溶血素制备.ppt

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1、1 1、电镜技术（示教）、电镜技术（示教）2 2、免疫血清的制备、免疫血清的制备3 3、动物的致敏免疫接种、动物的致敏免疫接种 鸡胚接种（电教）鸡胚接种（电教）4 4、流式细胞术（示教）、流式细胞术（示教）5 5、单个核细胞分离及、单个核细胞分离及E E花形成试验花形成试验,淋转试验（淋转试验（6 6学时，学时，周六周六）（）（显微镜）显微镜）6 6、动物实验性过敏反应观察及其动物采血、动物实验性过敏反应观察及其动物采血7 7、免疫球蛋白的纯化、免疫球蛋白的纯化8 8、IgGIgG效价的测定（免疫扩散）效价的测定（免疫扩散）9 9、T T细胞亚群测定，激光共聚焦显微镜技术（示教）细胞亚群测定，

2、激光共聚焦显微镜技术（示教）1010、石蜡切片与酶细胞化学（显微镜）、石蜡切片与酶细胞化学（显微镜）1111、酶联免疫吸附试验、酶联免疫吸附试验1212、凝聚试验、凝聚试验 吞噬实验吞噬实验1313、斑点免疫渗虑试验免疫层析试验、斑点免疫渗虑试验免疫层析试验1414、放射免疫分析技术、放射免疫分析技术1515、免疫荧光标记技术、免疫荧光标记技术实验课要求实验课要求l预习预习l不迟到、早退、不旷课、有事请假不迟到、早退、不旷课、有事请假l穿白大褂、注意自我防护穿白大褂、注意自我防护l不喧哗，不做与实验无关的事不喧哗，不做与实验无关的事l不要急于开始做实验不要急于开始做实验l不要急于写实验报告不要

3、急于写实验报告l实验完成后，实验完成后，自己自己把桌面收拾干净把桌面收拾干净l值日值日要求：擦桌子，拖地、擦黑板、倒垃圾、关灯和门窗要求：擦桌子，拖地、擦黑板、倒垃圾、关灯和门窗（劳动委员负责安排和监督）（劳动委员负责安排和监督）l认真完成实验报告认真完成实验报告实验报告的要求实验报告的要求l题目、原理、主要试剂与器材、步骤、结果（现象）、结题目、原理、主要试剂与器材、步骤、结果（现象）、结论、注意事项、讨论（心得体会）论、注意事项、讨论（心得体会）l班级、姓名、学号班级、姓名、学号l由学习委员统一收齐，按学号从小到大顺序放好，在下一由学习委员统一收齐，按学号从小到大顺序放好，在下一周上课时交

4、周上课时交l自己写自己写、书写整齐、书写整齐l订成一本或每次分开订成一本或每次分开免疫血清的制备免疫血清的制备 前言前言l将适当的免疫原性物质经过一定方式注入动物体内，一段将适当的免疫原性物质经过一定方式注入动物体内，一段时间后，动物血清中可出现特异性抗体，该过程称为时间后，动物血清中可出现特异性抗体，该过程称为免疫免疫血清的制备血清的制备，这种含抗体的血清称为，这种含抗体的血清称为免疫血清免疫血清或或抗血清抗血清。l制备高效价特异性免疫血清是制备高效价特异性免疫血清是免疫学基本技术之一免疫学基本技术之一。l免疫血清的质量免疫血清的质量受多种因素影响受多种因素影响，如免疫原、动物的种类、，如免

5、疫原、动物的种类、接种途径和实验流程。接种途径和实验流程。免疫血清制备的流程免疫血清制备的流程制备免疫原制备免疫原选择免疫动物选择免疫动物选择免疫方法选择免疫方法动物采血动物采血免疫血清的纯化免疫血清的纯化免疫血清的保存免疫血清的保存免疫血清的鉴定免疫血清的鉴定1.免疫原的制备免疫原的制备 -颗粒性免疫原的制备颗粒性免疫原的制备 绵羊红细胞、细菌绵羊红细胞、细菌 -可溶性免疫原的制备可溶性免疫原的制备 蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、核酸蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、核酸2.免疫动物的选择免疫动物的选择（1 1）抗原与动物种属的关系：亲缘关系）抗原与动物种属的关系：亲缘关系（2 2）动物的个体状

