蔗糖酶米氏常数的测定.ppt

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1、【目的目的】：了解底物浓度与酶反应速度间的关系，学习求：了解底物浓度与酶反应速度间的关系，学习求蔗糖酶米氏常数的方法蔗糖酶米氏常数的方法【原理原理】：米氏方程式：米氏方程式 v=米氏常数的求法很多，最常用的是米氏常数的求法很多，最常用的是LineweaverBurk的的作图法作图法(双倒数作图法双倒数作图法)。米氏方程式可改写为下列倒数形式：米氏方程式可改写为下列倒数形式：选择不同的选择不同的s，测定相应的，测定相应的v，求出两者的倒数，以，求出两者的倒数，以1/s为横坐标，以为横坐标，以1/v为纵坐标作图，绘出一条直线，外推至为纵坐标作图，绘出一条直线，外推至横轴相交，横轴截距即为横轴相交，

2、横轴截距即为-1/Km。蔗糖酶米氏常数的测定蔗糖酶米氏常数的测定 VmaxSKm+SS1/2VMAXvVMAXKm底物浓度与反应速度关系曲线底物浓度与反应速度关系曲线 VmaxS V=Km+S 还原糖与还原糖与3,5-3,5-二硝基水杨酸二硝基水杨酸(DNS)(DNS)试剂反应：试剂反应：【仪仪器与器与试剂试剂】1.仪仪器：分光光度器：分光光度计计、恒温水浴、恒温水浴、试试管、吸管、秒表、管、吸管、秒表、坐坐标纸标纸2试剂试剂标标准葡萄糖溶液（准葡萄糖溶液（1 mg/mL）3%蔗糖溶液（蔗糖溶液（87.7 mM）0.2 mol/L NaAc缓缓冲溶液（冲溶液（pH4.6）0.5 mol/L N

3、aOH溶液溶液3,5-二硝基水二硝基水杨杨酸酸试剂试剂【操作步骤操作步骤】1葡萄糖标准曲线的制定葡萄糖标准曲线的制定管号管号012345葡萄糖标准液(mL)00.20.40.60.81.0蒸馏水(mL)2.01.81.61.41.21.03,5-二硝基水杨酸试剂(mL)3.03.03.03.03.03.0将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用，取出后立即用冷水冷却至室温，以蒸馏水稀释至冷水冷却至室温，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀。测，摇匀。测540nm处处A值。以葡萄糖含量（值。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，）为横坐标，A值为纵坐标作出标准值

4、为纵坐标作出标准曲线。曲线。取试管取试管8支编号，按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分别加入试管，支编号，按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分别加入试管，于于37水浴中保温水浴中保温10min。一定量酶液同一水浴中保温约。一定量酶液同一水浴中保温约10min。于各管中依次按同样间隔于各管中依次按同样间隔(0.5min)加入已保温过的酶液加入已保温过的酶液1.0mL，计时，立即计时，立即摇匀摇匀，在，在37中中准确准确温浴温浴5min。按同样次序和时间间隔，加入按同样次序和时间间隔，加入1mL 0.5mol/L NaOH，摇匀摇匀，终，终止反应。止反应。吸取反应物吸取反应物1.0mL，加入盛有，加入盛有3.

5、0mL 3，5-二硝基水杨酸试剂和二硝基水杨酸试剂和1.0mL水的试管中水的试管中混匀混匀，放入沸水浴中加热，放入沸水浴中加热5min，冷却后稀释，冷却后稀释至至25mL，摇匀，在，摇匀，在540nm比色测定比色测定A值。值。以以A值对应的葡萄糖量为相对反应速度，以值对应的葡萄糖量为相对反应速度，以1/S为横坐标，为横坐标，1/v为纵坐标作图，由图求出为纵坐标作图，由图求出Km值。值。2底物浓度和初速度底物浓度和初速度测定测定反应物终止反应活力测定数据处理管号3%蔗糖液(mL)醋酸缓冲液(mL)酶液(mL)1molLNaOH(mL)吸取反应物(mL)水杨酸试剂(mL)水(mL)A540底物浓度1/s1/1234567800.51.01.52.02.53.755.05.04.54.03.53.02.51.2501.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.03.03.03.03.03.03.03.03.01.01.01.01.01.01.01.01.0