酶引论教学用.ppt

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1、酶酶 引引 论论一、酶研究的简史（自学）一、酶研究的简史（自学）二、酶是生物催化剂二、酶是生物催化剂三、酶的化学本质三、酶的化学本质四、酶的命名和分类四、酶的命名和分类五、酶的专一性五、酶的专一性六、酶活力的测定六、酶活力的测定七、非蛋白质生物催化剂七、非蛋白质生物催化剂核酶核酶八、酶分子工程八、酶分子工程教学内容教学内容二、酶是生物催化剂(一)反应速率理论与活化能（自学）(二)酶通过降低活化自由能提高反应速率(三)酶还是偶联反应的介体(四)酶作为生物催化剂的特点（自学）催化效率高，用量少；催化效率高，用量少；降低反应活化能；降低反应活化能；不改变反应的平衡常数或反应前后的不改变反应的平衡常数

2、或反应前后的GibbsGibbs自由能。自由能。酶与非生物催化剂相比的几点共性：Transition stateEnzyme-transitionstate plex(二)酶通过降低活化自由能提高反应速率酶是怎样克服能障,降低活化能的?酶降低反应的活化自由能可从熵和焓两个方面来考虑：酶降低反应的活化自由能可从熵和焓两个方面来考虑：根据：根据：邻近效应和定向效应邻近效应和定向效应邻近：双分子酶促反应中两个底物分子被束缚在酶分邻近：双分子酶促反应中两个底物分子被束缚在酶分子的表面使之彼此接近子的表面使之彼此接近;定向：两底物反应基团之间和底物反应基团与酶催化定向：两底物反应基团之间和底物反应基团与

3、酶催化基团之间的正确定位取向。邻近和定向的效果相当于基团之间的正确定位取向。邻近和定向的效果相当于增加了局部底物浓度和有效碰撞概率。增加了局部底物浓度和有效碰撞概率。熵因子方面熵因子方面:一般说一般说,两个底物分子形成一个活化复合体时两个底物分子形成一个活化复合体时,需要经历平动需要经历平动自由度和转动自由度的丢失自由度和转动自由度的丢失,造成熵的锐减造成熵的锐减,S S 负值负值,这这意味着将有一个大的活化自由能意味着将有一个大的活化自由能(G G),),显然对反应是不利显然对反应是不利的。但在酶促反应中自由度的丢失是在进人过渡态的。但在酶促反应中自由度的丢失是在进人过渡态(EX(EX)之之

4、前形成前形成ESES中间复合体时发生的中间复合体时发生的,并由酶与底物非共价结合时释并由酶与底物非共价结合时释放的自由能放的自由能,称为结合称为结合 自由自由 能能(binding energy,(binding energy,G Gb b),),补补偿了自由度丢失引起的熵减偿了自由度丢失引起的熵减,因此进人过渡态时的因此进人过渡态时的S(S(绝绝对值对值)减小减小,从而从而GG比非催化反应时降低。比非催化反应时降低。熵因子方面熵因子方面:对多数反应来说对多数反应来说,底物进人过渡态时都会发生形变底物进人过渡态时都会发生形变,反应键被拉长、反应键被拉长、扭曲扭曲,处于电子应变或电子张力状态。底

5、物形变需要给反应系统处于电子应变或电子张力状态。底物形变需要给反应系统提供能量提供能量(H)。但在酶促反应中底物形变所需的能量也是由。但在酶促反应中底物形变所需的能量也是由F和和S之间形成弱相互作用时释放的结合自由能之间形成弱相互作用时释放的结合自由能(内能内能)提供的提供的,因而因而减少了进入过渡态减少了进入过渡态(EX)所需的所需的H。底物与酶结合的同时底物与酶结合的同时,通常酶分子也发生形变或构象变化通常酶分子也发生形变或构象变化,以以“迎合迎合”底物进人过渡态时的需要底物进人过渡态时的需要,即所谓诱导契合。诱导契合使酶分子即所谓诱导契合。诱导契合使酶分子上的催化基团进人适当位置上的催化

6、基团进人适当位置,包括向底物提供广义酸碱催化和共价包括向底物提供广义酸碱催化和共价催化的基团催化的基团,以削弱反应键以削弱反应键,这也是减少这也是减少H的一种方式。的一种方式。焓因子方面焓因子方面:底物形变和诱导契合涉及活化焓底物形变和诱导契合涉及活化焓H的降低的降低一、酶研究的简史（自学）一、酶研究的简史（自学）二、酶是生物催化剂二、酶是生物催化剂三、酶的化学本质三、酶的化学本质四、酶的命名和分类四、酶的命名和分类五、酶的专一性五、酶的专一性六、酶活力的测定六、酶活力的测定七、非蛋白质生物催化剂七、非蛋白质生物催化剂核酶核酶八、酶分子工程八、酶分子工程教学内容教学内容三、酶的化学本质除了有催

