酶的活性.ppt

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1、生生物物化化学学第二章第二章 核酸的化学核酸的化学核酸的性质与核酸的性质与 研究方法研究方法4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质 5 5 核酸的分离纯化、测定核酸的分离纯化、测定 及研究方法及研究方法第二章第二章 核酸的化学核酸的化学 核酸的性质是由其结构决定的。核酸的性质是由其结构决定的。核酸核酸的结构特点的结构特点是分子大是分子大,有一些可解离的基有一些可解离的基团团,具有共轭双键等具有共轭双键等.这些特点决定了核酸这些特点决定了核酸及其组分核苷酸性质的基础及其组分核苷酸性质的基础.下面介绍几下面介绍几种重要的性质种重要的性质:2.6 2.6 核酸的理化性质核酸的理化性质一、物理性质一、物

2、理性质1 1、性状性状：RNARNA及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色粉及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色粉末或结晶；末或结晶；DNADNA则为疏松石棉一样的纤维状固体。则为疏松石棉一样的纤维状固体。2 2、粘性粘性：核酸的水溶液粘度很大，核酸的水溶液粘度很大，粘度粘度DNADNA大于大于RNARNA。核酸变性后，粘度下降。核酸变性后，粘度下降。2.6 2.6 核酸的理化性质核酸的理化性质3 3、溶解性溶解性：RNARNA和和DNADNA都是都是极性的化合物极性的化合物，一般说来，这些化，一般说来，这些化合物都合物都微溶于水微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机

3、溶剂不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。它们。它们的的钠盐钠盐易溶于水。易溶于水。DNADNA和和RNARNA在生物细胞内都与蛋白质结合成核在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白。蛋白。DNADNA核蛋白与核蛋白与RNARNA核蛋白的溶解度受溶液的核蛋白的溶解度受溶液的盐浓度盐浓度的影响的影响而不同。而不同。DNADNA蛋白在低浓度的盐溶液中随盐浓度的增加而增加；蛋白在低浓度的盐溶液中随盐浓度的增加而增加；而而RNARNA蛋白在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小蛋白在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小.4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质二、核酸的紫外吸收性质：二、核酸的紫外吸收性质：核酸分子中含有

4、嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫外吸收的性质，在核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫外吸收的性质，在260260nmnm处核酸紫外吸收最强。核酸紫外吸收是核酸定量测定的基础。处核酸紫外吸收最强。核酸紫外吸收是核酸定量测定的基础。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质1.DNA或或RNA的定量的定量OD260=1.0相当于相当于50 g/ml双链双链DNA40g/ml单链单链DNA（或（或RNA）20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度DNA纯品纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品纯品:OD260/OD280=2.0OD260的应用的应用三、核酸结构的稳定性三、

5、核酸结构的稳定性 核酸的结构相当稳定核酸的结构相当稳定,其主要原因有其主要原因有:1 1、碱基对间的氢键、碱基对间的氢键 在在DNADNA双螺旋和双螺旋和RNARNA的双螺旋区，碱基对的大小使的双螺旋区，碱基对的大小使其在螺旋内的距离很适合于形成氢键其在螺旋内的距离很适合于形成氢键、碱基堆积、碱基堆积碱基堆积力对维持核酸的空间结构起主要作用碱基堆积力对维持核酸的空间结构起主要作用、环境中的正离子、环境中的正离子4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质四、核酸的两性电离与等电点四、核酸的两性电离与等电点 核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有核酸

6、具有两性电离的性质两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNADNA的的pIpI约约为为4 45 5，RNARNA的的pIpI约为约为2.02.02.52.5，在在pH7pH78 8电泳时电泳时泳向正极。泳向正极。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质五、五、DNADNA的变性、复性与分子杂交的变性、复性与分子杂交 DNADNA双螺旋结构模型，不仅与其生物功能有密切关系，还双螺旋结构模型，不仅与其生物功能有密切关系，还能解释能解释DNADNA的重要特性变性与复性，这对于深入了解的重要特性变性与复性，这对于深入了解

