吉林大学HE染色.ppt

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1、 常规标本的制作和HE染色薛辉薛辉吉林大学基础医学院吉林大学基础医学院切片的一般程序封固封固石蜡切片石蜡切片取材取材固固定定(24-48h)脱脱水水(70,80%4h;90,95%2h,100%1h(2)透透明明(二甲苯二甲苯10min(2)浸浸蜡蜡(30min(3)包埋包埋切片切片染色染色显微标本制作技术显微标本制作技术从保存时间长短分，有临时玻片标本和永久玻片标本。从制作的方法从保存时间长短分，有临时玻片标本和永久玻片标本。从制作的方法来分，有涂片、压片、装片来分，有涂片、压片、装片(也叫整装法也叫整装法)、磨片和切片等、磨片和切片等。l切片法切片法l徒手切片法徒手切片法l石蜡切片法石蜡切

2、片法l火棉胶切片法火棉胶切片法l冰冻切片法冰冻切片法材料和夹持物材料和夹持物切取的标本1.1.徒手切片法徒手切片法 滴水滴水放置标本放置标本加盖盖玻片加盖盖玻片叶的横切叶的横切取取 材材 1.材材 料料 新新 鲜鲜 最最 好好 是是 动动 物物 的的 心心 脏脏 还还 在在 跳跳 动动 时时 取取 材材，立立 即即 投投 入入固固 定定 液液 内内。应应 争争 取取 在在 死死 后后 半半 小小 时时 内内 处理处理 完完 毕毕 2.组组 织织 块块 力力 求求 小小 而而 薄薄,以以 不超不超 过过 5毫毫 米米 为为 在在 可可 能能 范范 围围 内内 也也 应应 力力 求求 短短 小小。

3、以以 使使 固固 定液定液 能能 迅迅 速速 而而 均均 匀匀 地地 渗渗 入入 组组 织织 块块 内内 部部 3.勿勿 使使 组组 织织 块块 受受 挤挤 压压。取取 材材 时时，组组 织织 块块 可可 稍稍 取取 大大 一一 点点。4.要要 熟熟 悉悉 取取 材材 的的 部部 位位 要要 能能 准准 确确 地地 按按 解解 剖剖 部部 位位 取取 材材，如如 胰腺胰腺，一一 般般 取取 胰胰 岛岛 较较 多多 的的 胰胰 腺腺 尾尾 部部，脊脊 髓髓 取取 腰腰 膨膨 大大 与与 颈颈 形形 大大 5.选选 好好 组组 织织 块块 的的 切切 面面 纵纵 切切 或或 横横 切切 往往 往往

4、 是是 显显 示示 组组 织织 结结 构构 明明 晰晰 的的 关键关键。6.保保 持持 材材 料料 的的 清清 洁洁 组组 织织 块块 上上 如如 有有 血血 液液、污污 物物、粘粘 液液、食物食物、粪粪 便便 等等，可可 用用 生生 理理 盐盐 水水 冲冲 洗洗，然然 后后 再再 入入 固固 定定 液液，但但 要要 注注 意意 防止防止 组组 织织 损损 伤伤。l空腔性器官空腔性器官注意横断面和纵断面注意横断面和纵断面 保护内皮和粘膜保护内皮和粘膜横断：气管、食管、血管横断：气管、食管、血管纵断：胃底、肠、心脏纵断：胃底、肠、心脏心瓣膜心瓣膜左心室左心室左心左心房房l特殊的组织或者器官特殊的

5、组织或者器官血液、骨髓：涂片血液、骨髓：涂片肌肉、神经：肌肉、神经：骨、牙齿：脱钙骨、牙齿：脱钙 切片切片 酸固 定 的 方 法1.蒸 气 固 定 法 比 较 细 小 而 薄 的 标 本，可 用 饿 酸 或 甲 醛 蒸 气固 定。主 要 用 于 血 液 或 细 胞 涂 片 以 及 某 些 薄 膜 组 织 等 的 固。如血液 涂 片，则 应 在 血 片 未 干 燥 前 就 与 饿 酸 蒸 气 接 触2注 射、灌 注 固 定 法.某 些 组 织 块 由 于 体 积 过 大 或 固 定 掖极 难 渗 入 内 部 或 需 要 对 整 个 脏 器 或 整 个 动 物 进 行 固 定。如 肺 可 将 固