7、化能力的除了有催化能力的RNA之外，几乎所有的酶都是蛋白质。之外，几乎所有的酶都是蛋白质。酶的经典概念：酶是具有催化功能的蛋白质，因此酶具有酶的经典概念：酶是具有催化功能的蛋白质，因此酶具有蛋白质的一切共性。蛋白质的一切共性。(一)酶的化学组成(二)酶的四级缔合分成简单蛋白和缀合蛋白分成简单蛋白和缀合蛋白;有些酶仅由蛋白质组成，例如，脲酶、溶菌酶、淀粉酶、有些酶仅由蛋白质组成，例如，脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等脂肪酶、核糖核酸酶等;有些酶除含蛋白质有些酶除含蛋白质(酶蛋白酶蛋白)外，还含非蛋白质成分外，还含非蛋白质成分(辅助辅助因子因子)，酶蛋白，酶蛋白+辅助因子辅助因子复合物复

8、合物,全酶全酶(holoenzyme)才表现出酶活性，如超氧化物歧化酶才表现出酶活性，如超氧化物歧化酶(Cu2+、Zn2+)、乳、乳酸脱氢酶酸脱氢酶(NAD+)（一）酶的化学组成酶的辅助因子主要酶的辅助因子主要:金属离子和有机化合物。金属离子和有机化合物。辅助因子分成两类辅助因子分成两类:辅酶辅酶(与酶蛋白结合较松，可透析除与酶蛋白结合较松，可透析除去去)和辅基和辅基(与酶蛋白结合较紧与酶蛋白结合较紧)酶蛋白决定酶专一性，辅助因子决定酶促反应的类型和酶蛋白决定酶专一性，辅助因子决定酶促反应的类型和反应的性质。比如，反应的性质。比如，NAD+可与多种酶蛋白结合，构成可与多种酶蛋白结合，构成专一性

9、强的乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异专一性强的乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶。柠檬酸脱氢酶。酶种类很多，辅助因子种类却很少，因一种辅助因子可酶种类很多，辅助因子种类却很少，因一种辅助因子可与多种酶蛋白结合与多种酶蛋白结合 酶的辅助因子单体酶：单体酶：一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子.多催多催化水解反应。如，牛胰化水解反应。如，牛胰RNase(单链单链)、鸡卵清溶菌酶鸡卵清溶菌酶(单链单链)、胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶(三条肽链三条肽链)寡聚酶：寡聚酶：由两个或两个以上亚基组成的酶，亚基可以相同由两个或两个以上亚基组成的酶，亚基可以

10、相同或不同，一般是偶数，亚基间以非共价键结合或不同，一般是偶数，亚基间以非共价键结合:相同亚相同亚基基，如苹果脱胱氢酶，如苹果脱胱氢酶(鼠肝鼠肝),2个相同的亚基个相同的亚基;不同亚基不同亚基，如琥珀酸脱氢酶（牛心），如琥珀酸脱氢酶（牛心），2个亚基寡聚酶中亚基的聚个亚基寡聚酶中亚基的聚合，有的与酶的专一性有关，有的与酶活性中心形成有关，合，有的与酶的专一性有关，有的与酶活性中心形成有关，有的与酶的调节性能有关。有的与酶的调节性能有关。(二)酶的四级缔合多酶复合体：多酶复合体：两个或两个以上的酶，靠非共价键结合而两个或两个以上的酶，靠非共价键结合而成，催化一个连续反应系列，构成一个代谢途径或代

11、谢成，催化一个连续反应系列，构成一个代谢途径或代谢途径一部分。如脂肪酸合成酶复合体、丙酮酸脱氢酶复途径一部分。如脂肪酸合成酶复合体、丙酮酸脱氢酶复合体等；合体等；多酶融合体：多酶融合体：一条多肽链上含有两种或两种以上催化活一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，这往往是基因融合的产物。如：天冬氨酸激酶性的酶，这往往是基因融合的产物。如：天冬氨酸激酶I高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶I融合体（双头酶）该酶是四聚体融合体（双头酶）该酶是四聚体4，每条肽链含两个活性区域：每条肽链含两个活性区域：N-端区域是端区域是Asp激酶，激酶，C端区端区域是高域是高Ser脱氢酶。脱氢酶。(二)酶的四级缔合(一)

12、酶的命名(二)酶的分类和编号四、酶的命名和分类(一)酶的命名依据底物来命名，如蛋白酶、淀粉酶。依据底物来命名，如蛋白酶、淀粉酶。依据催化反应的性质命名，如：水解酶、转氨酶依据催化反应的性质命名，如：水解酶、转氨酶结合上述两个原则命名，琥珀酸脱氢酶。结合上述两个原则命名，琥珀酸脱氢酶。有时加上酶的来源，如：胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶有时加上酶的来源，如：胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶将酶的来源与作用底物结合起来命名。例如，酶作用底物分将酶的来源与作用底物结合起来命名。例如，酶作用底物分别为淀粉和蛋白质，来源于细菌时，分别称为细菌淀粉酶和别为淀粉和蛋白质，来源于细菌时，分别称为细菌淀粉酶和细菌蛋白酶。细菌