7、DNADNA分子分子结构与功能的关系又有重要意义。结构与功能的关系又有重要意义。（一）（一）DNADNA变性变性(denaturationdenaturation)1 1、DNADNA变性的概念变性的概念：指：指DNADNA分子中的双螺旋结构解链为无规分子中的双螺旋结构解链为无规则线性结构的现象。则线性结构的现象。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质2 2、DNADNA变性的本质变性的本质：维持双螺旋稳定性的：维持双螺旋稳定性的氢键断裂氢键断裂，碱基间碱基间的堆积力的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。3 3、导致导致DNADNA变性的因素变性的因

8、素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的加热、极端的pHpH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。均可引起核酸分子变性。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4、变性变性DNADNA的特征：的特征：（1 1）溶液粘度降低：）溶液粘度降低：DNADNA双螺旋是紧密的刚性结构，变性双螺旋是紧密的刚性结构，变性后转化成柔软而松散的无规则单股线性结构，因此粘度明后转化成柔软而松散的无规则单股线性结构，因此粘度明显下降。显下降。（2 2）

9、旋光性发生变化：变性后整个）旋光性发生变化：变性后整个DNADNA分子的对称性及分分子的对称性及分子构型改变，使子构型改变，使DNADNA溶液的旋光性发生变化。溶液的旋光性发生变化。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质 （3 3）紫外吸收增强）紫外吸收增强 增色效应增色效应(hyperchromichyperchromic effect)effect)：指指DNADNA变性后其紫外吸收变性后其紫外吸收明显增强的效应。明显增强的效应。DNADNA分子中碱基间电子的相互作用使分子中碱基间电子的相互作用使DNADNA分子分子具有吸收具有吸收260260nmnm波长紫外光的特性。在波长紫外光的特性。在

10、DNADNA双螺旋结构中碱基藏双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时入内侧，变性时DNADNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质 可见，可见，DNADNA变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的50%50%时的温度称为核酸的解链温度，由于这一现象和结晶的融解时的温度称为核酸的解链温度，由于这一现象和结晶的融

11、解相类似，又称相类似，又称融解温度融解温度(Tm,melting temperature)Tm,melting temperature)。在在TmTm时，时，核酸分子内核酸分子内50%50%的双螺旋结构被破坏。特定核酸分子的的双螺旋结构被破坏。特定核酸分子的TmTm值值与其与其G GC C所占总碱基数的百分比成正相关，两者的关系可表所占总碱基数的百分比成正相关，两者的关系可表示为：示为：4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质Tm=69.3Tm=69.30.41(G+C)%0.41(G+C)%一定条件下一定条件下(相对较短的核酸分子相对较短的核酸分子)，TmTm

12、值大小值大小还与还与核酸分子的长度核酸分子的长度有关，核酸分子越长，有关，核酸分子越长，TmTm值值越大；另外，越大；另外，溶液的离子强度溶液的离子强度较低时，较低时，TmTm值较低，值较低，融点范围也较宽，反之亦然，因此融点范围也较宽，反之亦然，因此DNADNA制剂不应保制剂不应保存在离子强度过低的溶液中。存在离子强度过低的溶液中。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质(二二)DNADNA的热变性与复性的热变性与复性(renaturationrenaturation)指经加热变性的指经加热变性的DNADNA在适当条件下，二条互补链全部在适当条件下，二条互补链

13、全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。热变性逆转过程。热变性DNADNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为程称之为退火退火(annealing)annealing)。这一术语也用以描述杂交核这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成酸分子的形成(见后见后)。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质 DNADNA的复性不仅受温度影响，还受的复性不仅受温度影响，还受DNADNA自身特性等其自身特性等其它因素的影响：它因素的影响：1

14、1、温度和时间：、温度和时间：一般认为比一般认为比Tm Tm 低低2525左右的温度是复性的最佳条件，左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是越远离此温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过一缓慢过程，若在超过TmTm的温度下迅速冷却至低温的温度下迅速冷却至低温(如如44以下以下)，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式保持保持DNADNA的变性的变性(单链单链)状态。这说明降温时间太短以及温状态。这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性。差大均不利于复性。4 4 核酸的理化性质核酸的理

