三聚氰胺掺假蛋白食品的筛选.pdf

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1、三聚氰胺掺假蛋白食品的筛选 本文提供 了一种分 析三聚氰胺 及其类 似物 的耐 用、有效 且确定 转化为二甲基硅(T MS)衍生物，衍生 性 方案。除优 化 的 GC MS方 法外 还 讨论 了样 品准 备方 案 包括 试剂S y l o n B F T由含 I T MC S(三甲基 提取 和j；生等。氯硅烷)的B S T F A(双三甲基硅三氟乙 酰 胺)组 成，添 加 2 0 0,u l 此溶 液至样 品 溶液 中，7 0 F 保温 4 5 mi n。衍生 化重 要的一点需 要注意的是要考 虑到样 品的 基 质如 何很好的与试剂进 行反应。如果 聚 氰 胺 是 种 富 含 氮 工 业 化学

2、 质，还是 含有其他非 蛋白质氮元素。一 衍生化 样品肇质富 含氯基酸，那 么有 必 品，有 多种 用途，最 常 cfl 9 -用 t-,$11 造 旦检 出产品中含有任何三聚 氰胺或其类 要加入 少量 样品或者更 多的试剂 进行反 三聚氰胺树 脂一 种非 常耐 用的聚 合 似物，此产 品即刻标示 为掺假物 不允许 应，以补偿氯基酸对 S y l o n B F T的消耗，物。在 2 0 0 7年 春季 北 美地 区，自从有 非法 出售。美国食 品药监 局(F D A)目 还 可能 需 要 进 行一 些 条 件性 实验。内 报道表 明出现在 小麦 麸质中的三聚氰胺 前的分 析方法仪涉 及对 二

3、聚氰胺及其类 标物(1 S T D)为 2，6 一 二 氯基 一 4 一 氯嘧 啶 可能引起宠物猫和狗的肾衰竭之后，似物的定性判断和半定量估算。(DACP)，用于监测衍生化过程，糟糕 三聚氰胺这一名字很快被人们所知。进 的ra标回收率预示着衍生化反应进行的 一步的研究结果令 科学家们相信就是这 实验部分 不够完全，很有可能是由 残留 的水或活 些三聚氰胺 及其类似物 j聚氰酸 整 个实 验 包 括 三 个主 要 部表 1气相色谱条件 酰胺、三聚氰酸一酰胺 及三聚氰酸综合 分：提取、衍生和 G C MS分析，气相色谱仪 P e r k in E l m e r C l a ms 5 0 0 G

4、C 导 致 宠 物 生 病。为 完 成 对 宠 物 饲 料 原 这 些 方 法 严 格 参 考 s F D A 出 版 分 析 角 韭 梓 E lite-5 M S 材料的 需要f 贝 jJ 定三聚氰胺是否 被 发行自 勺 f 贝 I 法。如 上 m m 。故意添加至小麦麸质假冒蛋白质 以提高 从干燥蛋白质原 料中提取三 进 辑口 温度 2 8 o 蛋白检测含量。【矧为工!lk 标#fl g x自含 聚氰胺相对比较简单，取 0 5 g样 进样方式 不分流 量测试仅仅通过氮含 量测试 推断蛋白含 品置于2 0 m l 按 1 0：4 0：5 0 体积比 进 样 针容 积 5 量，而j聚氰胺正好是

5、一个廉价的含氮 制戍的_ 二 乙胺(D E A)、水和乙进 样 够 0 5 M 丰富的原料，如果采用 定氮方式测量蛋 腈混合溶液中 超声提取3 0 m i。进 度 速 白含量，添加 兰聚氰胺 蛋白含量的测试 超声提取 后置干 3 5 0 0 r mi n下 离 三 l i 结果就会 显著增加。心I O m i n，以去除样品基质中 温 度 持 续 时 间 速 率 会延 军 细 颗 黼 一序 o o lm in，1。0C m inP T F E PT F E 2 10 X2 Im in m in 会 延 伸 到 对 各 种 不 同 类 型 干 蛋 白 粉 原 料 滤 膜 过 滤，作 为 首 选