13、蛋白酶。1961年以前使用的酶沿用习惯命名年以前使用的酶沿用习惯命名1.习惯命名习惯命名2.系统命名系统命名1.习惯命名 将酶作用的最适将酶作用的最适pH和作用底物结合起来命名。和作用底物结合起来命名。如，底物为蛋如，底物为蛋白质，最适白质，最适pH为中性的称为中性蛋白酶；最适为中性的称为中性蛋白酶；最适pH为碱性的称为碱性的称为碱性蛋白酶。为碱性蛋白酶。对于催化水解作用的酶。一般在酶的名字上省去反应类型。对于催化水解作用的酶。一般在酶的名字上省去反应类型。如，水解蛋白的酶称蛋白酶，水解淀粉的酶称淀粉酶。此外如，水解蛋白的酶称蛋白酶，水解淀粉的酶称淀粉酶。此外还有酯酶、脲酶、酰胺酶等。有时为厂

14、区别同一类酶，还可还有酯酶、脲酶、酰胺酶等。有时为厂区别同一类酶，还可以在酶的名称前面标上来源。如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜以在酶的名称前面标上来源。如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白药等。蛋白药等。酶的习惯名称使用起来比较方便，但也比较混乱，往往出现酶的习惯名称使用起来比较方便，但也比较混乱，往往出现一酶数名的现象，例如，一酶数名的现象，例如，-淀粉酶，又名为液化型淀粉酶或淀粉酶，又名为液化型淀粉酶或糊精淀粉酶或淀粉糊精淀粉酶或淀粉-1，4-糊精酶。糊精酶。系统名称应明确标明酶的底物及催化反应的性质。系统名称应明确标明酶的底物及催化反应的性质。如：草酸氧化酶如：草酸氧化酶(习惯名习惯名)，系统名称

15、：草酸，系统名称：草酸:氧氧化酶。氧氧化酶。又如：谷丙转氨酶又如：谷丙转氨酶(习惯名习惯名)，系统名：丙氨酸，系统名：丙氨酸:-:-酮戊二酮戊二酸氨基转移酶酸氨基转移酶若底物之一为水，则水省略若底物之一为水，则水省略2.国际系统命名（二）酶的分类法及编号（二）酶的分类法及编号（EC编号）编号）原则：按性质分为六类，分别用原则：按性质分为六类，分别用1 1、2 2、3 3、4 4、5 5、6 6表示；表示；再根据底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类分为若干个亚类，再根据底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类分为若干个亚类，编号用编号用1 1、2 2、33，每个亚类又可分为若干个亚亚类，用编

16、号，每个亚类又可分为若干个亚亚类，用编号1 1、2 2、33表示；表示；每一个酶的编号由每一个酶的编号由4 4个数字组成，中间以个数字组成，中间以“”隔开。第一个数字表示隔开。第一个数字表示大类，第二个数字表示亚类，第三个表示亚大类，第二个数字表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个数字表示在亚类，第四个数字表示在亚亚-亚中的编号。亚中的编号。第一个数字表示大类：氧化还原；第一个数字表示大类：氧化还原；第二个数字表示反应基团：醇基；第二个数字表示反应基团：醇基；第三个数字表示电子受体：第三个数字表示电子受体：NAD+或或NADP+；第四个数字表示此酶底物：乙醇，乳酸，苹果酸。第四个数字表示此酶底物

17、：乙醇，乳酸，苹果酸。前面三个编号表明这个酶的特性：反应性质、底前面三个编号表明这个酶的特性：反应性质、底物性质（键的类型）及电子或基团的受体，第四物性质（键的类型）及电子或基团的受体，第四个编号用于区分不同的底物。个编号用于区分不同的底物。国际系统分类法及编号国际系统分类法及编号 举例举例一、酶研究的简史（自学）一、酶研究的简史（自学）二、酶是生物催化剂二、酶是生物催化剂三、酶的化学本质三、酶的化学本质四、酶的命名和分类四、酶的命名和分类五、酶的专一性五、酶的专一性六、酶活力的测定六、酶活力的测定七、非蛋白质生物催化剂七、非蛋白质生物催化剂核酶核酶八、酶分子工程八、酶分子工程教学内容教学内容

18、五、酶的专一性(一)酶对底物的专一性(二)关于酶专一性的假说旋光异构旋光异构几何异构两种几何异构两种绝对绝对相对相对结构专一性结构专一性立体异构专一性立体异构专一性酶的专一性酶的专一性专一性可分为两种类型：(一)酶对底物的专一性结构专一性：绝对专一性和相对专一性结构专一性：绝对专一性和相对专一性绝对专一性：绝对专一性：一种酶只能催化一种底物使之发生特定的一种酶只能催化一种底物使之发生特定的反应。如淀粉酶只能催化淀粉水解，不能催化淀粉以外反应。如淀粉酶只能催化淀粉水解，不能催化淀粉以外的任何物质发生水解。脲酶、琥珀酸脱氢酶、的任何物质发生水解。脲酶、琥珀酸脱氢酶、DNA聚合聚合酶酶I、碳酸酐酶、