6、况：适龄、健康、体重）动物的个体状况：适龄、健康、体重（3 3）抗原的性质：家兔对胰岛素不易产生抗体）抗原的性质：家兔对胰岛素不易产生抗体（4 4）免疫血清用量和要求：大和小，）免疫血清用量和要求：大和小，R R型和型和H H型型3.免疫方法免疫方法（1 1）免疫原的剂量）免疫原的剂量 免疫耐受免疫耐受（2 2）免疫间隔时间）免疫间隔时间 抗体产生的规律抗体产生的规律（3 3）免疫途径）免疫途径 吸收和代谢速度吸收和代谢速度4.4.动物采血法动物采血法（1 1）颈动脉放血法）颈动脉放血法 （2 2）静脉采血法）静脉采血法（3 3）心脏采血法）心脏采血法注：采血前，要预先测定抗体效价，若达到要求

7、，应在末次注：采血前，要预先测定抗体效价，若达到要求，应在末次免疫后一周及时采血，否则效价会下降。免疫后一周及时采血，否则效价会下降。5.免疫血清的纯化免疫血清的纯化 去除非特异性抗体和其它血清成分去除非特异性抗体和其它血清成分7.抗血清的鉴定抗血清的鉴定 效价、特异性、纯度、亲和力效价、特异性、纯度、亲和力8.抗血清的保存抗血清的保存 44保存：保存：3 3个月或半年个月或半年 冷冻保存：冷冻保存：-20-20-70-70、2 23 3年年 真空干燥保存：真空干燥保存：4 45 5年年溶血素的制备溶血素的制备 实验原理实验原理l将一定浓度的将一定浓度的绵羊红细胞（绵羊红细胞（SBRCSBRC

8、）经一定经一定的方式注入动物体内，一段时间后，动物的方式注入动物体内，一段时间后，动物血清中可出现特异性的抗绵羊红细胞抗体血清中可出现特异性的抗绵羊红细胞抗体（溶血素溶血素），该过程称为），该过程称为溶血素的制备溶血素的制备。主要的实验试剂和器材主要的实验试剂和器材l离心机离心机l离心管（离心管（无菌无菌、回收）、玻璃滴管（、回收）、玻璃滴管（无菌无菌、回收）、回收）、一次性注射器、一次性注射器l生理盐水、酒精棉球生理盐水、酒精棉球l兔子、绵羊血兔子、绵羊血 注：本次实验注：本次实验6 6人人/组组实验步骤实验步骤l制备免疫原制备免疫原 绵羊血绵羊血3 3ml +ml +生理盐水生理盐水3 3

9、ml ml 离心离心20002000rpm5min rpm5min 弃上清（弃上清（用玻璃滴管用玻璃滴管吸，吸完后重新放回卷纸中吸，吸完后重新放回卷纸中）重复重复洗涤两次洗涤两次 按压积用生理盐水配成按压积用生理盐水配成1010SRBCSRBC悬液（悬液（注意无菌操作注意无菌操作!）l免疫动物免疫动物 时间时间 免疫途径免疫途径SRBCSRBC浓度浓度注射量注射量第一天第一天耳缘静脉耳缘静脉10101.0ml1.0ml第三天第三天耳缘静脉耳缘静脉15151.0ml1.0ml第五天第五天耳缘静脉耳缘静脉20201.0ml1.0ml第七天第七天耳缘静脉耳缘静脉25251.0ml1.0ml第九天第九

10、天耳缘静脉耳缘静脉30301.0ml1.0ml注：第注：第1 1次免疫之后做好标记，放到自己班级的笼中次免疫之后做好标记，放到自己班级的笼中 第第2-52-5次免疫用的次免疫用的SRBCSRBC悬液由实验准备老师替大家准备悬液由实验准备老师替大家准备时间安排时间安排日期日期星期星期免疫次数免疫次数9 9月月1818日日五五1 19 9月月2121日日一一2 29 9月月2424日日四四3 39 9月月2828日日一一4 49 9月月3030日日三三5 51010月月2323日日五五采血采血l心脏采血心脏采血 末次注射七天后采血。末次注射七天后采血。将兔子仰卧位固定，用手摸出心跳最快的位点，用将