6、3o 的关注，无论这些干 蛋白粉是 作为动物 材料 是因为食 品类型基 质中的很 3 0 0 C l O m i n n 饲料 还是人类食 品原料。显著 的事实和 多化合物容 易被其他材料滤膜 吸 仪器时间事件-0 5 m S p l =0 ml m i n 潜 在的公众健康危害性促使 美国食品药 附。经滤膜过 滤后，取 2 0 0 u 1 溶 “s p I“监局(F DA)迅速发行关于蛋白原料中 液住 7 0 温度置于干燥清洁氮表 2 质谱分析条件 三聚氰胺分析的标准测试方 法。此方法 气气流下干 燥蒸发，干燥之后 的 零 谱 P e rk in E Im e r C la m s 5 0

7、0 M S 命 名为：“G c MS方法 筛 查 i聚 氰 眩、样品等待衍生化处理。度 三聚氰酸二酰胺、=聚氧酸一酰胺及三 干燥的样品置于自动进样 数 据 桌 集方 式 l全 扫 描 聚氰酸”，它与定氮 法测试蛋白含量 器I 1、瓶里，加入2 0 0 g l 吡啶和 叁 描 范 围 5 o 5 o u 相结合确定原材料是否确实富含蛋白 1 0 0 g l 浓度为0 5 g g m l 的内 标溶 溶 剂 延 这 6 _ n 液。三聚氰胺和相关化合物被 全 扫 0。2 s 昌 珀 司 提 镇 衍生化试_卉 lj S y l o n B F T(S la p e l c o)扫 描 时间 间 隔0

8、 0 5 s 4 6 实验与分析 0 1 1 2 0 0 8 维普资讯 http:/ j 0 j f 一 图 1 T MS 一 衍 生化三 聚 氰胺 及 类似 物加标 0 1 t g m1 分析 色谱 图。图 2，大 米 蛋 白粉 末 显示 掺 假 物，三 聚 氰 胺及其 4种类似化合物大峰检 出。性基质 引起的。本 文采用的 GC MS系统是 P e r k i n E l me r Cl a r u s 5 0 0 G C MS，仪器设置的 参 数总 结 于表 1和 表 2。GC采 用可 程 序升温的分流 不分流 进样 口，2 8 0 C恒 温。衬管采用 2 mm内径的，进样体积 为 0

9、5 1 t l，与溶剂在进样口衬管内膨胀体 积相 匹配，更大体 积的进样量将导致 溶 剂由衬管中膨胀溢出，若溶剂膨胀体积 超过衬管容积，色谱峰形会变差。本文采 用的优化的仪器分析条 件用 于分析大米 蛋白中的三聚氰胺，在 这个 分析案例中，有必要延长 GC柱温箱程 序以便于将三聚氰酸 二酰 胺和三聚氰胺 从样品基质峰 中分离 出来。根据样 品基 质 复杂 程度 的变化，可 能需要 修改 G C 分析条件以达到分析物 与干扰基 质之 间 的分离，达到更好分 离效果的修正方法 必须基于 每种不 同的 基质。匹配 不同基 质分离的最好技术是将空白加标与样品 加标对比。如果样品基质中的杂质峰流 出时

10、间不同于分析物的保 留时 间，就 不 需要对方法进行修改。当然，如果存在 样品 基质峰 与 目标分 析物 共流 出现 象，就需要对 G C柱温升温 条件进 行修改以 达 到更好 的分离。在 这个方法 中，MS扫 描 质量 范 围 为 5 0 4 5 0 la，全 扫描 方 式 采 集 质谱 数 据。质谱 数 据帮 助 所 有 分析 物 的 定性 确认。传输线和离子源的温度分别设 为 2 8 0 和 2 3 0。将 扣除 了背 景的高 浓 度 标 准 品分 析 的 质谱 图 作 为化 合物 定性 的参考。结果 如前所述，一旦检 测到三聚氰胺或 其类似物就表 明该产 品为掺假 品，不得 作为食品或