19、麦芽糖酶等、碳酸酐酶、麦芽糖酶等 相对专一性：相对专一性：催化具有相同化学键或基团的底物进行某催化具有相同化学键或基团的底物进行某种类型的反应。对键两端的一个基团有要求的为种类型的反应。对键两端的一个基团有要求的为“族专一族专一性或基团专一性性或基团专一性”，如，如-葡萄糖苷酶，要求糖苷键和葡萄糖苷酶，要求糖苷键和-葡葡萄糖；只对化学建要求的为萄糖；只对化学建要求的为”键专一性键专一性”，如脂酶催化脂，如脂酶催化脂键的水解，对底物中的键的水解，对底物中的R及及R基团却没有严格的要求。此基团却没有严格的要求。此外，各种蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶、二肽酶等。外，各种蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶、二肽酶等。立

20、体异构专一性：旋光异构专一性和几何异构专一性酶只能作用于其中的一种异构体酶只能作用于其中的一种异构体(D-或或L-构型构型)，相当普遍的现象。，相当普遍的现象。如：如：Glu脱氢酶对脱氢酶对L-Glu，L-氨基酸氧化酶，蛋白水解酶通常对氨基酸氧化酶，蛋白水解酶通常对L-型氨基酸构成的肽；乳酸脱氢酶只催化型氨基酸构成的肽；乳酸脱氢酶只催化L-乳酸，对乳酸，对D-乳酸不起乳酸不起作用。作用。几何异构专一性：几何异构专一性：trans-、cis-。延胡索酸水化酶只能反式水合。延胡索酸水化酶只能反式水合。手性原对称性碳原子：连接的手性原对称性碳原子：连接的4个基团中只有两个基团相同的个基团中只有两个基

21、团相同的对称性碳原子。对称性碳原子。旋光异构专一性：旋光异构专一性：NADH烟酰胺烟酰胺C4（手性原碳）的两个（手性原碳）的两个H原子原子,一个是一个是R-原（原（Pro-R）的（）的（HR）一个是）一个是S-原（原（Pro-S）的（）的（Hs）R-原原(或或S-原原)H原子是指如果增加它的优先性，例如用原子是指如果增加它的优先性，例如用D(氘氘)替代替代H时，则与之连接的手性原碳时，则与之连接的手性原碳(如还原型烟酰胺如还原型烟酰胺C4)变变成成R-型型(或或S-型型)手性碳。手性碳。酶能区别手性原对称性碳原子的两个相同基团酶能区别手性原对称性碳原子的两个相同基团(或原子或原子)：NADH烟

22、酰胺烟酰胺C4（手性原碳）的两（手性原碳）的两个个H原子为例：原子为例：辅酶辅酶I(NAD+)或或 辅酶辅酶II(NADP+)，脱氢或加氢都发生在烟酰胺，脱氢或加氢都发生在烟酰胺C4上。上。一类脱氢酶专门作用于一类脱氢酶专门作用于R-原原H原子，原子，如醇脱氢酶和苹果酸脱氢酶等，称如醇脱氢酶和苹果酸脱氢酶等，称为为A型脱氢酶；型脱氢酶；另一类专作用于另一类专作用于S-原原H原子，如谷原子，如谷氨酸脱氢酶，氨酸脱氢酶，-甘油甘油-3-磷酸脱氢酶，磷酸脱氢酶，称为称为B型脱氢酶。型脱氢酶。酶能区别手性原对称性碳原子的两个相同基团酶能区别手性原对称性碳原子的两个相同基团(或原子或原子)：(二)关于酶

23、专一性的假说“锁钥锁钥”模型（刚性模板学说）：模型（刚性模板学说）：三点结合学说：底物分子与酶活性中心的基团必须三点都互补三点结合学说：底物分子与酶活性中心的基团必须三点都互补匹配，酶才作用于这个底物。匹配，酶才作用于这个底物。诱导楔合模型：酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分诱导楔合模型：酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应础上互补楔合，进行反应一、酶研究的简史（自学）一、酶研究的简史（自学）二、酶是生物催化剂二、酶是生物催化剂三、酶的化学本质三、酶的化学