15、化性质2 2、DNADNA浓度：浓度：溶液中溶液中DNADNA分子越多，相互碰撞结合的机会越大，有利分子越多，相互碰撞结合的机会越大，有利于复性。于复性。3、DNA顺序的复杂性：顺序的复杂性：简单顺序的简单顺序的DNADNA分子，如多聚分子，如多聚(A)A)和多聚和多聚(U)U)这二种单链这二种单链序列复性时，互补碱基的配对较易实现。而顺序复杂的序序列复性时，互补碱基的配对较易实现。而顺序复杂的序列要实现互补，则困难得多。列要实现互补，则困难得多。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质 DNADNA的变性和复性原理，现已在的变性和复性原理，现已在医学医学和和生命科生命科学学上得到广泛的应用。如核

16、酸杂交与探针技术，上得到广泛的应用。如核酸杂交与探针技术，聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain polymerase chain reaction,PCR)reaction,PCR)技术等。技术等。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质（三）分子杂交：（三）分子杂交：(hybridization)hybridization)不同来源的核酸变性后，合并在一处进行复性，这不同来源的核酸变性后，合并在一处进行复性，这时，只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱时，只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱基互补配对的片段，复性也会发生于不同来源的核酸基互补配对的片段，复性也会发

17、生于不同来源的核酸链之间，即形成所谓的链之间，即形成所谓的杂化双链杂化双链(heterodupheterodup lexlex)，这个过程称为这个过程称为杂交杂交(hybridization)hybridization)。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质 杂交可以发生于杂交可以发生于DNADNA与与DNADNA之间，也可以发生于之间，也可以发生于RNARNA与与RNARNA之间和之间和DNADNA与与RNARNA之间。之间。例如，一段天然的例如，一段天然的DNADNA和这段和这段DNADNA的缺失突变体的缺失突变体(假定这种突变是假定这种突变是DNADN

18、A分子中部丢失了若干碱基对分子中部丢失了若干碱基对)一起杂交，电子显微镜下可以看到杂化双链中部鼓一起杂交，电子显微镜下可以看到杂化双链中部鼓起小泡。测定小泡位置和长度，可确定缺失突变发起小泡。测定小泡位置和长度，可确定缺失突变发生的部位和缺失的多少。生的部位和缺失的多少。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质 核酸杂交技术是目前研究核酸结构、功能核酸杂交技术是目前研究核酸结构、功能常用手段之一，不仅可用来检验核酸的缺失、常用手段之一，不仅可用来检验核酸的缺失、插入，还可用来考察不同生物种类在核酸分子插入，还可用来考察不同生物种类在核酸分子中的共同序列和不同序列以确定它们在进化中中的共同序列和不同

19、序列以确定它们在进化中的关系，其主要应用如下图所示的关系，其主要应用如下图所示 ：4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质 核酸杂交及其应用示意图核酸杂交及其应用示意图.变性、复性和杂交。粗细线分别代表不同变性、复性和杂交。粗细线分别代表不同DNADNA。A A是杂化双链是杂化双链 B B代表天然代表天然DNADNA；C C是是B B的缺失突变体；的缺失突变体；虚线框内是虚线框内是 已缺失的部分；已缺失的部分；D D是显示从天然是显示从天然DNADNA链鼓链鼓.突变体的鉴别。突变体的鉴别。.粗线代表探针，粗线上的粗线代表探针，粗线上的X X表示放射性标记表示放射性标记4 4 核酸的理化性质核酸的理

20、化性质4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质 在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和诊断的非在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和诊断的非常有用的技术称常有用的技术称探针技术探针技术(Probe)Probe)。探针技术在探针技术在遗传性疾病诊断遗传性疾病诊断上已开始应用。上已开始应用。例如诊断地中海贫血或血红蛋白病，可以由已确诊的病例如诊断地中海贫血或血红蛋白病，可以由已确诊的病人白细胞中提取人白细胞中提取DNADNA，这就是诊断探针。用诊断探针检查，这就是诊断探针。用诊断探针检查

