NY∕T 1898-2010 畜禽线粒体DNA遗传多样性检测技术规程(农业).pdf

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1、ICS 65.020.30 B 43 中华人民共和国农业行业标准NY/T 1898一2010禽线粒体DNA遗传多样性检测技术规程Protocolof detection for mitochondrial DNA genetic diversity of domestic animals 2010-07-08发布2010-09-01实施中华人民共和国农业部发布前-E 本标准遵照GB/T 1.-2009给出的规则起草a本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口。本标准起草单位:全国畜牧总站。本标准主要起草人:王志刚、刘丑生、邱小田、张桂

2、香、韩旭、于福清、孙飞舟。NY/T 1898-2010 I 畜禽线粒体DNA遗传多样性检测技术规程1 范固本标准规定了畜禽线粒体DNA遗传多样性检测的技术规程。本标准适用于畜禽线粒体DNA遗传多样性检测.2 规范性引用文件NY/T 1898-2010 下列文件对于本文本的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单适用于本文件.GA/T 383 法庭科学DNA实验室检验规范NY/T 1673 畜禽微卫星DNA遗传多样性检测技术规程3 术语和定义下列术语、定义和缩略语适用于本文件.3.1 线粒体DNAmitochondr

3、ial DNA.mtDNA 动物细胞核外唯一具有半自主能力的双链环状DNAo3.2 线粒体DNAD-Joop区mt J)NA D-Joop 动物线粒体DNA翻译和转录的调控区和唯一的非编码区，当线粒体DNA开始复制时，此区外形呈D形.4 检测方法4 1 样品的采集和保存4.1.1 在中心产区采样，个体应具备该种群的典型特征，样品的采集及保存应满足提取DNA的要求，并详细记录材料名称、来源、系谱、采集时间、地点及保存条件。4.1.2 每种群采集畜禽个体一般不少于60头(只).其中雄性数量不少于10%，要求个体间三代内元血缘关系.4.2 DNA的制备制备DNA的方法按NY/T1673的规定执行.4

4、.3 引物制备4.3.1 引导合成根据相关畜禽线粒体基因组序列设计引物，并合成.4.3.2 工作液配制将合成的引物瞬时离心，加入灭菌超纯7k充分震荡，配成浓度为100pmoI!L的储液，室温溶解30ffiln，分装，一20C保存，储液稀释10倍即为工作液.其中加入灭菌超纯水的体积v(L)按式()计算v=笠兰旦主羊且1(1)A机再rNY/T 1898一2010式中zMW一-引物分子量;OD ONA260 nm吸收的光密度。4.4 PCR反应体系PCR反应体系见附录A.10 4.5 PCR反应程序PCR反应程序见附录A.204.6 扩增产物的检测与国收凝胶电泳法检测PCR产物，扩增效果良好的样品按

5、附录B纯化回收，按附录C测序.5 搬据分析序列比对、单倍型统计、系统发生树构建等数据分析参见附录006 防污染措施按GA/T383规定的方法执行。7 对照实验设立阳性对照、阴性对照和空白对照，阳性对照为线粒体ONA样品，阴性对照为不具有细胞核ONA样品，空白对照为等量双蒸水。2 A.l PCR反应体系见襄A.1 组分及浓度Buffer(lOX)MgCl,(25 mmol!L)引物IIAOOpmol/L)弓l物I IBOOpmol!u d!1TPs(10 mmol!L)Taq E(5 u/u DNA样品ddH,O A.2 陀R反应程序见褒A.2阶段预变性2 5个-3 5个循环延伸保存附录A(规范

6、性附录)PCR反应体系和程序表A.lPCR反应体系5.0 L l严L-4L2.0 pL 2.0 L IL O.2 p.L 50 ng-l00 ng JJu至50L表A.2PCR反应程序温度.C95 94 50-65 72 使用72C 10 min-70 min 4C NY!T 1898-2010 最问4 min 20 s.60 s 30,-60,305.90 s 3 NY!T 1898-2010 B.1 材料、试剂和仪器B.1.1 材料待回收DNA样品。B1.2试剂a)1%低熔点胶，琼脂糖;附录B资料性附录)扩增产物的纯化回收b)glassmilk kit裂解缓冲液，漂洗液，glassmilk

7、;c)TE.ddH20;d)盼:分析纯;e)氯仿:分析纯s0 元水乙醇:分析纯;g)70%乙醇z分析纯。B.1.3 仪器设备a)离心机;b)71浴锅;c)电泳仪.B.2 纯化回收程序B 2.1 低熔点肢法电泳到适当位置后，在目的DNA条带的前端挖一长方形槽，向槽中加入融化的低熔点胶，待凝固后进行电泳.当DNA进入低熔点胶中心时停止电泳.紫外灯下切下目的条带的低熔点胶。将切下的胶放到离心管中，加入200L的TE.65C温浴3min以融化低熔点胶.分别用酷/氯仿和氯仿抽提一次。取上清液，加入2倍体积的无水乙醇.-20C沉淀DNA2 h以上.10000Xg离心15rnin，弃上消液，用70%乙酵洗涤

