双向凝胶电泳.ppt

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1、第五章第五章 双向凝胶电泳双向凝胶电泳(2D-PAGE)蛋白质组分析的技术路线蛋白质组分析的技术路线双向凝胶电泳技术的发展及原理双向凝胶电泳技术的发展及原理仪器简介仪器简介样品制备样品制备技术流程技术流程1.蛋白质组分析的技术路线蛋白质组分析的技术路线要求要求流程流程技术路线技术路线蛋白质组分析的首要要求蛋白质组分析的首要要求将来自于全细胞、组织或生物体中所包将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析和分析。生物学问题生物学问题的提出的提出实验模型实验模型的设计的设计实验组和对照组实验组和对照组样品的制备样品的制备蛋白样

2、品的蛋白样品的IEF和和PAGE电泳分离电泳分离图像扫描和初步分析图像扫描和初步分析感兴趣感兴趣蛋白点蛋白点的切取的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对新新蛋白质的发现蛋白质的发现其它实验其它实验的进一步的进一步验证验证蛋白信息的蛋白信息的初步获得初步获得蛋蛋白白质质组组分分析析流流程程蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备双向电泳双向电泳图像分析图像分析转印至膜上的蛋白转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的

3、蛋白溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白质质量蛋白质质量N端测序端测序肽序列质谱数据肽序列质谱数据肽肽指纹图指纹图数据搜索数据搜索新的或已知蛋白新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定蛋白转录后修饰的鉴定2.双向电泳技术的发展及原理双向电泳技术的发展及原理双向凝胶电泳的发展双向凝胶电泳的发展 双向凝胶电泳的基本原理双向凝胶电泳的基本原理 双向凝胶电泳的发展双向凝胶电泳的发展双向凝胶电泳的思路最早是由双向凝胶电泳的思路最早是由Smithies 和和Poulik提出提出(Smithies O,Poulik MD.Two-dimensional electrophoresis of serum proteins.

4、Nature,1956,177:1033)，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率(free-solution mobility)，在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。，在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。随后，随后，Raymond发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳(Raymond S,Weintraub L.Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis.Science,1959,30:711)，双向电泳的支持介质

5、逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶(Margolis J,Kenrick KG.Two-dimensional resolution of plasma proteins by combination of polyac-rylamide disc and gradient gel electrophoresis.Nature,1969,221:1056-1057)，这即是双向凝胶电泳这即是双向凝胶电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2D PAGE)。同年，同年，2D PAGE在原理上又有了新

6、的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦在原理上又有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦的双向凝胶电泳技术建立起来，即的双向凝胶电泳技术建立起来，即IEF-PAGE(Dale G,Latner AL.Isoelectric focusing of serum proteins in acrylamide gels followed by electrophoresis.Clin Chim Acta,1969,24:61-68；Macko V,Stegemann H.Mapping of potato proteins by combined elctrofocusing and electrophor

7、esis identification of varieties.Hoppe-seylers Z Physiol.Chem,1969,350:917-919)。20世纪世纪70年代初，在第二向电泳中又使用了十二烷基磺酸钠年代初，在第二向电泳中又使用了十二烷基磺酸钠(SDS)(Barrett T,Gould HJ.Tissue and species specificity of non-histone chromatin proteins.Biochim Biophys Acta,1973,294:165-170；Martini OHW,Gould H.J.Enumeration of rab

8、bit reticulocyte ribosomal proteins.J Mol Biol,1971,62:403-405；Stegemann H.proteinfraktionierungen in polyacrylamid und die anwendung auf die genetische analyse bei pflanzen.Angew Chem,1970,82:640)，使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了，使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了现代双向凝胶电泳的基础，即现代双向凝胶电泳的基础，即IEF-SDS PAGE。19

9、75年，年，OFarrell、Klose和和Scheele分别对双向凝胶电泳做进一步的优化，分别对双向凝胶电泳做进一步的优化，建立了高分辨率的双向凝胶电泳建立了高分辨率的双向凝胶电泳(OFarrell PH.High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.J Biol Chem,1975,250:4007-4021；Klose J.protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues.A novel app