21、，不但可以对有症状患者进行确诊，还可以发现一些没有症状不但可以对有症状患者进行确诊，还可以发现一些没有症状4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质的隐性遗传性疾病。如从胎儿的羊水可以提取到少量的隐性遗传性疾病。如从胎儿的羊水可以提取到少量DNADNA后，再用探针技术对此进行产前诊断各种遗传性疾后，再用探针技术对此进行产前诊断各种遗传性疾病已在临床上开展。病已在临床上开展。杂交和探针技术是许多分子生物学技术的基础，在生杂交和探针技术是许多分子生物学技术的基础，在生物学和医学的研究中，以及临床诊断中得到了日益广泛物学和医学的研究中，以及临床诊断中得到了日益广泛的应用。的应用。4 4 核酸的理化性质核酸

22、的理化性质一、分离核酸的一般原则一、分离核酸的一般原则 因因为为遗遗传传信信息息全全部部贮贮存存在在核核酸酸的的一一级级结结构构中中，故故完整的一级结构完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。是保证核酸结构与功能研究的基础。保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则：（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则：4 4 核酸的分离纯化、测定及研究方法核酸的分离纯化、测定及研究方法（二）核酸的纯度要求（二）核酸的纯度要求 核核酸酸样样品品中中不不应应存存在在对对酶酶有有抑抑制制作作用用的的有有机机溶溶剂和过高

23、浓度的金属离子；剂和过高浓度的金属离子；其其它它生生物物大大分分子子如如蛋蛋白白质质、多多糖糖和和脂脂类类分分子子的的污染应降低到最低程度；污染应降低到最低程度；排排除除其其它它核核酸酸分分子子的的污污染染，如如提提取取DNADNA分分子子时时，应去除应去除RNARNA，反之亦然。反之亦然。5 5 核酸的分离纯化核酸的分离纯化（三）核酸分离纯化的注意事项（三）核酸分离纯化的注意事项 为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：尽尽量量简简化化操操作作步步骤骤，缩缩短短提提取取过过程程，以以减减少少各各种种有有害害因素对核酸的破坏；因素对核酸的破坏

24、；减减少少化化学学物物质质对对核核酸酸的的降降解解，为为避避免免过过酸酸、过过碱碱对对核核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4pH41010条件下进行；条件下进行；5 5 核酸的分离纯化核酸的分离纯化 防防止止核核酸酸的的生生物物降降解解。细细胞胞内内或或外外来来的的各各种种核核酸酸酶酶水水解解核核酸酸链链中中的的磷磷酸酸二二酯酯键键，直直接接破破坏坏核核酸酸的的一一级级结结构构。其其中中DNADNA酶酶需需要要金金属属二二价价阳阳离离子子MgMg2+2+，CaCa2+2+的的激激活活，因因此此使使用用金金属属离离子子螯螯合合剂剂，如如EDTAEDTA或或柠柠

25、檬檬酸酸盐盐等等基基本本上上可可以以抑抑制制DNADNA酶酶的的活活性性。而而RNARNA酶酶不不但但分分布布广广泛泛、极极易易污污染染样样品品，而而且且耐耐高高温温、耐耐酸酸碱碱、不不易易失失活活，所所以以生生物物降降解是解是RNARNA提取过程中的主要危害因素；提取过程中的主要危害因素；5 5 核酸的分离纯化核酸的分离纯化 减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。械剪切力，其次是高温。机机械械剪剪切切力力包包括括强强力力高高速速的的溶溶液液振振荡荡、搅搅拌拌，细细胞胞突突然然置置于于低低渗渗液液中中；细细胞胞爆爆炸炸