24、本质四、酶的命名和分类四、酶的命名和分类五、酶的专一性五、酶的专一性六、酶活力的测定六、酶活力的测定七、非蛋白质生物催化剂七、非蛋白质生物催化剂核酶核酶八、酶分子工程八、酶分子工程教学内容教学内容六、酶活力的测定 (一一)酶活力、活力单位和比活力酶活力、活力单位和比活力 (二二)反应速率、初速率和酶活力测定反应速率、初速率和酶活力测定(一)酶活力、活力单位和比活力酶活力或酶活性：酶活力或酶活性：催化某一化学反应的能力。代表酶的量。催化某一化学反应的能力。代表酶的量。酶活力单：酶活力单：量度酶活力大小的单位。量度酶活力大小的单位。传统酶单位：传统酶单位：在一定的条件下，一定的时间内将一定量的底物

25、在一定的条件下，一定的时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量转化为产物所需的酶量(习惯单位习惯单位)。酶浓度可用单位体积的酶单位。酶浓度可用单位体积的酶单位数来表示，如数来表示，如U/mL,U/L等。等。1961，国际单位，国际单位(IU)作为酶活力单位：作为酶活力单位：1个酶的国际单位个酶的国际单位，常称，常称酶单位，是在规定的条件酶单位，是在规定的条件(温度一般为温度一般为25,其他为最适条件），每其他为最适条件），每分钟催化分钟催化1mol底物转化为产物的酶量。底物转化为产物的酶量。1972，推出酶活力单位，推出酶活力单位Katal(缩写缩写Kat)。1个个Katal 规定为在最规定为

26、在最适条件下，每秒钟催化适条件下，每秒钟催化lmol产物的形成所需的酶量产物的形成所需的酶量(mols-1)。1 Kat=6107IU。习惯单位不统一，。习惯单位不统一，但实际有它方便之处。但实际有它方便之处。酶的比活或比活力酶的比活或比活力 被定义为每毫克蛋白质所含的酶活力单位数被定义为每毫克蛋白质所含的酶活力单位数(U/mg)。比活代表酶的纯度。比活代表酶的纯度。(二)反应速率、初速率和酶活力测定在恒容系统中反应速率可以在恒容系统中反应速率可以用单位时间内反应物浓度的用单位时间内反应物浓度的变化率或产物浓度的变化率变化率或产物浓度的变化率来表示。对一个简单的非催来表示。对一个简单的非催化反

27、应：化反应：1.化学反应速率及其测定酶活力测定方法：分光光度法、荧光法最简便且灵敏，又便于自酶活力测定方法：分光光度法、荧光法最简便且灵敏，又便于自动化，可不干扰反应连续测。其他，如同位素测定法、电化学方动化，可不干扰反应连续测。其他，如同位素测定法、电化学方法必须在反应体系取样并终止反应才能进行。法必须在反应体系取样并终止反应才能进行。如果开始反应时溶液中如果开始反应时溶液中只有只有A存在，并已知它的初存在，并已知它的初始浓度为始浓度为A0，则原点，则原点(或或A0)的切线斜率为初速率的切线斜率为初速率(initial rate)或初速度或初速度(initial velocity)，即，即:

28、2.反应初速率的概念底物不是过量的，反应进程中它的浓度将显著减小，速率不断底物不是过量的，反应进程中它的浓度将显著减小，速率不断下降下降;反应明显可逆，逆反应速率将随产物浓度增加而上升，底物转反应明显可逆，逆反应速率将随产物浓度增加而上升，底物转化净速率将下降化净速率将下降;酶稳定性差且产物可能抑制酶活力酶稳定性差且产物可能抑制酶活力,酶活力下降，酶促反应速酶活力下降，酶促反应速率也随之变慢。率也随之变慢。反应速率随时间变慢的可能原因:准确反应酶的活性，最好是测定酶促反应初速率准确反应酶的活性，最好是测定酶促反应初速率v0，反应时间反应时间尽量短尽量短(一般不超过一般不超过5min)，底物浓度

29、变化不超过初始浓度的，底物浓度变化不超过初始浓度的5%时，产物生成量与时间几乎是正比关系，进程曲线的最早一段时，产物生成量与时间几乎是正比关系，进程曲线的最早一段是直线，因此一般不需要通过原点的切线求初速率。是直线，因此一般不需要通过原点的切线求初速率。3.酶活力的测定反应条件如温度、反应条件如温度、pH必须保持恒定，并说明；必须保持恒定，并说明；S 和和E辅因子须过量，辅因子须过量，S至少至少5倍于酶的倍于酶的KM。初速率初速率v0对对 S是零级反应，是零级反应，v0与与S无关，无关，v0对对E是一是一级反应。此时，每个酶分子完全被级反应。此时，每个酶分子完全被S所饱和，酶的催化所饱和，酶的

30、催化能力可以得到充分显示，酶浓度成为化学反应速率的唯能力可以得到充分显示，酶浓度成为化学反应速率的唯一限制因子。一限制因子。测定酶活力时通常需要作两条曲线测定酶活力时通常需要作两条曲线:酶反应进程曲线，确定求初速率的酶反应时间酶反应进程曲线，确定求初速率的酶反应时间(线性范围线性范围);酶浓度曲线，即酶浓度曲线，即v0作作E函数的曲线函数的曲线,确定成线性关系确定成线性关系E范范围围;待测样品待测样品E应在此范围内。应在此范围内。必须同时作一份对照必须同时作一份对照(control)或空白或空白(blank)。对照试验除在。对照试验除在反应前用煮沸或其他方法使酶变性失活外，空白试验除不加待反应