10、roach to testing for induced point mutations in mammals.Humangenetik,1975,26:231-243；Scheele GA.Two-dimensional gel analysis of soluble proteins.J Biol Chem,1975,250:5375-5385)。此项此项技术是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离并展示的分离技术，一技术是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离并展示的分离技术，一般能分离般能分离1000 3000个蛋白质点，最好的胶能分离得到个蛋白质点，最好的胶能分离得到11000个左右的蛋白质个左

11、右的蛋白质点。点。双向凝胶电泳的基本原理双向凝胶电泳的基本原理先将蛋白质根据其等电点在先将蛋白质根据其等电点在 pH 梯度胶内进行等电聚焦，然后按照它们的梯度胶内进行等电聚焦，然后按照它们的相对分子质量大小进行相对分子质量大小进行 SDS-PAGE 第二次电泳分离。第二次电泳分离。第一向进行等电聚焦第一向进行等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)，由于蛋白质具有两性，由于蛋白质具有两性解离和等电点特性解离和等电点特性，将蛋白质样品加载至将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，会向与其梯度介质上进行电泳时，会向与其所带电荷相反的电极方向移动所带电荷相反的电极方向移动。移

12、动过程中移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子蛋白分子可能获得或失去质子，并并随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电点点 pH 位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。当蛋白扩散到低于其等位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。当蛋白扩散到低于其等电点电点 pH 区域时，带正电荷，在电场的影响下重新向阴极移动区域时，带正电荷，在电场的影响下重新向阴极移动。同样同样，如果蛋白如果蛋白质扩散到高于其等电点的质扩散到高于其等电点的 pH 区域时，则带负电，在电场的作用下会向阳极移区域时，则带负电，在

13、电场的作用下会向阳极移动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的pH 梯度介质区梯度介质区域内。目前常使用域内。目前常使用预制胶条预制胶条(IPG,immobilized pH gradient)用于蛋白质的等电用于蛋白质的等电聚焦分离，将聚焦好的聚焦分离，将聚焦好的 IPG 胶条在含有胶条在含有 SDS 的缓冲液中平衡。的缓冲液中平衡。第二向是将在第二向是将在 IPG 胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到 SDS-PAGE凝凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量(

14、MW)大小与第一向相垂直的分离。沿大小与第一向相垂直的分离。沿垂直的方向进行垂直的方向进行 SDS-PAGE 电泳，按分子量大小进行分离。样品经过电荷和质电泳，按分子量大小进行分离。样品经过电荷和质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息。量两次分离后，得到等电点和分子量的信息。三种双向凝胶等电聚焦系统三种双向凝胶等电聚焦系统根据第一向等电聚焦条件和方式的不同，可将双向凝胶电泳分为三种系根据第一向等电聚焦条件和方式的不同，可将双向凝胶电泳分为三种系统：统：ISO-DALT、NEPHGE和和IPG-DALT。在在ISO-DALT系统中，等电聚焦在聚丙烯酰胺管胶系统中，等电聚焦在聚丙烯酰胺管胶(tu

15、be gel)中进行，载中进行，载体两性电解质体两性电解质(carrier ampholyte)在外加电场的作用下形成在外加电场的作用下形成pH梯度，梯度，pH梯梯度在碱性区不稳定（阴极漂移）、重复性不易掌握和上样量低是其主要缺点，度在碱性区不稳定（阴极漂移）、重复性不易掌握和上样量低是其主要缺点，并且一般不能分离等电点大于并且一般不能分离等电点大于8.0的碱性蛋白质，其优点是电泳设备要求不高，的碱性蛋白质，其优点是电泳设备要求不高，电泳溶液容易配制，易于开展工作，各种电泳条件经优化后，可达到非常高电泳溶液容易配制，易于开展工作，各种电泳条件经优化后，可达到非常高的分辨率，也可获得好的重复性，