8、，吹干后溶于10L元菌水中，取1L电泳检测。B 2.2 冻融法电泳后直接切下凝胶中目的条带后加200LTE.再加2倍体积盼，在液氮中冻2min，再65C水浴中融化10min，这样重复数次.10000Xg离心5min，取上相液加2倍体积100%冰乙醇20C沉淀过夜，离心回收DNA.70%乙醇洗一次后溶于适量的TE或无商水中，电泳检测回收效果-B 2 3 Glassmilk法0.8%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，紫外灯下迅速切下目的条带，放入离心管，在含胶的离心管中加入3倍体积的凝胶裂解缓冲液混匀.60C水浴5min，以融化凝胶，加入10Lglassmilk混匀，室温静置5 min.lO OOOX g

9、离心1min弃上清液，加入125L漂洗液.10000Xg离心数秒钟，弃上清，再加入125L漂洗液，如此反复两次，沉淀中加人适量元商双蒸水混匀.60C水浴5min.500Xg离心2mint回收上清，取10L电泳检测。4 NY/T 1898-2010 B.3 结果分析DNA纯化回收后，电泳检测应为单一的条带.若电泳结果出现两条以上的带，则进行重复纯化回收.5 NY/T 1898-2010 C.1 PCR测序反应附录C(资料性附录iDNA测序C.1 1 取0.2mL的PCR管，编号，将管插在颗粒冰中，按表C.l加样.表C.l测序反应体系组成模极DNA重组质控200 08-500 08 由gDye2.

10、0 premix 1.5 pL-2.0 L M13 F/R通用引物10 pmol-30 pmol 5 X DigDye Reaction Buffer 1.5L ddH,O 1m至10L用最 若用PCR扩增产物，需200bp-500 bp 10 ng、500bp-I 000 bp 20咽，引物为上游或下游单测引物 C.1.2 将PCR管置于PCR仪上进行扩增.98L:变性2min后进行PCR循环.PCR循环参数为96L:10 5.50L:5 5.60L:4 min.25个循环，扩增结束后设置4L:保温。C.2 醋隘纳/Z.酶法纯化PCR产物将混合物离心，将扩增产物转移到1.5 mL离心管中.加

11、入25L醋酸纳/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA.10000Xg于4L:离心30min，小心弃上清.加70%(V/V)的乙鄙50L洗涤沉淀2次。10000Xg于4C离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10min-15 min.C.3 电泳前测序PCR产物的处理加入12L的模板抑制试剂于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，瞬时离心。将溶液转移至盖体分离的0.2mL PCR管中，瞬时离心.在PCR仪上进行热变性(95L:2 min).冰中骤冷，待上机.C.4 上机操作安装毛细管，进行毛细管位宜的校正，湛胶并建立运行的测序文件a仪器将自动灌胶至毛细管，1.2

12、kV预电泳5min，披编程次序自动进样，再预电泳(1.2kV.20min).在7.5kV下电泳2h。电泳结束后s仪榕会自动清洗、灌胶、进下一样品、预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h.电泳结束后，仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱.C.5 选行序列分析、序列比较。6 D 1 序列比对附录D资料性附录)鼓据分析NY/T 1898-2010 所得序列首先用序列比对软件进行完全比对，特别是出现碱基缺失或插入的区域，需要人为校对以达到最大的序列相似性。D.2 序5日j变异性分析及单倍型的识别利用序列变异分析软件确定多态位点，计算碱基组成、转换/颠换比率CTs/Tv)。缺失/插入的位点在统计时删

13、除.D.3 单倍型、单倍型频率在单倍型统计软件中识别单倍型，并计算单倍型频率.D.4 核膏酸多样性、单倍型多样性用核背睡量多样性、单倍型多样性软件tt算核苦酸多样性、单倍型多样性Chaplotypic diversity)等多态性统计参数。D.5 系统发生树的构建在系统发生树构建的软件中基于Kimura-2参数核背殴替代模型，构建Neighbour-joiningCNJ)系统发生树，叫算单倍型间的遗传距离.D.6 网络分析使用media-joiningnetwork网络进一步分析不同单倍型间的进化关系。D.7 核普酸不配对分析和选择中性检验采用核背酸不配对分析(mismatchanalys和Fus中性检验两种方法分析检验群体在过去是否发生扩张或经受了瓶颈效应。7