11、兔子仰卧位固定，用手摸出心跳最快的位点，用2020mlml的注射器刺入心脏，回抽注射器，看有无血抽出。若无的注射器刺入心脏，回抽注射器，看有无血抽出。若无血，则将注射器前进或后推一点，再回抽。将抽出的血血，则将注射器前进或后推一点，再回抽。将抽出的血液放入有玻璃珠的液放入有玻璃珠的5050mlml离心管中，离心管中，3737水浴水浴20203030minmin，离心离心25002500rpm*10minrpm*10min，收集血清，放收集血清，放-20-20保存。保存。溶血素的鉴定溶血素的鉴定 l鉴定效价鉴定效价l实验方法：实验方法：直接凝集实验直接凝集实验直直 接接 凝凝 集集 实实 验验

12、-试管法试管法实验原理实验原理l在一定的电解质条件下，将已知的颗粒性抗原定量地与一在一定的电解质条件下，将已知的颗粒性抗原定量地与一系列倍比稀释的待测血清等量混合，静置一定的时间后，系列倍比稀释的待测血清等量混合，静置一定的时间后，根据各管的凝集程度，判断待测血清的抗体效价。根据各管的凝集程度，判断待测血清的抗体效价。l此方法常用于抗体的半定量检测。此方法常用于抗体的半定量检测。主要试剂与器材主要试剂与器材l待检血清待检血清l1 1 SRBCSRBCl生理盐水生理盐水l3737水浴箱水浴箱 l加样枪加样枪 l试管试管实验步骤实验步骤l将血清放在将血清放在655655minmin（灭活补体）。灭

13、活补体）。l取试管取试管9 9只，排列于试管架上，依次编号。只，排列于试管架上，依次编号。l按表格稀释血清和加样（按表格稀释血清和加样（ulul）。）。l各管摇匀后置各管摇匀后置37103710minmin，离心离心500500rpm2-3minrpm2-3min，观察结果。观察结果。80320结果观察和判断结果观察和判断l先看对照管，轻摇动，应为不凝集，红细胞均匀的分散在先看对照管，轻摇动，应为不凝集，红细胞均匀的分散在液体中。液体中。l再看实验管，轻摇动，在稍微静置一会儿。再看实验管，轻摇动，在稍微静置一会儿。+液体澄清，全部的絮状碎片沉于管底液体澄清，全部的絮状碎片沉于管底+液体轻度混浊

14、，绝大多数絮状碎片沉于管底液体轻度混浊，绝大多数絮状碎片沉于管底+液体半混浊，约半数絮状碎片沉于管底液体半混浊，约半数絮状碎片沉于管底+液体混浊，仅少数细小的絮状碎片沉于管底液体混浊，仅少数细小的絮状碎片沉于管底-表现与对照管相同表现与对照管相同l结果判断：能产生明显凝集现象结果判断：能产生明显凝集现象(+）的）的最高最高血清稀释度血清稀释度为抗体（溶血素）为抗体（溶血素）效价效价。结论结论l如：本次实验制备的溶血素效价为如：本次实验制备的溶血素效价为1:1601:160。注意事项注意事项l家兔性情温顺，不会咬人；但其容易受噪音影响，变得烦家兔性情温顺，不会咬人；但其容易受噪音影响，变得烦躁，所以在免疫动物时，安静有利于实验。躁，所以在免疫动物时，安静有利于实验。l兔子受到惊吓或烦躁不安而难以固定，抚摸兔子背部的皮兔子受到惊吓或烦躁不安而难以固定，抚摸兔子背部的皮毛可以稳定其情绪。毛可以稳定其情绪。l制备免疫原和免疫动物时注意无菌操作。制备免疫原和免疫动物时注意无菌操作。l心脏采血时，注射器不能刺入太深，也不能在心脏中左右心脏采血时，注射器不能刺入太深，也不能在心脏中左右滑动针头，否则心脏戳穿而难以抽血。滑动针头，否则心脏戳穿而难以抽血。