16、目前唯一分辨到的分辨率，也可获得好的重复性，目前唯一分辨到10000个蛋白质斑点的图谱个蛋白质斑点的图谱正是采用了这一系统。正是采用了这一系统。NEPHGE为非平衡为非平衡pH梯度电泳梯度电泳(nonequilibrium pH gradient electrophoresis)，是，是IPG(immobilized pH gradient)胶发明前用于分离碱性蛋胶发明前用于分离碱性蛋白质的一种方法，蛋白质在等电聚焦场中达到平衡前结束电泳，第一向的白质的一种方法，蛋白质在等电聚焦场中达到平衡前结束电泳，第一向的pH也是依靠载体两性电解质和电场来建立。也是依靠载体两性电解质和电场来建立。IPG-

17、DALT的第一向电泳是采用的第一向电泳是采用1982年发明的年发明的IPG胶胶(Bjellqvist B,Ek K,Righetti PG et al.Isoelectric focusing in immobilized pH gradient:principle,methodology and some applications.J Biochem Biophys Methods,1982,6:317-339)，其，其pH梯度的形成依赖于不同梯度的形成依赖于不同pK值的一种合成的化合物值的一种合成的化合物immobiline，该，该化合物是丙烯酰胺的衍生物，为非两性的弱酸和弱减，在凝胶聚合

18、过程中，化合物是丙烯酰胺的衍生物，为非两性的弱酸和弱减，在凝胶聚合过程中，能与聚丙烯酰胺共价结合，因此，能与聚丙烯酰胺共价结合，因此，IPG胶的胶的pH梯度是稳定的，不依赖于外加梯度是稳定的，不依赖于外加电场，基本上克服了电场，基本上克服了ISO-DALT的主要缺点，无论在重复性和上样量上均优于的主要缺点，无论在重复性和上样量上均优于ISO-DALT。非变性非变性2D-PAGE：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的；值是一样的；非变性非变

19、性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非变性第一向采用非变性IEF，之后在之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在溶液中平衡；第二向也在SDS存在的条件下进行。适于分析存在的条件下进行。适于分析非共价键连接的蛋白非共价键连接的蛋白-蛋白间的相互作用。蛋白间的相互作用。非变性非变性/还原还原/SDS-2D-PAGE：非变性条件下非变性条件下IEF聚焦，之后用聚焦，之后用8M尿素尿素+5%-ME+2%SDS进行平衡，再进行第二向进行平衡，再进行第二向SDS-PAGE电泳。此时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消化、电泳。此时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鉴定

20、，提供关于断裂二硫键连接的多肽的分析鉴定，提供关于断裂二硫键连接的多肽的信息。信息。变性变性2D-PAGE：样品先用样品先用2%SDS+5%-ME+95变性变性5min,IEF在在8M尿素尿素+1%NP-40条件下进行，之后胶条用条件下进行，之后胶条用2%SDS+5%-ME平衡，然后进行平衡，然后进行SDS-PAGE。该技术适于该技术适于DNA序列和序列和多肽结构的分析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引多肽结构的分析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引起的多肽结构微异质性，但此方式显示的大于起的多肽结构微异质性，但此方式显示的大于100KD的蛋白质的蛋白质点少于第三种方式。点少于第三

21、种方式。双向电泳的分类双向电泳的分类3.仪器简介仪器简介第一向：第一向：采用珀耳帖温度控制聚焦平台；最大电压采用珀耳帖温度控制聚焦平台；最大电压为为10,000伏；有不同的电压上升方式；可分步伏；有不同的电压上升方式；可分步进行时间或电压进行时间或电压小时控制；重泡胀可采取整小时控制；重泡胀可采取整体的或独立的步骤；程序可时时控制；可同时体的或独立的步骤；程序可时时控制；可同时聚焦聚焦24根根7cm，12根根17cm胶条；有三个预设程胶条；有三个预设程序的方法；有十个用户自定方法；采集运行数序的方法；有十个用户自定方法；采集运行数据可经据可经RS232端口输出或任何热敏打印纸。端口输出或任何热

