所必需的其他顺序，包括包装信号。目前常用的逆转病毒载体有CMV和SV。、2、DNA病毒载体病毒载体 主要有腺病毒相关病毒载体腺病毒相关病毒载体，疱疹病毒载体。这一类是利用病毒载体介导的基因转移，以其高转染率和良好的靶向性成为肿瘤基因治疗的有效方法。对对DNA病毒载体的研究是当前基因治疗研究中病毒载体的研究是当前基因治疗研究中的重点领域的重点领域。病毒载体转染过程病毒载体转染过程三、转染的基

13、本过程三、转染的基本过程转染与分析转染与分析靶基因质粒靶基因质粒DNA的准备的准备靶细胞的准备靶细胞的准备 、被用于作靶基因转染的细胞，其生长状被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。态如何，将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。（一）靶细胞的准备（一）靶细胞的准备、用于转染的质粒用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无必须无蛋白质，无RNA和其它化学物质的污染

14、，和其它化学物质的污染，OD260/280比值应在比值应在1.8以上。以上。DNA的的质量和纯度能影响某些细胞系的转染效质量和纯度能影响某些细胞系的转染效率，可以通过率，可以通过CsCl梯度法或标准柱层析梯度法或标准柱层析法进行纯化。法进行纯化。（二）靶基因质粒（二）靶基因质粒DNA的准备的准备、具体的基因转染条件应参考所使用的试具体的基因转染条件应参考所使用的试剂和方法进行优化。靶基因被导入细胞剂和方法进行优化。靶基因被导入细胞后，一般在转染后后，一般在转染后24小时，靶基因即在小时，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，细胞内表达。根据不同的实验目的，48小时后即可进行靶基因表达的检测

15、等实小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。如若建立稳定的细胞系，则可对靶验。如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素（素（hygromycin）和新霉素）和新霉素（neomycin）（三）转染与分析（三）转染与分析、在目前的技术状态下，基因转染效率很难达到100。故必须首先将转导细胞和未转导的细胞加以区分。这样的新技术发展很快，常用的转导细胞筛选方法：1.利用基因表达产物筛选法 （1）标记基因筛选法

16、在载体上引入一个标记基因，或同时导入标记基因，在转染后的适当时间选用合适剂量的选择培养基，筛选标记基因表型，那些已导入外源基因的细胞将存活下来。、（2）基因缺陷型受体细胞的选择性 以基因缺陷型细胞作为靶细胞，将正常基因导入基因缺陷型靶细胞后，使用选择性培养基进行筛选。（3）基因共转染技术 将目的基因表达载体DNA和标记基因表达载体DNA混合后共同转移到靶细胞中，分别使用标记基因和目的基因对应的选择剂进行两次筛选，最后得到复合转导的转化子。、2.分子生物学方法外源基因是否真的转入靶细胞必须用分子杂交方法进行证实。常用的方法有原位杂交、Southern杂交。其中主要问题是探针的选择。、在筛选出转化

17、子后还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达状况。其中包括对目的基因和标记基因的鉴定。常用方法有原位杂交、Northern杂交、免疫组织化学染色等，原位及Northern杂交是检测外源基因转录出的mRNA,后者则是检测外源基因翻译出的蛋白质。四、外源基因的表达和检测四、外源基因的表达和检测、1、用于建造疾病的动物模型和药物筛选模型2、用于基因治疗3、用于异种器官移植4、用于改良动植物品种和生产性能5、用于生产药用蛋白和保健蛋白6、用于生产人抗体五、主要应用五、主要应用5.各种转染方法比较转染方法原理应用特点电穿孔法 细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中，将诱导沿细胞膜的电压差异，这种电压差异会导致细胞膜暂

18、时穿孔。稳定转染瞬时性转染所有细胞 适用细胞广，但细胞致死率高，DNA和细胞用量大，需根据不同细胞类型优化实验条件 显微注射法或基因枪法 使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核；基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。稳定转染瞬时性转染所有细胞 适用细胞广，细胞致死率高，操作复杂病毒介导法 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中稳定转染瞬时转染特定宿主细胞 可用于难转染的细胞；但携带基因不能太大；需考虑安全因素磷酸钙法 磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞。稳定转染瞬时性转染 不适用于原代细胞；操作较简便但重复性差 细胞毒性较大；效率较低DEAE葡

