northern杂交.pptx

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1、Northern技术Northern技术简介Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法。Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。Northern blot 在1977年由斯坦福大学James Alwine，David Kemp和George Stark发明。Northern blotting实际上依照比它更早发明的一项杂交技术Southern blot（依据生物学家 EdwinSouthern 名字来命名）来命名.步骤1.RNA1.RNA的提取的提取2.2.

2、甲醛甲醛的琼脂糖凝胶上的琼脂糖凝胶上RNARNA电电泳泳3.RNA3.RNA转膜转膜(尼龙膜尼龙膜)4.RNA4.RNA探针制备探针制备5.5.预预杂交杂交6.Northern 6.Northern 印迹杂交印迹杂交7.7.放射性自显影检测放射性自显影检测 步骤按分子量的大小分离RNA检测RNA是否降解1.RNA1.RNA的提取的提取2.2.甲醛的琼脂糖凝胶甲醛的琼脂糖凝胶上上RNARNA电泳电泳3.RNA3.RNA转膜转膜(尼龙膜尼龙膜)4.RNA4.RNA探针制备探针制备5.5.预杂交预杂交6.Northern 6.Northern 印迹杂交印迹杂交7 7.放射性自显影检放射性自显影检测测

3、 步骤转移前胶在50mmol/L的NaoH中浸20min胶在20*SSC中浸40min 转膜方法:电转移法真空转移法细管虹吸印迹法1.RNA1.RNA的提取的提取2.2.甲醛的琼脂糖凝胶上甲醛的琼脂糖凝胶上RNARNA电电泳泳3.RNA3.RNA转膜转膜(尼龙膜尼龙膜)4.RNA4.RNA探针制备探针制备5.5.预杂交预杂交6.Northern 6.Northern 印迹杂交印迹杂交7 7.放射性自显影检测放射性自显影检测 步骤核酸标记同位素标记(P)地高辛标记探针:DNA探针cDNA探针RNA探针1 1.RNARNA的提取的提取2.2.甲醛的琼脂糖凝胶上甲醛的琼脂糖凝胶上RNARNA电电泳泳

4、3.RNA3.RNA转膜转膜(尼龙膜尼龙膜)4.RNA4.RNA探针制备探针制备5.5.预杂交预杂交6.Northern 6.Northern 印迹杂交印迹杂交7.7.放射性自显影检测放射性自显影检测 步骤预杂交目的:用非特异性的DNA分子及其他高分子化合物封闭待测核酸分子中的非特异性结合位点,以减少杂交时的非特异性反应.1.RNA1.RNA的提取的提取2.2.甲醛的琼脂糖凝胶上甲醛的琼脂糖凝胶上RNARNA电泳电泳3.RNA3.RNA转膜转膜(尼龙膜尼龙膜)4.RNA4.RNA探针制备探针制备5.5.预杂交预杂交6.Northern 6.Northern 印迹杂交印迹杂交7 7.放射性自显影

5、检测放射性自显影检测 步骤探针与RNA杂交1.RNA1.RNA的提取的提取2.2.甲醛的琼脂糖凝胶甲醛的琼脂糖凝胶上上RNARNA电泳电泳3.RNA3.RNA转转膜膜4.RNA4.RNA探针制备探针制备5.5.预杂交预杂交6.Northern 6.Northern 印迹杂交印迹杂交7.7.放射性自显影检测放射性自显影检测步骤在膜上压一张X线胶片,放于含增感屏的暗盒里,零下70度放射自显影24-48h(暗室中操作)1 1.RNA.RNA的提取的提取2.2.甲醛的琼脂糖凝甲醛的琼脂糖凝胶上胶上RNARNA电泳电泳3.RNA3.RNA转膜转膜(尼龙膜尼龙膜)4.RNA4.RNA探针制备探针制备5.5.预杂交预杂交6.Northern 6.Northern 印迹杂印迹杂交交7 7.放射性自显影检放射性自显影检测测 注意事项DEPC处理试剂和仪器虹吸法转膜时要防止有气泡,保鲜膜封闭凝胶四周,防止短路.应用分析DNA的转录产物mRNA测定mRNA分子量的大小