22、敏打印纸。BIO-RAD公司公司PROTEAN IEF Cell 等电聚焦仪：等电聚焦仪：Amersham pharmcia Biotech公司公司IPGphor等电聚焦仪：等电聚焦仪：电极区域为铜镀金板电极区域为铜镀金板；最多上最多上12个样品个样品；平台温度为平台温度为18-251；胶条胶条槽槽(Holder)体为氧化铝陶瓷，丙烯酸的盖子；适合体为氧化铝陶瓷，丙烯酸的盖子；适合7、11、13和和18cm的胶的胶条条；程序参数包括重泡胀时间程序参数包括重泡胀时间、平台温度平台温度、每根胶条的最大限流每根胶条的最大限流、每步的电每步的电压压、每步的电流改变模式每步的电流改变模式、每步的时间每步

23、的时间；可编辑可编辑10个程序个程序，每个程序分有九每个程序分有九个步骤个步骤；电压输出最大为电压输出最大为8000V；最大电流为最大电流为1.5mA；最大功率为最大功率为12W。第二向：第二向：BIO-RAD公司公司PROTEAN II xi Cell电泳槽：电泳槽：电极是直径为电极是直径为0.01英寸的白金电极；适用于英寸的白金电极；适用于16.520cm 凝胶电泳；凝胶厚凝胶电泳；凝胶厚度为度为1.0mm；可同时运行；可同时运行1-2块胶；上槽缓冲溶液块胶；上槽缓冲溶液350ml，下槽缓冲溶液，下槽缓冲溶液1.2 L；典型典型SDS-PAGE电泳时间：无冷却时为电泳时间：无冷却时为5小时

24、，带冷却时为小时，带冷却时为3.5小时。配套电源小时。配套电源为为Power Pac 1000：在进行电泳时，最大电压不超过：在进行电泳时，最大电压不超过1000V，最大功率不超过，最大功率不超过80W，最大室温不超过，最大室温不超过50。Amersham pharmcia Biotech公司公司Ettan DALT II System：(1)此系统的电源控制为此系统的电源控制为Power Supply/Control Unit：最大输出功率是：最大输出功率是200W；温度控制范围是；温度控制范围是10-50最大电压最大电压600V；最大电流；最大电流1A。(2)使用使用Gel caster灌

25、胶模具：最多可同时灌灌胶模具：最多可同时灌25.520.5cm、1mm厚的梯度胶或均一胶厚的梯度胶或均一胶14块。块。Amersham pharmcia Biotech公司公司Hoefet miniVE electrophoresis and electrotransfer Unit：胶大小为胶大小为10.08cm;最多可同时跑两块胶；跑一块胶时需最多可同时跑两块胶；跑一块胶时需1.7L电极缓冲液电极缓冲液，跑两块胶时需跑两块胶时需1.2L电极缓冲液电极缓冲液；最大电压是最大电压是600V，最大功率是最大功率是25W；所配置电所配置电源为源为Electrophoresis Power Supp

26、ly EPS 301。图像分析软件：图像分析软件：Amersham pharmcia Biotech公司：公司：imageMasterTM 2D version:5.0BIO-RAD公司：公司：PDQuesTM4.双向电泳分析中的样品制备双向电泳分析中的样品制备应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰

27、（如酶性或化学性降解等）。学修饰（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。从而保证待研究蛋白的可检测性。特殊样品的制备特殊样品的制备低低丰丰度度蛋蛋白白的的分分离离：尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量,但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。强强碱碱性性蛋

28、蛋白白质质（如如核核糖糖体体）的的处处理理：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH3-12、4-12或10-12)进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12)的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12)等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。极极端端分分子子量量的的蛋蛋白白质质：小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游离的dodelcyl sulfate ions持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而