19、聚糖转染法 抑制核酸酶 内吞作用瞬时表达 操作相对简单；但需高浓度DNA；DEAE葡聚糖浓度 ；温育时间阳离子脂质体法 带正电的脂质体和核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞。稳定转染瞬时性转染 适用细胞广；转染效率高，重复性好但转染时需除血清和抗生素；相对具有一定毒性阳离子聚合物 阳离子聚合物与核酸等形成稳定的复合物被细胞内吞稳定转染瞬时性转染 为最新一代的转染试剂，具有操作简单；稳定性好；转染效率高，细胞毒性低的特点；通过调节聚合物/DNA比例优化实验。5.各种转染方法比较转染方法转染方法转染方法转染方法原理原理原理原理应用应用应用应用特点特点特点特点电穿孔法电穿孔法 细胞暴露在短暂的高

20、场强电脉冲细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中，将诱导沿细胞膜的电压差异，这中，将诱导沿细胞膜的电压差异，这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。稳定转染稳定转染瞬时性转染瞬时性转染所有细胞所有细胞 适用细胞广，但细胞致死率高，适用细胞广，但细胞致死率高，DNA和细胞用量大，和细胞用量大，需需根据不同根据不同细胞类型细胞类型优化实验条件优化实验条件 显微注射显微注射法或基因枪法或基因枪法法 使用一根细针头将使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核；基或蛋白直接转入细胞质或细胞核；基因枪使用高压因枪使用高压microprojectile将大分将大分子导入细胞

21、。子导入细胞。稳定转染稳定转染瞬时性转染瞬时性转染所有细胞所有细胞 适用细胞广，细胞致死率高，适用细胞广，细胞致死率高，操作复杂操作复杂病毒介导法病毒介导法 通过侵染宿主细胞将外源基因整通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中合到染色体中稳定转染稳定转染瞬时转染瞬时转染特定宿主细胞特定宿主细胞 可用于难转染的细胞；但携可用于难转染的细胞；但携带基因不能太大；需考虑安全因带基因不能太大；需考虑安全因素素磷酸钙法磷酸钙法 磷酸钙磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜复合物吸附细胞膜被细胞内吞。被细胞内吞。稳定转染稳定转染瞬时性转染瞬时性转染 不适用于原代细胞；不适用于原代细胞；操作较简便但操作较简便但重复性

22、差重复性差 细胞毒性较大；效率较低细胞毒性较大；效率较低DEAE葡聚糖葡聚糖转染法转染法 抑制核酸酶抑制核酸酶 内吞作用内吞作用瞬时表达瞬时表达 操作相对简单；但需高浓度操作相对简单；但需高浓度DNA；DEAE葡聚糖浓度葡聚糖浓度 ；温育时间；温育时间阳离子脂质阳离子脂质体法体法 带正电的脂质体和核酸带负电的带正电的脂质体和核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞。磷酸基团形成复合物被细胞内吞。稳定转染稳定转染瞬时性转染瞬时性转染 适用细胞广；转染效率高，适用细胞广；转染效率高，重复性好但转染时需除血清和抗重复性好但转染时需除血清和抗生素；相对具有一定毒性生素；相对具有一定毒性阳离子聚合阳离子聚合物物 阳离子聚合物与核酸等形成稳定阳离子聚合物与核酸等形成稳定的复合物被细胞内吞的复合物被细胞内吞稳定转染稳定转染瞬时性转染瞬时性转染 为最新一代的转染试剂，具为最新一代的转染试剂，具有操作简单；稳定性好；转染效有操作简单；稳定性好；转染效率高，细胞毒性低的特点；通过率高，细胞毒性低的特点；通过调节聚合物调节聚合物/DNA比例优化实验。比例优化实验。