31、前用煮沸或其他方法使酶变性失活外，空白试验除不加待测酶外，一切与样品试验相同。测酶外，一切与样品试验相同。酶活力虽由酶催化的化学反应速率确定，但并不直接用反应速酶活力虽由酶催化的化学反应速率确定，但并不直接用反应速率表示。率表示。酶活力单位的量纲是两个物理量，即物质量酶活力单位的量纲是两个物理量，即物质量/时间；反应速率单时间；反应速率单位的量纲是位的量纲是3个物理量，即物质量个物理量，即物质量/(容积容积时间时间)。而酶浓度单位。而酶浓度单位的量纲与反应速率单位的量纲是一致的，因此反应速率直接代的量纲与反应速率单位的量纲是一致的，因此反应速率直接代表的是酶浓度。表的是酶浓度。酶活力的测定要说

32、明的几点问题(一)核酶的发现(二)L19RNA是核酶(三)RNaseP的RNA组分是核酶七、非蛋白质生物催化剂核酶1981，美，美 Cech T等发现原生动物嗜热四膜虫等发现原生动物嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)rRNA 前体能通过自前体能通过自我我剪接剪接(self-splicing)切去间插序列或内含子切去间插序列或内含子(intron),表明表明RNA也具有催化能力，称它们为核酶也具有催化能力，称它们为核酶(ribozyme)。Altman S等证明在高浓度等证明在高浓度Mg2+或或Mg2+加少量精胺的条件下加少量精胺的条件下,核糖核酸酶核糖核酸酶P(RNa

33、se P)的的RNA组分独自也具有加工组分独自也具有加工tRNA前体的催化活力。前体的催化活力。陆续发现一些植物的类病毒陆续发现一些植物的类病毒(viroid)和拟病毒和拟病毒(virusoid)和卫星和卫星RNA在复在复制过程中也能自制过程中也能自我我切割或自断裂切割或自断裂(selff-cleavage)和环化。和环化。生物体内一些重要的生物体内一些重要的RNA-蛋白质颗粒体如剪接体蛋白质颗粒体如剪接体(splicesome)和核糖体和核糖体(ribosome)等也可认为是核酶复合体。等也可认为是核酶复合体。(一)核酶的发现比较清楚的核酶：自剪接比较清楚的核酶：自剪接l组内含子组内含子(如

34、四膜虫的如四膜虫的Ll9 RNA),RNase P和锤头核酶。和锤头核酶。这些核酶的主要活性基于两个基本反应：转酯和磷酸二酯键这些核酶的主要活性基于两个基本反应：转酯和磷酸二酯键水解。核酶的底物经常是水解。核酶的底物经常是RNA分子或是核酶自身的一部分。分子或是核酶自身的一部分。当底物是当底物是RNA时时,核酶可以利用碱基配对相互作用使底物进核酶可以利用碱基配对相互作用使底物进人反应中心。核酶分子大小不一人反应中心。核酶分子大小不一,有有的链长超过的链长超过400 nt(核苷酸核苷酸),有的只有有的只有3040nt。核酶也具有。核酶也具有三维结构三维结构,它是催化功能所必需的。如果加热超过核酶

35、的熔解它是催化功能所必需的。如果加热超过核酶的熔解温度或加人变性剂温度或加人变性剂,核酶活性则丢失。核酶活性则丢失。核酶的发现突破了两个传统观念核酶的发现突破了两个传统观念:一是酶一定是蛋白质一是酶一定是蛋白质,二是二是RNA只是控制蛋白质合成的信息分子。只是控制蛋白质合成的信息分子。(二)L19RNA是核酶转酯反应在上游外显子转酯反应在上游外显子末端产生一个末端产生一个3-OH第二次转酯反应第二次转酯反应Ll9 RNA或或L19 IVS(linear minus 19 intervening sequence)即减即减19线状间插序列线状间插序列：核酶：核酶 四膜虫的四膜虫的rRNA前体前体

36、(6400nt)鸟苷鸟苷(G)或鸟苷酸或鸟苷酸(GMP)为辅因子：为辅因子：第二次转酯反应把两个外显子连第二次转酯反应把两个外显子连接起来形成剪接接起来形成剪接rRNA(成熟成熟rRNA),并释放出并释放出414nt内含子。内含子。自剪接除去一个自剪接除去一个15nt片片段段(含第一次参人的含第一次参人的G),形形成成399nt的环状内含子的环状内含子开环后再除去一个开环后再除去一个4nt,形成线状形成线状RNA(395nt),称为称为Ll9 IVSL19 RNA既是核糖核酸酶又是既是核糖核酸酶又是RNA聚合酶。催化聚合酶。催化C5水解的速水解的速率为非催化的水解速率的率为非催化的水解速率的1