29、降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。5.双向凝胶电泳技术流程双向凝胶电泳技术流程IPG重泡涨及样品加样重泡涨及样品加样第一向等电聚焦第一向等电聚焦第二向第二向SDS-PAGE检测检测问题及解决办法问题及解决办法IPG胶条的重泡胀胶条的重泡胀重泡涨时间至少要重泡涨时间至少要10h，泡涨不充分会影响相对分子量较高的蛋白质的吸收泡涨不充分会影响相对分子量较高的蛋白质的吸收。重泡涨液的体积和胶条的长度相匹配，操作时需参照相关说明书。重泡涨液的体积和胶条的长度相匹配，操作时需参照相关说明

30、书。不同的不同的加样方法和加样量加样方法和加样量会导致最终结果的差异。会导致最终结果的差异。温度的选择：重泡涨及等电聚焦时温度一般稳定在温度的选择：重泡涨及等电聚焦时温度一般稳定在20，太低尿素会结晶出，太低尿素会结晶出来，温度不稳也会造成胶上的蛋白质点位置的变化。来，温度不稳也会造成胶上的蛋白质点位置的变化。重泡涨时加上重泡涨时加上30-50V的低电压会促进胶条对蛋白质的吸收，但这一点在制备的低电压会促进胶条对蛋白质的吸收，但这一点在制备型电泳时才有意义。型电泳时才有意义。商品化的胶条使用前是以干胶条的形式和塑料支撑薄膜粘在一起，加样前需商品化的胶条使用前是以干胶条的形式和塑料支撑薄膜粘在一

31、起，加样前需要先撕去薄膜在重泡涨液中泡涨。重泡涨液的成分是：要先撕去薄膜在重泡涨液中泡涨。重泡涨液的成分是：8mol/L Urea,2%CHAPS,18mmol/L DTT,0.5%IPG Buffer,痕量痕量Bromophenol Blue，和裂解，和裂解液成分基本相同，在液成分基本相同，在10-100mmol/L浓度范围内适当提高浓度范围内适当提高DTT的浓度可提高的浓度可提高蛋白质的检测灵敏度。蛋白质的检测灵敏度。重泡涨可在等电聚焦盘内进行，此时样品已经加到重泡涨液中，在加样杯上重泡涨可在等电聚焦盘内进行，此时样品已经加到重泡涨液中，在加样杯上样样(cup loading)方式中，胶条

32、在专门的重泡涨盘内泡涨完成后再转入等电方式中，胶条在专门的重泡涨盘内泡涨完成后再转入等电聚焦盘内加样。聚焦盘内加样。泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内，从而能进行接下内，从而能进行接下来的来的IEF。聚焦时间的优化聚焦时间的优化 重泡涨结束后，在胶条和电极之间加上润湿的小纸片，它可以重泡涨结束后，在胶条和电极之间加上润湿的小纸片，它可以吸收盐离子和补充水分。在阴极加上吸收盐离子和补充水分。在阴极加上20mmol/L DTT润湿的纸润湿的纸片可减少碱性端的水平条纹并且有助于碱性蛋白质的聚焦。片可减少碱性端的水平条纹并且有助于碱性蛋白质

33、的聚焦。从理论上讲，获得最好的图谱质量和重复性所需的最佳时间是从理论上讲，获得最好的图谱质量和重复性所需的最佳时间是IEF分离达到稳定态所需的时间。分离达到稳定态所需的时间。聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、

34、最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、pH范围和范围和胶条长度通过经验来确定。胶条长度通过经验来确定。等电聚焦的电压上升分为三个阶段首先加上一个比较低的电压，等电聚焦的电压上升分为三个阶段首先加上一个比较低的电压，去出胶条中的过多的盐离子；然后开始加高电压，电压上升的去出胶条中的过多的盐离子；然后开始加高电压，电压上升的模式为缓慢上升；最后是持续高压，电压上升的模式为快速上模式为缓慢上升；最后是持续高压，电压上升的模式为快速上升。一般原则是：根据胶条的升。一般原则是：根据胶条的pH范围和上样量的多少，总电范围和上样量的多少，总电压时间积可以在一定的范围内调整。压时间积可以在一定的范围内调

