SN∕T 4009-2014 国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的PCR检测方法(出入境检验检疫).pdf

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1、书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的犘犆犚检测方法犇犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犃狀 犪狆 犾 犪 狊犿犪狆犺 犪 犵 狅 犮 狔 狋 狅 狆犺 犻 犾 狌犿犫 狔犘犆犚犻 狀狋 犻 犮 犽 狊犪 狋犳 狉 狅 狀 狋 犻 犲 狉狆 狅 狉 狋 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、中华人民共和国四川出入境检验检疫局。本标准主要起草人：高玉

2、峰、赵亮、邓华、陈肖潇、程晓兰、姜陆、宋锋林。犛犖犜 国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的犘犆犚检测方法范围本标准规定了国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的检测对象、生物安全要求、样品采集及保存运输、检测方法和结果判断。本标准适用于国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。实验室生物安全通用要求 国境口岸蜱类监测规程 入出境列车医学媒介生物监测规程 入出境航空器医学媒介生物监测规程 入出境船舶医学媒介生物监测规程 入出境车辆医学媒介

3、生物监测规程 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则术语和定义下列术语和定义适用于本文件。蜱狋 犻 犮 犽属蜱螨亚纲的寄螨目（）、蜱总科（）。成虫在躯体背面有壳质化较强的盾板，统称为硬蜱（），属硬蜱科（）；背面无盾板者，统称为软蜱（），属软蜱科（）。嗜吞噬细胞无形体犃狀 犪狆 犾 犪 狊犿犪狆犺 犪 犵 狅 犮 狔 狋 狅 狆犺 犻 犾 狌犿嗜吞噬细胞无形体是专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，属立克次体目、无形体科，主要通过硬蜱叮咬传播，可引起人粒细胞无形体病。检测对象本标准检测对象包括：出入境交通工具、集装箱、货物、行李等场所采集的游离蜱或从上述场所宿主体表采集的寄生蜱；口岸地区采集的游离蜱或从

4、口岸地区宿主体表采集的寄生蜱。犛犖犜 生物安全要求实验过程中生物安全要求如下：检测工作中的个人防护参照 ；实验室应遵循 和 对生物安全级（）实验室的生物安全要求；使用过的实验用品应遵循 对废弃物的处理要求进行无害化处理。器材与试剂 器材本标准使用的主要仪器设备如下：高速冷冻离心机；高压蒸汽灭菌锅；仪；生物安全柜；电泳仪；凝胶成像系统；匀浆器等。试剂本标准使用的主要试剂如下：引物：外引物 及 、内引物 及 ；（含）；琼脂糖；染色剂 ；基因组提取试剂盒等。蜱类的采集及保存运输 采集蜱类采集参照下列标准执行：、。分装将采集的蜱类现场分拣，按类别装入适当的容器（如：冻存管、离心管、塑料平皿等），加贴标

5、签。标签内容至少包括以下信息：编号、种类、采集时间、采集地点（生境）、采集人、宿主等。保存运输分装完毕的蜱类样品，装入适当的冷冻、冷藏或常温装置，送实验室进行分类鉴定和嗜吞噬细胞无形体检测。犛犖犜 样品的检测 基因组犇犖犃提取使用试剂盒 ）进行基因组提取，也可使用达同等效果的基因组提取试剂盒，提取方法按照附录或按相应试剂盒说明书进行。）提取试剂盒是由公司提供，是适合市售产品的实例。给出这一信息是为了方便标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有同样的效果，则可使用这些等效产品。）染色剂 是由美国 公司提供，是适合市售产品的实例。给出这一信息是为了方便标准的使用者，并不表示对该产

6、品的认可，如果其他等效产品具有同样的效果，则可使用这些等效产品。核酸检测（犘犆犚法）引物设计根据嗜吞噬细胞无形体 序列，设计并合成套式的内、外引物。外引物 和 扩增的核酸片段长度为 ；内引物 和 扩增的核酸片段长度为 。引物序列如下：引物合成后用 溶解并分装冻存于 冰箱内。条引物溶解后浓度均为 。犘犆犚 对照的设立在核酸扩增实验中同时按下列所述设阳性对照、阴性对照和空白对照：阳性对照：以构建的嗜吞噬细胞无形体质粒（）作为阳性对照扩增模板；阴性对照：以实验室养殖、未感染病原体的蜱类基因组作为阴性对照扩增模板；空白对照：以 作为空白对照扩增模板。犘犆犚第一轮反应反应总体积。包括 （）、模板、外引物

7、 （）及 （）各，补充 使总体积达到。反应条件为：，；，循环；，。犘犆犚第二轮反应反应总体积。包括 （）、模板（第一轮产物）、内引物 （）及 （），补充 使总体积达到。反应条件为：，；，循环；，。琼脂糖凝胶电泳检测扩增结束后，在扩增产物中加入上样缓冲液，用含 ）的 琼脂糖凝胶电泳犛犖犜 检测扩增产物，用凝胶成像系统拍照记录结果。结果判断 质量控制有效实验应同时满足如下条件：阳性对照在预期位置（，）出现特异性扩增条带；阴性对照和空白对照未出现特异性扩增条带。结果分析 阳性结果在实验结果有效的情况下，待检样品套式第二轮反应产物在预期位置（）出现特异性扩增条带，可初步判断待检样品嗜吞噬细胞无形体检测

8、结果阳性。初步判断为阳性结果的样品可通过核酸序列测定、序列比对进一步确认。阴性结果在实验结果有效的情况下，待检样品套式第一轮和第二轮反应产物均未出现特异性扩增条带，可判断为待检样品嗜吞噬细胞无形体检测结果阴性。犛犖犜 附录犃（规范性附录）基因组犇犖犃提取方法犃 取蜱类个体放入离心管内，充分研磨。犃 加入 的缓冲液、和 （），于 水浴至组织完全裂解。犃 向裂解液中加入 的缓冲液和 的 乙醇，充分吸打混匀。犃 将 安置于 上，将 中溶液转移至 中，离心，弃滤液。犃 将 缓冲液加入至 中，离心，弃滤液。犃 将 缓冲液加入至 中，离心，弃滤液。重复操作此步骤。犃 将 安置于 上，离心。犃 将 置于新的 离心管上，加入 的 或 ，室温静置。犃 离心，洗脱，置于冰上待用或 冰箱保存。犛犖犜 书 书 书 犜犖 犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的犘犆犚检测方法 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲号（）北京市西城区三里河北街 号（）总编室：（）网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元