37、010倍。倍。这表明在进化的最初阶这表明在进化的最初阶,RNA能能自我复制自我复制,无需蛋白质的参与。无需蛋白质的参与。这提示我们这提示我们,在地球上很可能先在地球上很可能先出现出现RNA催化剂催化剂,后来才有更完后来才有更完善的蛋白质催化剂。善的蛋白质催化剂。395nt线状分子线状分子(Ll9 RNA)仍具仍具G结合部位和引导序列结合部位和引导序列(guide sequence),在在体外能催化外部的底物如五胞苷酸体外能催化外部的底物如五胞苷酸(C5),使它转变为较长和较短的寡聚胞使它转变为较长和较短的寡聚胞苷酸。底物专一性强苷酸。底物专一性强:C5最好最好,U5 次之次之,A5 和和G5不

38、被催化。不被催化。L19 RNA的催化机制(三)RNase P的RNA组分是核酶RNase P 加工加工tRNA前体的内切核酸酶：蛋白质和辅因子前体的内切核酸酶：蛋白质和辅因子RNA两部分蛋白质部分两部分蛋白质部分(Mr 17 500)本身无活性本身无活性,而而RNA部分部分(称称Ml RNA,377nt)却具有专一断裂却具有专一断裂tRNA前体的能力。加入蛋白质部前体的能力。加入蛋白质部分虽然可提高催化活力分虽然可提高催化活力,但对底物的结合或断裂并不是必需的。但对底物的结合或断裂并不是必需的。核酶催化采取成线机制：磷原子处于五共价过渡态核酶催化采取成线机制：磷原子处于五共价过渡态,三角双锥

39、体的三角双锥体的一个顶端由进攻基团鸟苷一个顶端由进攻基团鸟苷3O占据占据,另一顶端由离去基团的另一顶端由离去基团的3O占据。占据。三角双椎体中进入基团和离去基团处于一条线的几何学称为三角双椎体中进入基团和离去基团处于一条线的几何学称为“成线成线”(in-line)。核酶催化中。核酶催化中Mg2+起关键作用起关键作用,它稳定离去基团它稳定离去基团3O上形成上形成的负电荷。的负电荷。例如例如,某些称为拟病毒的植物病原某些称为拟病毒的植物病原体体,含有小的含有小的RNA基因组基因组,通常需要通常需要其他病毒协助其复制和包装。这些其他病毒协助其复制和包装。这些RNA基因组就含有锤头结构片段基因组就含有

40、锤头结构片段或称锤头核酶或称锤头核酶,它由二股它由二股RNA链组链组成成,共共41个叱这是催化所需要的最个叱这是催化所需要的最小序列。锤头核酶能促进与复制有小序列。锤头核酶能促进与复制有关的、部位专一的关的、部位专一的RNA切割反应切割反应,反应需要反应需要Mg2+离子作为辅因子。离子作为辅因子。(四)锤头核酶1986,Symons R比较了几种自切割比较了几种自切割RNA结构后提出了锤头结构结构后提出了锤头结构(hammer head structure)模型模型:由由13个保守的核苷酸和个保守的核苷酸和3个螺旋区组成。后来被证明个螺旋区组成。后来被证明保守区只要有保守区只要有11个个nt甚

41、至更少一些也具有催化活性。甚至更少一些也具有催化活性。八、酶分子工程创造修饰的、人工模拟的、甚至全新设计的生物催化剂创造修饰的、人工模拟的、甚至全新设计的生物催化剂(一)固定化酶通常的水溶性酶经物理或化学方法处理使之与惰性载体通常的水溶性酶经物理或化学方法处理使之与惰性载体(如纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺如纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶等凝胶等)共价结合或包埋在凝胶网格或薄膜微囊中成为一种不溶性的酶制剂共价结合或包埋在凝胶网格或薄膜微囊中成为一种不溶性的酶制剂,称为固定化酶称为固定化酶(immobilized enzyme)。(二)化学修饰酶通过对酶分子的化学修饰可以改变酶的性能通过对酶分子的化

42、学修饰可以改变酶的性能,如催化效率、专一性和稳定性等如催化效率、专一性和稳定性等,以适应各方面以适应各方面的需要的需要酶的蛋白质工程酶的蛋白质工程(protein engineering)也称生物酶工程或高级酶工程。在基因工程基础上发也称生物酶工程或高级酶工程。在基因工程基础上发展起来。蛋白质工程是指通过对蛋白质已知结构和功能的了解展起来。蛋白质工程是指通过对蛋白质已知结构和功能的了解,借助计算机辅助设计借助计算机辅助设计,利用定利用定位诱变位诱变(site-directed mutagenesis)等技术在酶基因的水平上对蛋白质实行改造等技术在酶基因的水平上对蛋白质实行改造,包括核苷酸或包括