35、整。IEF的基本条件的基本条件Stemp 1Stemp 2Stemp 3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020minLinear400040002hr10,000V-hrLinearRapid5 hr14,000V-hr7 cmStemp 1Stemp 2Stemp 3totaltotalStemp 1Stemp 2Stemp 311 cm17 cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr20,000V-hr40,000V-hr30,000V-hr50,000V-hr5.3 hr7 hrLinearLinearLi

36、nearLinearRapidRapid两维间的平衡两维间的平衡 一维（等点聚焦）电泳结束后可马上进行二维电泳，一维（等点聚焦）电泳结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于也可保存在两片塑料膜间于80保存数月。保存数月。但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与分离的蛋白质与SDS完整结合，从而在完整结合，从而在SDS-PAGE 时电泳能顺利进行。时电泳能顺利进行。建议方案是：用含建议方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6 mM尿素和尿素和30%甘油的甘油的50mM Tris(pH8.8)缓冲液缓冲液先平

37、衡先平衡15min，再用再用5%(m/v)碘乙酰胺取代碘乙酰胺取代DTT后后的上述缓冲液平衡的上述缓冲液平衡15 min。如果用如果用TBP代替代替DTT则则只需一步平衡。只需一步平衡。二维二维 SDS-PAGE同普通同普通SDS-PAGE类似。类似。但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，可以把但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，可以把 IPG 胶条看作是压缩胶，因胶条看作是压缩胶，因为在为在 IPG 胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性 IEF 胶（低浓胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶，所以只需使用分离胶（也可使用压缩胶）。度丙烯酰胺胶）充当了

38、浓缩胶，所以只需使用分离胶（也可使用压缩胶）。IPG 胶条平衡好后，一般将胶条在电泳缓冲夜里浸一下，这样一方面可以清胶条平衡好后，一般将胶条在电泳缓冲夜里浸一下，这样一方面可以清洗胶条去除胶条上的平衡液，另一方面，润湿的胶条也容易沿着玻璃板推到洗胶条去除胶条上的平衡液，另一方面，润湿的胶条也容易沿着玻璃板推到SDS-PAGE胶上端。胶上端。IPG胶条转移到胶条转移到SDS-PAGE有两种方式：一种方式是先将有两种方式：一种方式是先将IPG胶条放到胶条放到SDS-PAGE胶上，再加入熔化的琼脂糖溶液；另一种方式是先加入熔化的琼脂糖胶上，再加入熔化的琼脂糖溶液；另一种方式是先加入熔化的琼脂糖溶液，

39、再将溶液，再将 IPG 胶条放到胶条放到 SDS-PAGE 胶胶 上。两种方法各有优劣，第一种方上。两种方法各有优劣，第一种方式图谱不易变形，但在两块胶之间容易有小气泡发生，第二种方式非常好地式图谱不易变形，但在两块胶之间容易有小气泡发生，第二种方式非常好地解决了胶之间的气泡问题，但琼脂糖容易凝固，插入解决了胶之间的气泡问题，但琼脂糖容易凝固，插入 IPG 胶时有时会造成图胶时有时会造成图谱变形。相比较之下，气泡对图谱的影响较小，故常推荐第一种方式。谱变形。相比较之下，气泡对图谱的影响较小，故常推荐第一种方式。SDS-PAGE胶的浓度需根据研究目的和样品性质而定。常用的是胶的浓度需根据研究目的