26、式式地地破破裂裂及及DNADNA样样品品的的反反复复冻冻融融等等。这这些些操操作作细细节节在在实实验验操操作作中中应应加加倍倍注注意意。机机械械剪剪切切作作用用的的主主要要危危害害对对象象是是大大分分子子量量的的线线性性DNADNA分分子子，如如真真核核细细胞胞的的染染色色体体DNADNA等等。高高温温，如如长长时时间间煮煮沸沸，除除水水沸沸腾腾带带来来的的剪剪切切力力外外，高高温温本本身身对对核核酸酸分分子子中中的的某某些些化化合合键键也也有有破破坏坏作作用用。核核酸酸提提取取过过程程中中常常规规操操作作温温度为度为0 044以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。以降低核酸酶的活性从而

27、减少对核酸的生物降解。5 5 核酸的分离纯化核酸的分离纯化二、核酸分离纯化的一般步骤二、核酸分离纯化的一般步骤 破碎细胞破碎细胞去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子沉淀核酸沉淀核酸去除盐类、有机溶剂等杂质去除盐类、有机溶剂等杂质纯化干纯化干燥燥溶解溶解 核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核的方案，可

28、获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。酸分子。5 5 核酸的分离纯化核酸的分离纯化三、核酸的测定方法三、核酸的测定方法1、紫外吸收法、紫外吸收法 在一定在一定pHpH下测定样品的紫外吸光度（下测定样品的紫外吸光度（A A260260），），即可由即可由下式计算样品中的核酸含量：下式计算样品中的核酸含量：C=MrArA260/L 其其中中：C C为为核核酸酸的的含含量量（mg/mg/mLmL），MrMr为为相相对对分分子子质质量量，A A260260为为核核酸酸溶溶液液的的吸吸光光度度，为为摩摩尔尔消消光光系系数数（即即1 1升升溶溶液液中中含含1 1摩摩尔尔核核酸酸的的光光吸吸收收值值），

29、L L为为比比色色杯杯的的内内径（径（cmcm）5 5 核酸的分离纯化、测定及研究方法核酸的分离纯化、测定及研究方法5 5 核酸的分离纯化、测定及研究方法核酸的分离纯化、测定及研究方法2、定糖法、定糖法 RNARNA的的测测定定：RNARNA分分子子中中所所含含的的核核糖糖经经浓浓硫硫酸酸或或浓浓盐盐酸酸作作用用脱脱水水生生成成糠糠醛醛，糠糠醛醛可可与与3 3，5-5-二二羟羟甲甲苯苯（苔苔黑黑酚酚或或地地衣衣酚酚）反反应应生生成成绿绿色色化化合合物物，该该化化合合物物可可在在670-680670-680nmnm波长下进行比色测定。波长下进行比色测定。DNADNA的的测测定定：DNADNA分分

30、子子中中的的脱脱氧氧核核糖糖在在冰冰醋醋酸酸或或浓浓硫硫酸酸存存在在下下可可与与二二苯苯胺胺反反应应生生成成兰兰色色化化合合物物，该该化化合合物物可可在在595-620595-620nmnm波长下进行比色测定。波长下进行比色测定。5 5 核酸的分离纯化、测定及研究方法核酸的分离纯化、测定及研究方法3、定磷法、定磷法 RNARNA和和DNADNA中中都都含含有有磷磷酸酸，可可以以进进行行磷磷的的测测定定。纯纯的的核核酸酸中中含含磷磷量量在在9.5%9.5%左左右右，因因此此，测测出出核核酸酸中中的的磷磷含含量量就就可可计计算算核核酸酸的的含含量量。测测定定时时先先将将核核酸酸用用强强酸酸消消化化

31、成成无无机机磷磷酸酸，后后者者与与定定磷磷试试剂剂中中的的钼钼酸酸反反应应生生成成磷磷钼钼酸酸，在在经经过过还还原原作作用用而而生生成成蓝蓝色色的复合物的复合物，最后在，最后在650-660650-660nmnm进行比色测定。进行比色测定。5 5 核酸的分离纯化、测定及研究方法核酸的分离纯化、测定及研究方法四核酸研究方法四核酸研究方法 （一）核酸的沉降特性（一）核酸的沉降特性 溶溶液液中中的的核核酸酸在在引引力力场场中中可可以以下下沉沉。在在超超速速离离心心机机造造成成的的强强大大的的离离心心力力场场中中，核核酸酸分分子子下下沉沉的的速速度度大大大大加加快快。核酸的超速离心用于：核酸的超速离心