11、食品添加剂非法出售。由于 对食品行业存在潜在的经济影晌，对人 与动物的健康 存在潜在威胁，测试数据 必须有严格 的质量控制(Q C)以确保结 果的准确性。除了高低浓度水平的标准 样品测试，此方案 的质量控制还 包括溶 剂空 白、方法 空 白和样 品加 标：溶剂空 白指嘧啶 溶剂 分析和衍生 化试 剂分析；方法空白指不加标样品经过提取过程后 分析；样 品加标 包括低浓度和 高浓度加 标。尽管这是一个过 与不过筛选式 方案，仍然 需要在样 品批 量分析前 和后 进行低 浓 度(0 1 la g m1)和 高 浓 度 f 1 0 la g m1)校准样分析用于确定半定量分析结果。图 1为低浓度标样分

12、析的色谱图。从图 中可 见，即使是 低浓度水平，分 析物晌、Sa m n l e al s i$；一：=二 =_二 二：三 ：i 二=：图 3 标样 与样 品 中三 聚 氰胺(t r i TMS)质 谱 图对 比。0 1 2 0 0 8实 验 与分 析 应仍然很显著G c Ms能够提供足够 的 灵敏度。正如在实验描述部 分讨论的，样品 基 质在进 行掺 假蛋 白分析时 会遇到非常 广泛 的干 扰，因此 必须修改 GC柱温箱 升温程序将三聚氰胺及相关 目标化合物 与干扰基 质峰 分离开来。另外一 个降低 基质影响 的办 法是提取 少量样 品。提取 少量样 品可以 降低样品基质 中高 沸点化 合物

13、 对 GC MS系统 的影响。由于样 品 量 减少，势 必需要 提高 GC MS的 灵敏 度来检测低浓 度水平样 品。S I F I(选择 离子扫描与全扫描)是一种 MS数据采 集 方式，在此模式 下，全扫描与选择离 子 扫描 同时进行，这样 不仅 可以达到最 大的灵敏度，还保持了全扫描数据的采 集。本 方法 中全扫描方式 已经提 供足够 的 灵敏 度，但是某些情 况下可能需要更 高的 灵敏度，S I F I 就能满足。本方法不仅分析 了标 准样品和质量 控制样品，还分析了大量蛋白质原料样。图 2 是一张大米蛋白样品的分析图，其中 掺假物呈现高浓度水平。在这个样品中存 在很高 浓度的污染，正好

14、体现 了之前讨 论的质量控制程序的有效性。内标化合物 D AC P验证 了衍生化反应 已经进行完全，样品中D A C P的峰面积与标准样中D A C P 峰面积相当。在这个分析案例中，标准样 中 DAC P的平 均峰面积为 6 4 3，1 6 1，样 品 中 D AC P平均 峰面积 为 6 4 6，5 8 5，表 明衍生化反应已经进行完全。在 图 2中该 样品污染到色谱柱容量 过载的程度，色谱 柱容量过载可通过 拖 尾的色谱峰和 及三聚氰酸与三聚氰酸一 酰 胺漂移 的保 留时 间看 出。此外，此样 品需要重新进行提取分析，而且只能提 取更少量样 品是 因为 目标分析物 的响应 也超出了低浓度

15、和高浓度的标样响应范 围。相比其他 目标 类似物和样 品基质 二 三 聚氰胺 被检测 出很 低浓 度水平，GC的 方法进行优化之 后，三聚氰胺的峰可以 完全 从周围干扰峰 中分离 出来，易于辨 下转第4 9页 4 7 艇 、一。一 一 维普资讯 http:/ ：j b 0 7 日 0 图 1 V e n u s i l AS B 色谱枉 分 离三 聚氰胺 的 谱 图。表 1 P C X柱回收率 m。一 空白 OOl I I 6 -O l l O8 O5 9 2 2 9 6 农业部公布的三聚氰胺检测方法，采用 艾杰 尔(Ag e l a)AS B系 列亲水 色谱柱，可 以得到 良好的分离效果，分