40、和样品性质而定。常用的是12%和和12.5%的均一胶，灌胶方便，重复性好，但相对分子质量较高的蛋白质斑点较为的均一胶，灌胶方便，重复性好，但相对分子质量较高的蛋白质斑点较为聚集，分离不佳。如采用聚集，分离不佳。如采用9-16%的线性梯度胶，相对分子质量不同的蛋白质的线性梯度胶，相对分子质量不同的蛋白质点在整块凝胶上分布比较均匀，但灌胶不易。点在整块凝胶上分布比较均匀，但灌胶不易。电泳过程中温度一般控制在电泳过程中温度一般控制在10-15。聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测理想显色剂的理想显色剂的7S安全 (safety)；灵敏 (sensitivi

41、ty)；简单 (simplicity)；特异性(specificity)；快速 (speed)；稳定 (stability)；兼容性(synergy)。有机染料和银染有机染料和银染考染灵敏度为30100ng，线性范围是20倍；银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色，其极限灵敏度为810ng，但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果。胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)和/或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。负

42、负 染染能专门提高 PAGE 胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。速度快(515min)，蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如 EDTA 或 Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。该技术主要包括金属盐染料、锌咪唑染料等的使用。胶体扩散染料胶体扩散染料主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质，不用于胶内染色。最好的胶体金染色的灵敏度与PAGE胶内的银染类似。这种技术主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等。有机荧光团染料有机荧光团染料包括共价结合和非共

43、价结合的荧光团染料两类。后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、Orange、Ruby等荧光染料。这三种染料可对SDS-PAGE胶内蛋白质进行一步染色，约3060min完成，灵敏度为210ng。染色后的凝胶用标准的实验室300nm紫外透射仪进行照像保存，其线性范围为3个数量级。这三种染料的电泳染色结果与在酵母中通过SAGE所获得的基因表达水平的动态范围相匹配。在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质。金属螯合染料金属螯合染料这是一类与现代蛋白质组学研究相兼容的、相对较新的蛋白质显色试剂，其设计专门与常用微量化学表征过

44、程兼容。它们不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台(包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等)相结合。其中SYPRO Ruby也是一种基于钌的金属发光染料。凝胶的图像处理和分析凝胶的图像处理和分析典型流程：典型流程：凝胶图像的扫描；凝胶图像的扫描；图像加工；图像加工；斑点检测和定量；斑点检测和定量；凝胶配比；凝胶配比；数据分析；数据分析；数据呈递和解释；数据呈递和解释；2-DE数据库的建立。数据库的建立。2D-PAGE问题与原因问题与原因第一向等电聚焦的问题第一向等电聚焦的问题问题与现象问题与现象可能原因与解决措施可能原因与

45、解决措施IPG胶条在靠近胶条在靠近电极附近烧焦电极附近烧焦电流限制太高，最大电流限制设为电流限制太高，最大电流限制设为50A；IPG胶条没有完全重泡涨；胶条没有完全重泡涨；应检查重泡涨液的体积，保证重泡涨液的体积足够；应检查重泡涨液的体积，保证重泡涨液的体积足够；IPG胶条过于干燥；重泡涨和等电聚焦时加矿物油。胶条过于干燥；重泡涨和等电聚焦时加矿物油。电压太低，达不电压太低，达不到最高电压到最高电压样品盐浓度太高；样品盐浓度太高；脱盐或稀释样品，等电聚焦脱盐或稀释样品，等电聚焦12h后更换电极电片；后更换电极电片；盐浓度不得超过盐浓度不得超过100mmol/L，最好控制在，最好控制在10mmo

46、l/L以内；以内；等电聚焦的设置错误；等电聚焦的设置错误；检查电压设置。检查电压设置。电流为零或很低电流为零或很低持胶槽和电极接触不好，或者电极和胶条的接触不好；持胶槽和电极接触不好，或者电极和胶条的接触不好；检查以上接触情况，检查胶条是否重泡涨。检查以上接触情况，检查胶条是否重泡涨。尿素在胶条表面尿素在胶条表面结晶结晶温度太低；温度太低；温度控制设为温度控制设为20，室温不能太低。，室温不能太低。2D-PAGE问题与原因问题与原因第二向第二向 SDS-PAGE（垂直系统）的问题（垂直系统）的问题问题与现象问题与现象可能原因与解决措施可能原因与解决措施开始时没有电流开始时没有电流上下槽是否有电