32、用于：1、测定核酸的浮力密度；、测定核酸的浮力密度；2、测定、测定DNA分子中的分子中的G、C含量；含量；5 5 核酸的分离纯化、测定及研究方法核酸的分离纯化、测定及研究方法3、测定溶液中核酸的构象，核酸经染料、测定溶液中核酸的构象，核酸经染料氯化铯密度氯化铯密度梯度离心以后，在离心管里，沉降的速度由大到小依梯度离心以后，在离心管里，沉降的速度由大到小依次为：次为：超螺旋超螺旋DNA、闭环质粒闭环质粒DNA、开环及线型开环及线型DNA，若若样品中含有蛋白质，蛋白质沉降速度最小。样品中含有蛋白质，蛋白质沉降速度最小。4、核酸的制备。、核酸的制备。5 5 核酸的分离纯化、测定及研究方法核酸的分离纯

33、化、测定及研究方法5 5 核酸的分离纯化、测定及研究方法核酸的分离纯化、测定及研究方法（二）核酸的凝胶电泳（二）核酸的凝胶电泳 凝凝胶胶电电泳泳是是当当前前核核酸酸研研究究中中最最常常用用的的方方法法，有有琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳、聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳。前前者者常常用用于于DNADNA的的分分离离分分析析，后后者者用用于于RNARNA的的分分离离分析。分析。5 5 核酸的分离纯化、测定及研究方法核酸的分离纯化、测定及研究方法5 5 核酸的分离纯化、测定及研究方法核酸的分离纯化、测定及研究方法 1:1:DL2000 DL2000 2 2:PCRPCR扩增产物扩增产物 3 3:

34、重组质重组质粒粒PCRPCR鉴定鉴定 4 4:重组质粒重组质粒酶切鉴定酶切鉴定 5 5:重组质粒重组质粒 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1:1:引物引物p4p4与与p5 PCRp5 PCR结果结果 2:2:引物引物p3p3与与p5 PCRp5 PCR结果结果 3:3:引物引物p2p2与与p5 PCRp5 PCR结果结果 4:4:引物引物p1p1与与p5 PCRp5 PCR结果结果 5:DL20005:DL2000502bp2000bp2000bp502bp核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳测测 序序 PCR是是一一种种选选择择性性体体外外扩扩增增DNA或或RNA的的方方法法，主主要有三个步

35、骤要有三个步骤：1、变性：、变性：目的双链DNA片段在94下解链；2、退退火火：两种寡核苷酸引物在适当温度（50左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对；3、延延伸伸：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下以目的DNA为模板进行合成。由这三个步骤构成一个循环，理论上每次循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经2535轮循环可使DNA扩增达106倍。如果人体有如果人体有1014个细胞，每个细胞，每个个细胞细胞DNA含量含量6.4109bp，试计算一下人体，试计算一下人体DNA的总长度的总长度为多少米？它相当于地球到太阳的距离为多少米？它相当于地球到太阳

36、的距离（2.2109 km）之几倍？）之几倍？例题例题1：大肠杆菌噬菌体大肠杆菌噬菌体T2 DNA的相对分子质量为的相对分子质量为120106，它的头部长约，它的头部长约210nm,假定每个核苷假定每个核苷酸对的相对分子质量为酸对的相对分子质量为650，计算，计算T2 DNA的的长度和头部长度的比？长度和头部长度的比？例题例题2：一双链一双链DNA的一条链中的的一条链中的A 0.3，G 0.24，问：，问：1）该条链中的）该条链中的T和和C时多少？时多少？2）该条链的互补链中，）该条链的互补链中，T、C、A和和G应时多少？应时多少？例题例题3：噬菌体噬菌体M13 DNA它的碱基组成是：它的碱基组成是：A，23%，T，36%，G，21%，C，20%，这个碱基组成说明这个碱基组成说明M13 DNA具有什么特点？具有什么特点？例题例题4：