43、核苷酸或其片段的删除、插人、置换和改组以获得新基因其片段的删除、插人、置换和改组以获得新基因,希望表达出来的蛋白质或酶希望表达出来的蛋白质或酶,其性能符合人其性能符合人们对它的要求。们对它的要求。(四)酶的蛋白质工程(三)抗体酶人工模拟酶1946，鲍林鲍林(Pauling)用用过渡态理论过渡态理论阐明了阐明了酶酶催化的实质，酶能特异性结催化的实质，酶能特异性结合并稳定化学反应的过渡态合并稳定化学反应的过渡态(底物激态底物激态)，从而降低反应能级。，从而降低反应能级。1969，杰奈克斯，杰奈克斯(Jencks)在过渡态理论的基础上猜想：若抗体能结合反在过渡态理论的基础上猜想：若抗体能结合反应的过

44、渡态，理论上它则能够获得应的过渡态，理论上它则能够获得催化催化性质。性质。1984，列那，列那(Lerner)进一步推测：以过渡态类似物作为半抗原，则其诱进一步推测：以过渡态类似物作为半抗原，则其诱发出的抗体即与该类似物有着互补的构象，这种抗体与底物结合后，即发出的抗体即与该类似物有着互补的构象，这种抗体与底物结合后，即可诱导底物进入过渡态构象，从而引起催化作用。可诱导底物进入过渡态构象，从而引起催化作用。根据这个猜想列那和苏尔滋根据这个猜想列那和苏尔滋(PCSchultz)各自的研究小组独立地证明各自的研究小组独立地证明了：针对羧酸酯了：针对羧酸酯水解水解的过渡态类似物产生的抗体，能催化相应

45、的羧酸酯的过渡态类似物产生的抗体，能催化相应的羧酸酯和碳酸酯的水解反应。和碳酸酯的水解反应。1986，美国，美国Science同时发表了他们的发现，并将这类具催化能力的同时发表了他们的发现，并将这类具催化能力的免免疫球蛋白疫球蛋白称为抗体酶或称为抗体酶或催化抗体催化抗体。抗体酶抗体酶(abzyme)是用化学反应的过渡态类似物作免疫原产生的催化性抗体。是用化学反应的过渡态类似物作免疫原产生的催化性抗体。(三)抗体酶人工模拟酶能与对应抗体结合出现抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性

46、，又称不完全抗原。大多数多糖和所有的类脂原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖和所有的类脂都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种纯蛋白的分子（载体）结合，纯蛋都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种纯蛋白的分子（载体）结合，纯蛋白会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。半抗原一旦与纯蛋白结合，白会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。半抗原一旦与纯蛋白结合，就构成该蛋白质的一个抗原簇。就构成该蛋白质的一个抗原簇。1.了解酶的化学本质既可以是蛋白质也可以是了解酶的化学本质既可以是蛋白质也可以是RNA。2.了解酶促反应与非酶促反应的异同，理解酶降低活化自

47、由能提高应速率的原因了解酶促反应与非酶促反应的异同，理解酶降低活化自由能提高应速率的原因3.理解酶是偶联反应的介体，并了解酶作为生物催化剂的特点理解酶是偶联反应的介体，并了解酶作为生物催化剂的特点4.酶的化学组成与酶的四级缔合酶的化学组成与酶的四级缔合5.掌握酶的命名和分类的方法掌握酶的命名和分类的方法6.掌握酶的专一性，了解有关解释酶专一性的有假说掌握酶的专一性，了解有关解释酶专一性的有假说7.掌握酶活性及其酶纯度的表示方法以及测定酶活性的主要方法掌握酶活性及其酶纯度的表示方法以及测定酶活性的主要方法8.掌握以下名词掌握以下名词:底物、辅助因子、底物、辅助因子、辅酶、辅基、辅酶、辅基、脱辅酶

48、、全酶、单体酶、寡聚脱辅酶、全酶、单体酶、寡聚酶、多酶复合体核酶、自由能、结合能、活化能、过渡态或活化复合体、过渡酶、多酶复合体核酶、自由能、结合能、活化能、过渡态或活化复合体、过渡态类似物、反应中间物、酶活力、态类似物、反应中间物、酶活力、酶的比活力酶的比活力、核酶、。、核酶、。9.理解以下名词或术语的含义：碰撞理论、有效碰撞、平动能、能障、同源酶、理解以下名词或术语的含义：碰撞理论、有效碰撞、平动能、能障、同源酶、酶活性的调节、连续反应、限速步骤、的系统名称和推荐名称、酶工程、固定酶活性的调节、连续反应、限速步骤、的系统名称和推荐名称、酶工程、固定化酶、化学修饰酶、人工酶。化酶、化学修饰酶、人工酶。基本要求作业：第作业：第2、9题题