47、泳缓冲液。上下槽是否有电泳缓冲液。电泳太慢电泳太慢检查电泳缓冲液是否配错；检查电泳缓冲液是否配错；检查分离胶缓冲液是否配错。检查分离胶缓冲液是否配错。溴酚蓝前沿一边上翘溴酚蓝前沿一边上翘阴极电泳缓冲液没有接触胶的一端；阴极电泳缓冲液没有接触胶的一端；保证电泳缓冲液覆盖了胶的全长。保证电泳缓冲液覆盖了胶的全长。溴酚蓝前沿两边上翘溴酚蓝前沿两边上翘冷凝不好，检查冷凝器是否工作正常。冷凝不好，检查冷凝器是否工作正常。溴酚蓝前沿不规则溴酚蓝前沿不规则受受IPG buffer影响，对最终的结果没有影响；影响，对最终的结果没有影响；胶条太旧或二向成品胶太旧，检查日期是否过期；胶条太旧或二向成品胶太旧，检查

48、日期是否过期；IPG胶条转移到二向时下面有气泡；胶条转移到二向时下面有气泡；保证胶条和二向胶顶部紧密接触，无气泡。保证胶条和二向胶顶部紧密接触，无气泡。2D-PAGE问题与原因问题与原因 染色的问题染色的问题问题与现象问题与现象可能原因与解决措施可能原因与解决措施水平条纹水平条纹聚焦时间太短聚焦时间太短(尤其对于相对分子质量较高的蛋白质尤其对于相对分子质量较高的蛋白质)或太长或太长(蛋白质会分解蛋白质会分解)；优化聚焦时间优化聚焦时间去垢剂浓度太低或使用了不合适的去垢剂；去垢剂浓度太低或使用了不合适的去垢剂；检查去垢剂浓度检查去垢剂浓度,测试不同的去垢剂测试不同的去垢剂尿素浓度太低；尿素浓度太

49、低；重泡涨液的浓度不低于重泡涨液的浓度不低于8mol/LIPG胶条时间太短，没有重泡涨到其原始厚度；胶条时间太短，没有重泡涨到其原始厚度；重泡涨胶条至重泡涨胶条至0.5mm厚，时间大于厚，时间大于6h或过夜或过夜裂解液或重泡涨液的裂解液或重泡涨液的DTT浓度不够；浓度不够；裂解液的裂解液的DTT浓度为浓度为65mmol/L或重泡涨液的或重泡涨液的DTT浓度为浓度为18mmol/L单个蛋白质的多重氧化；单个蛋白质的多重氧化；加足够量加足够量DTT，等电聚焦时加上矿物油，矿物油脱气或充上惰性气体，等电聚焦时加上矿物油，矿物油脱气或充上惰性气体由于由于DTT朝阳极移动，碱性端朝阳极移动，碱性端DTT

50、消耗；消耗；在阴极加上在阴极加上20mmol/L DTT润湿的电极垫片润湿的电极垫片错误的电极加样区域；错误的电极加样区域；检查阳极还是阴极加样比较好，或者使用样品的胶内重泡涨方式加样检查阳极还是阴极加样比较好，或者使用样品的胶内重泡涨方式加样由于样品的内源性水解造成的假象；由于样品的内源性水解造成的假象；用用TCA丙酮法处理失活蛋白酶，加入蛋白酶抑制剂或与丙酮法处理失活蛋白酶，加入蛋白酶抑制剂或与SDS一起煮一起煮空气中的空气中的CO2干扰；干扰；等电聚焦时加矿物油，密封电泳腔或在腔内加上等电聚焦时加矿物油，密封电泳腔或在腔内加上NaOH润湿的纸片去除润湿的纸片去除CO2相对分子质量为相对分