6、定 液 从 气 管 或 支 气 管 注 入入.全 身 灌 注 固 定 较 大 动 物如 兔、猫、狗、猴 及 整 个 人 体,固 定 液 输 入 后，可 不 必 即 刻 取 材。小 动 物，如 大、小 鼠，也可灌流固定.3.小 块 组 织 固 定 法.从 人 体 或 动 物 取 下 的 小 块 组 织，须 立即 置 入 液 态 固 定 剂 中 进 行 固 定，这 是 应 用 最 广 泛 最 经 常 的 方 法。固 定 的 目 的1.迅 速 阻 止 组 织、细 胞 的 死 后 变 化，防 止 自 溶 与 腐 败，使 之尽 量 保 持 生 前 的 状 态 与 结 构。2.使 细 胞 内 的 蛋 白

7、质、脂 肪、糖，酶 等 成 分 转 变 为 不 溶 性物 质，以 保 持 其 原 有 状 态。3.使 组 织 内 各 种 物 质 成 分 产 生 不 同 的 折 光 率，以 便 染 色 后 易于 鉴 别 和 观 察 4.使 组 织 块 在 脱 水、包 埋、切 片、染 色 等 过 程 中 不 易 损 坏。5使 不 同 组 织 成 分 对 染 料 有 不 同 的 亲 和 力，经 过 染 色 处 理 后易 于 辨 认。6.防 止 细 胞 过 度 收 缩 或 膨 胀 而 失 去 其 原 有 形 态 结 构。7.使 组 织 块 硬 化，便 于 制 作 薄 片。注 意 事 项 及 影响 固 定 的 因 素

8、1.组 织 块 不 宜 过 大，一 般 以 厚 度 5毫 米，长 宽 不 超 过 15x15毫 米。2.固 定 液 的 量 一 般 以 组 织 块 大 小 的 20倍 为 宜 3.必 须 选 择 渗 透 力 强，又 不 使 组 织 过 度 收 缩 或 膨 胀 的 试 剂做固定剂.石蜡切片标本的固定石蜡切片标本的固定l固定液：固定液：10%中性福尔马林中性福尔马林l固定时间：室温固定时间：室温3个小时，个小时，1个小时后修块。个小时后修块。l固定方法：固定方法：容器底部垫上脱脂棉或者滤纸。容器底部垫上脱脂棉或者滤纸。肺脏：液体表面覆盖脱脂棉。肺脏：液体表面覆盖脱脂棉。空腔脏器：浆膜面平铺在纸板上

9、用大头钉固定。空腔脏器：浆膜面平铺在纸板上用大头钉固定。胆囊放在单独的容器内。胆囊放在单独的容器内。脑、脊髓、松软的肿瘤、病变组织：先固定后切开。脑、脊髓、松软的肿瘤、病变组织：先固定后切开。脑最好悬吊在固定液中。脑最好悬吊在固定液中。睾丸、囊性组织：向腔内注入较高浓度的固定液。睾丸、囊性组织：向腔内注入较高浓度的固定液。骨骼标本：剥离软组织后锯成小块固定。骨骼标本：剥离软组织后锯成小块固定。垂体等较小组织：擦镜纸包好滴少量伊红标记后固定。垂体等较小组织：擦镜纸包好滴少量伊红标记后固定。冲洗和保存冲洗和保存经过长时间福尔马林固定和保存的组织要充分水经过长时间福尔马林固定和保存的组织要充分水洗，