16、析色谱图 见 图 1。由表 1 可 以 看 出：用 P C X 拄净 化 样 品，可 以得到满意的 回收 率，此方法 处理样 品，比 F D A 公布的 前 处理 方法 更加准确、可靠。三 燮 蠢 胺 分 析 至 盈 1 2 3 5 6 7 m。莉。”呲U 2 A S B C1 8 2 5 0 e 2 图 2 L C MS方 法检 测三 聚氰胺 的谱 图。三 聚氰胺 L c Ms检测方法 由于 F D A 公布 的 HP L C uv方 法 中，流动相 添加 了离子 对试 剂，因此 限 制 了液 质联用方法 的使 用；但不 用离 予 对 试 剂 色谱 方 法，三 聚氰 胺 在 传统 的 C1

17、8柱 上保 留很 差，不能得到 较好的分 离定量。基 干此问题，艾杰 尔科技 公 司 自主 开发 r 新的 方法，采用艾杰 尔(Ag e l a)AS B系列亲水 色谱柱，不用离子对 i 式 剂 也能得到有 效的保 留与分 离。因此方法 中流动相不含离子对 试剂，可以 用于 质 谱检测。与 F D A2 0 0 7 年 4月公布的(U p d a t e d F C C D e v e l o p me n t a l Me l a mi n e Qu a n t i tat i o n (H P L C L J v)相比较，该方法大大降低 了最低检测限(MS D 0 5 p p m U V

18、2 p p m)，提高 了检测 灵敏 度。以该 方法 得到的谱 图见 图 2。L C MS方法小结 该 方 法具 有 以下 优 点，检 测 过程 简便：无须添加 离子对试 剂，三聚氰 胺 就 可得到 良好的 保留与分 离，避免 了配 制 离子对流动相 的复杂过程；提高 了检 测的灵敏度：无离子对试剂，可以 用于 质谱 检 测 器，大 大 降 低 了最 低 检 测限(MS D：0 5 p p m；Uv：2 p p m)；降低了 检 测成本：不用 离子对试剂，就 再需 要 买价 格较贵的 离子对试 剂 了，从而 降 低 了检测成本；延长 了色谱柱的使 用寿 命：避 免了使用离子对试 剂减少色谱拄

19、寿命的影响；该方法所使 用的色谱柱具有 通用性：无论是用 F DA方法、中国农业 部部颁标准方法和本公司开发的 L C MS 方法，使用艾杰尔(Ag e l a)AS B系 列亲 水 色谱柱均能得到一个很好 的检测结果，从而给客户提供了多种选择空。上接第4 7页 认。加上 与标 准谱 图的对 照，可 以帮助 三聚氰胺 的定性。3显示 r 聚氰 胺 标样质谱嗣与样品分析质谱 的对比，质谱图和保留时 日 J 都非常 匹配。结论 全 世界 范围 有人量蛋 白原料 被用 于食品和饲料，最近 三聚氰胺 及其 类 似物掺假蛋白促使 了对蛋白食品和饲料 成分更详细分析测试 的需要。这 个分析 是非常重要的，

20、它可以检测 到 一些通用 的掺假物，与总氮测试相结 合可以验证 0 1 2 0 0 8 实验 j 分 析 食品产品中真实的蛋白含量。本 文阐述 了基于新出版的“S F D A 方法建立的 三聚氰胺及其类似物 的分析 方案，包括样品前处理和仪器分析技 术。样 品前处理包括 溶剂萃取和衍 生化，内 标 化合物作 为基质衍生化过程指 示剂验 证衍生 化反应是 否进行完全。G C MS分 析 是一种半定量 筛选方法，低浓 度和 高 浓度标样支持样品分析。除标样分析外，多次空白和基质加标分析用于整个测试 的 质量控制。C l a ms GC MS系统 可在 全 扫描模式下检测到低浓度加标掺假物，意味着可 达到 日常复杂样 品基 体筛选分 析要求的预期灵敏度。粒【参考文献】f j J h 印 ：g o -m 彻 F d R e c a A Q h t m f 2 j B a r b o z a Da v i d,。A n o th e r C h e mi c a l E me r g e s m Pe t Fo o dCa s e Ne w Y o r k T i me s,Ma y 9 2 l 3 j h t tp：www,d a g o v c v m Me l a mi n e P r e s e n c e htm 4 9 维普资讯 http:/