SN∕T 3579-2013 大豆疫病菌活性检测方法(出入境检验检疫).pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3579-2013 大豆疫霉病菌活性检测方法Viability detecion of PhytophthorsOJe Kaufmann&Gerdemann 2013-03-01发布2013-09-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T 3579-2013 目。昌本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草o请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。本标准1111叶家认111:认可监督怦理委员会捉11并川门。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、广东

2、省微生物研究所、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:章桂明、程颖慧、王颖、陈枝楠、仲建忠、李秋枫、向才玉、代京莎、汪莹、陈洪俊。SN/T 3579-2013 大豆疫霉病菌活性检测方法1 范围本标准规定了应用激光扫描共聚焦显微镜对大豆疫霉病菌(Phyt吵hthorasojae Kaufmann&-Gerdemann)的活性进行检测的方法O本书J*适川JT大时及土壤rlr抗们的大日疫霉病菌的沾性检测。2 原理应用荧光染料对大豆疫霉病菌的卵子包子进行染色处理，根据大豆疫霉病菌不具活性的卵子包子染色后卵质体断裂、边集，呈致密浓染绿色和具有活性的卵子包子染色后卵质体呈均匀绿色的染色效果差异，运用激

3、光扫描共聚焦显微镜对病菌于包子进行检测，分析其活性情况。3 仪器用具和试剂3.1 仪器用具激光扫描共聚焦显微镜、显微镜、高压灭菌锅、生物安全柜、生化培养箱、冰箱C3.2 试剂四丫定橙、磷酸缓冲液(PBS，O.lmol/f1-L,pH7.0)、水琼脂培养基O4 活性检验方法4.1 病原菌子包子获取在显微镜下，将发现并鉴定为大豆疫霉病菌卵于包子挑到灭菌水中，配制成浓度大于1个子包子/L的子包子悬浮液，镜检，备用O4.2 子包子染色使用质量浓度为100f1-g/mLC溶剂为PBS)的日丫定橙染色剂与面子悬浮液以1:20体积比均匀混合，室温下避光染色15min,16 OOOg离心1min去上清液终止染

4、色，灭菌去离子水洗涤1次，重悬，于包子浓度大于1个于包子/L。避光放置备用O4.3 激光扫描共聚焦显微镜活性检测4.3.1 将完成染色样品制备玻片，封片，倒置于激光扫描共聚焦显微镜载物台上，低倍镜下找到于包子，转到63倍油镜下观察，微调至视野内图像清晰。4.3.2 选择相应的激光管(氢离子激光器)激发荧光信号，设置荧光通道的激发波长(488nm)，收集荧光信号的发射波长(505口m)，并设置一个明场通道作为对照O4.3.3 选择低像素的平面扫描方式进行粗略扫描Cry:512X512)，依据扫描成像效果中荧光信号强弱SN/T 3579-2013 可调整探测针孔(Pinhole:300，即3.12

5、Airy Units二2.2 fim)、光电倍增管增益(Gain:500)、激光扫描强度(ScanStr:7.9%)，根据图像信噪比调整扫描模式(line)、重复扫描次数(Average:2)和扫描速度(Scan speed:6)。4.3.4 调整至成像质量较好时，再用精确扫描方式Cry:2 048 X 2 048)获取最终图像O4.3.5 扫描至少30个子包子，观察染色情况。注:因大豆疫霉病菌卵J包子有一定厚度，为保证图像能反映出卵于包子最真实的荧光染色情况.特别要注意观察明场通道下所得卵子包于图像是否清晰。4.4 抱子萌发取子包子悬浮液10011L,35 oc条件下放置5d，或者用。.1%

6、的高锚酸押处理20min，打破子包子休眠后，均匀涂布j二水琼脂培养幕，山封门膜封门，24oc黑暗培养，7d起开始观察，连纹培养观察30d，记录于包子萌发情况O5 结果判断与表述结果判断与表述如下:一一于包子染色后通过激光共聚焦显微镜随机扫描至少30个卵子包子，所扫描的卵抱子中，检测到含有卵质体呈均匀的绿色荧光的卵子包子(参见附录A.1)，判定该大豆疫霉病菌卵于包子具有活性;于包子染色后通过激光共聚焦显微镜随机扫描至少30个卵子包子，所有的卵于包子染色后卵质体断裂、边集，呈致密浓染的绿色荧光(参见附录A.2)，判定大豆疫霉病菌卵于包子不具活性;一一当上述染色特征不明显或无法进行准确判断时，再进行

7、面子萌发实验，根据萌发情况判定O6 样品与原始数据保存6.1 样品保存存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存6个月C如发现具有活性的大豆疫霉病菌子包子，该样品应保存1年，以备复验，如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕。保存期满后，需经灭曲处坷。6.2 原始数据保存样品检测结束后，其原始记录单和检验报告或证书应归挡，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。2 SN/T 3579-2013 附录A(资料性附录)大豆疫霉病菌卵子包子染色结果图a)激光通道扫描图b)明场扫描图图A.1大豆疫霉病菌活性卵子包子染色图a)激光通道扫描固b)明场扫描固图A.2大豆疫霉病菌不具活性的卵子包子染色图2日-R山的同军疫法地方Euq 检在泪气L、iA立士1性/-1出书活国k菌州血病时行理问九二剧中共SN/T 3579-2013 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)64275323争夺网址WWW.spc.口 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷手毛印张0.5字数8千字2013年8月第一次印刷1 16 2013年8月第一版印数1-1600开本880X 1230 7巳定价16.00字号书号:155066 2-25766 SN/T 3579-2013