10、否则影响核的染色。洗，否则影响核的染色。一般置于一般置于7080%酒精中酒精中40C保存。当酒精混浊时，保存。当酒精混浊时，更换新的酒精。更换新的酒精。固定易出现的问题与主要原因固定易出现的问题与主要原因l扭曲变形与过度硬脆扭曲变形与过度硬脆容器过小；标本数量过多；固定时间过长。容器过小；标本数量过多；固定时间过长。取材过于薄小，尤其疏松结缔组织。取材过于薄小，尤其疏松结缔组织。l表层过度，中间没有固定透表层过度，中间没有固定透取材过厚过大；固定时间不足；固定液失效。取材过厚过大；固定时间不足；固定液失效。固定液浓度高、渗透力强，表面快速硬化。固定液浓度高、渗透力强，表面快速硬化。l局部固定不

11、佳局部固定不佳组织与组织重叠；组织与容器接触；组织露出液面。组织与组织重叠；组织与容器接触；组织露出液面。注意：根据实验目的不同选择适当的固定液。注意：根据实验目的不同选择适当的固定液。脱水脱水l（一）脱 水 的 意 义 与 目 的l 常 用 的 固 定 剂 中 含 有 很 多 水 分，在 石 蜡 或 火 棉 胶 包 埋 前。必 须l用 某 些 溶 剂 逐 步 将 组 织 块 吸 收 的 水 分 置 换 出 来，再 让 石 蜡 或 火 棉l胶 将 该 溶 荆 里 换，完 成 包 埋 步 骤。将 组 织 块 内 水 份 置 换 的 过 程 就l叫 脱 水。l 脱 水 时 必 须 由 低 浓 度

12、脱 水 剂 开 始，逐 步 转 入 高 浓 度 脱 水 剂，l以 防 组 织 过 度 收 缩 而 变 形，或 脱 水 不 完 全 而 影 响 制 片 效 果。l 脱 水 剂 必 须 具 有 下 列 特 性：脱 水 剂 能 与 水 按 比 例 混 合，l 高 浓 度，一 般 指 不 含 水 份，脱 水 剂 也 能 与 透 明 剂混 合。前二者特 性 能 达 到 逐 步 除 去 组 织 块 内 的 水 份，使 组 织 块 内 的 水 份 全 部 被脱 水 剂 所 取 代，后二者 特 性 则 为 透明步骤的 透 明 剂 完 全 取 代 组 织l内 的 脱 水 剂 创 造 条 件。l 脱 水 时 间

13、应 视 组 织 块 的 大 小 及 厚 度 而 定，大 致 处 理 如 下：组l织 块 为 3-5毫 米 厚 者，各 级 酒 精 为 3-6小 时，无 水 酒 精 对 组 织l有 脆 化 作 用，浸 泡 时 间 还 应 缩 短。实 质 性 器 官，如 肾、脾 和淋 巴 结 等，在 酒 情 中 浸 泡 时 间 太 久 易 于 硬 脆，脂 肪 组 织 与 疏 松 结缔 组 织 在 酒 精 中 浸 饱 的 时 间 要 长，特 别 是 在 95 酒 精 中，以 尽 量溶 去 脂 肪，并 脱 净 残 存 的 水 份，有 利 于 包 埋 剂 渗 入 组 织 内。脱水脱水l目的：利于石蜡包埋剂渗入。目的：利

14、于石蜡包埋剂渗入。l酒精脱水：酒精脱水：70%和和80%：可以长期保存：可以长期保存90%、95%：2个小时。个小时。100%I、II：各：各1小时。小时。注意：注意：某些检查，不能经过低浓度酒精脱水。如糖原、尿酸结晶。某些检查，不能经过低浓度酒精脱水。如糖原、尿酸结晶。肝、脾、淋巴结：适当缩短在无水乙醇内的时间。肝、脾、淋巴结：适当缩短在无水乙醇内的时间。脂肪、疏松结缔组织、脑：适当延长脱水时间。脂肪、疏松结缔组织、脑：适当延长脱水时间。透透 明明l二甲苯二甲苯I和和II：各：各10分钟左右。分钟左右。l透明时间不宜太长，否则组织收缩硬化。透明时间不宜太长，否则组织收缩硬化。透明透明 透明在

15、两种情况下进行。透明在两种情况下进行。第一第一，透明是在组织脱水后浸蜡前进行，其目的不在于，透明是在组织脱水后浸蜡前进行，其目的不在于为了显微镜观察，而是作为从脱水剂进入包埋剂的桥为了显微镜观察，而是作为从脱水剂进入包埋剂的桥梁。因此，透明剂必须既能与酒精混合，又能与石蜡梁。因此，透明剂必须既能与酒精混合，又能与石蜡融合无间，二甲苯即具此性质，故被选为常用的透明融合无间，二甲苯即具此性质，故被选为常用的透明剂。剂。第二第二，透明是在片子脱水与封藏之间进行。其目的除，透明是在片子脱水与封藏之间进行。其目的除了作为从脱水剂进入封藏剂的桥梁外，尚有使标本透了作为从脱水剂进入封藏剂的桥梁外，尚有使标本

16、透明而便于观察的作用。明而便于观察的作用。浸浸 蜡蜡l透蜡 是指将材料中的透明剂逐步清除，以至完全由石蜡充分渗透。浸浸 蜡蜡l石蜡熔点选择石蜡熔点选择54580C，浸蜡温度较熔点高，浸蜡温度较熔点高230C。l较硬的致密组织，例如骨、软骨、肌腱、皮较硬的致密组织，例如骨、软骨、肌腱、皮肤、子宫肌选用熔点较高的石蜡。肤、子宫肌选用熔点较高的石蜡。l疏松及脆嫩组织，例如脑、脊髓、小动物肝疏松及脆嫩组织，例如脑、脊髓、小动物肝脾选用熔点较低的石蜡。脾选用熔点较低的石蜡。l石蜡石蜡I：1020分钟。分钟。l石蜡石蜡II：2030分钟。分钟。l石蜡石蜡III：3040分钟。分钟。包包 埋埋l是把被石蜡浸

17、透的材料连同熔化的石蜡一起倒入一定形状的容器内，并立即投入冷水中，使它凝固成含材料的蜡块，以备切片。包包 埋埋l新蜡反复熔化、冷凝，改善密度，提高韧性，质新蜡反复熔化、冷凝，改善密度，提高韧性，质地均匀。地均匀。l包埋温度包埋温度65700C.l准备工作准备工作 熔蜡备用；预热包埋用具熔蜡备用；预热包埋用具l注蜡、取放组织注蜡、取放组织 切面向下切面向下l摆正压平摆正压平 保留适当距离保留适当距离l附贴标记附贴标记l移置冷凝移置冷凝l修整蜡块修整蜡块l粘贴标记粘贴标记l包埋l修块 注意事项注意事项l实质性器官：最大切面向下。实质性器官：最大切面向下。l空腔性器官：管壁切面向下空腔性器官：管壁切

18、面向下l相同性质的小块组织可以包埋在一个蜡块相同性质的小块组织可以包埋在一个蜡块中。中。l难切的组织单独包埋。难切的组织单独包埋。l操作要迅速，组织不能在空气中停留太久。操作要迅速，组织不能在空气中停留太久。石蜡切片石蜡切片l准备工作准备工作l切片切片 通常通常46微米微米l展片展片 550Cl附贴附贴 蛋白甘油蛋白甘油l标记标记 连续切片标记顺序连续切片标记顺序l烤片烤片 600C 石蜡全部融化石蜡全部融化l切片 56m,l展片与粘片 水内捞片法：40 酒精捞片法：5070%酒精，3040 l烤片 60 烤箱烤干lHE染色l封固 干封 湿封冰冰 冻冻 切切 片片l取材取材l脱水脱水 10%蔗糖蔗糖 20%蔗糖蔗糖 30%蔗糖蔗糖lOCT包埋包埋 浸泡浸泡2030分钟分钟 l-700C冷凝冷凝 液氮液面上液氮液面上1020秒秒 l-700C保存保存l冷冻切片冷冻切片 -200C保存保存1个月个月l干燥干燥 室温室温10分钟分钟l固定固定 冷丙酮冷丙酮510分钟分钟l染色染色