5 植物细胞培养与次级代谢产物制备.ppt

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1、第第5 5章章植物细胞培养与植物细胞培养与次级代谢产物制备次级代谢产物制备Preparation of Plant Cell MetabolitesChapter 5细胞工程plant cells culture：指在离体条件下，将指在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖获得大量分离的植物细胞通过继代培养增殖获得大量细胞群体的一种技术。细胞群体的一种技术。植物细胞培养是在植物组织培养的基础上植物细胞培养是在植物组织培养的基础上发展起来的，是生产植物次生代谢产物的一发展起来的，是生产植物次生代谢产物的一种技术。种技术。5.1 5.1 植物细胞培养及其特点植物细胞培养及其特点Chapter

2、 5细胞工程与微生物细胞相比，植物细胞：与微生物细胞相比，植物细胞：平均直径平均直径 Larger in 30-100 times Tend to occur in aggregates形成细胞团形成细胞团 Shear-sensitive易被剪切力损伤易被剪切力损伤 Slow growing生长慢，周期长生长慢，周期长 Easily contaminated易受微生物污染易受微生物污染 Light,oxygen,CO2 demandCharacteristics of plant cells cultureChapter 5细胞工程Copyright 2011 Wang Weidong,All

3、 rights reserved.1、植物细胞培养基 无机盐（大量、微量）碳源（蔗糖）有机氮源（水解酪蛋白）有机酸、维生素 植物生长激素等5.2 5.2 植物细胞培养技术植物细胞培养技术29Chapter 5细胞工程2.1 Single cell separation酶解方法：纤维素酶和果胶酸酶 水解掉细胞壁愈伤组织诱导法：(常用)2、植物单细胞分离与小规模培养、植物单细胞分离与小规模培养Chapter 5细胞工程由愈伤组织分离单细胞步骤步骤：茎段1）诱导产生愈伤组织；2）愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织松散性；Chapter 5细胞工程Copyright 2011 Wang W

4、eidong,All rights reserved.由愈伤组织分离单细胞步骤3）将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物 优点：优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。悬浮振荡培养 4）振动或酶解处理，获得单细胞。Chapter 5细胞工程:用一块活跃生长用一块活跃生长的的愈伤组织愈伤组织来看护单个来看护单个细胞，并使其持续分裂细胞，并使其持续分裂和增殖的培养方法。这和增殖的培养方法。这个愈伤组织块称为个愈伤组织块称为看护看护 愈伤组织。愈伤组织。方法：接种于滤纸上培养方法：接种于滤纸上培养(1)Nursi

5、ng culture2.2 植物单细胞小规模培养植物单细胞小规模培养注：注：离体单细胞在直接培养技术下不分离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看护培养下则分裂裂，看护培养下则分裂 Nurse callus provides nutrition and other substances that enhances cell division.细胞工程（在两层细胞之间放置两层滤纸）(2)饲养层培养饲养层培养饲养层培养：指用饲养层培养：指用X射线等处理过的无活性或分裂很慢的射线等处理过的无活性或分裂很慢的细胞来饲养需要培养的植物细胞。具体方法：细胞来饲养需要培养的植物细胞。具体方法：Chapter 5

6、Chapter 5细胞工程 将饲养细胞与需要培养细胞共混合于培养基将饲养细胞与需要培养细胞共混合于培养基中培养中培养将饲养细胞放于下层，培养细胞置于上层培养将饲养细胞放于下层，培养细胞置于上层培养二者细胞共培养于液体培养基中二者细胞共培养于液体培养基中（2）饲养层培养）饲养层培养（3）液体浅层静置培养）液体浅层静置培养 将一定密度的悬浮细胞接种在三角瓶中封口静将一定密度的悬浮细胞接种在三角瓶中封口静置培养。置培养。Chapter 5细胞工程体积选择法：体积选择法：用大、小孔径筛网过滤、收集单用大、小孔径筛网过滤、收集单 细胞。细胞。冷处理法冷处理法：4低温下处理几天使细胞同步化低温下处理几天使

7、细胞同步化后，再添加新的培养液培养。后，再添加新的培养液培养。饥饿法：饥饿法：控制营养液浓度，通过饥饿使细胞达控制营养液浓度，通过饥饿使细胞达到同步化，再添加营养液培养。到同步化，再添加营养液培养。抑制法：抑制法：使用抑制剂如尿苷、使用抑制剂如尿苷、5-5-氟脱氧尿苷、氟脱氧尿苷、秋水仙素等使细胞达到同步化。秋水仙素等使细胞达到同步化。（4）细胞同步化培养）细胞同步化培养细胞系细胞系(Cell line)：是由原是由原代培养经传代培养纯化，获代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。均一的细胞群体。细胞株细胞株(

8、Cell strain)：是指从是指从一个经过生物学鉴定的细一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单单细胞增殖形成的细胞群细胞增殖形成的细胞群。再由原细胞株进一步分。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株亚株(Substrain)。2.3 细胞系与细胞株细胞系与细胞株 细胞株工业化生产需满足条件细胞株工业化生产需满足条件（1）分散性好，适合大规模悬浮培养。分散性好，适合大规模悬浮培养。（2）均一性好，细胞大小、生理状态一致。均一性好，细胞大小、生理状态一致。（3

9、）生长速度快，培养周期短，不易染菌。）生长速度快，培养周期短，不易染菌。（4）目标产物含量高，容易分离提取。）目标产物含量高，容易分离提取。（5）细胞遗传稳定。）细胞遗传稳定。3.1 细胞株筛选细胞株筛选1.愈伤组织的诱导与培养：选用植物的目标化合物高产部位作为外植体诱导愈伤组织。愈伤组织形成后，进行继代培养。2.单细胞分离：选取生长快速而疏松的愈伤组织，通过固体培养基继代培养，挑选生长快速的细胞。3.细胞无性系的分离：转移到液体培养基中进行悬浮培养，从中选择分散性好、生长速度快的细胞。4.细胞株筛选：检测目标产物含量，从（3）中选择目标产物含量高的细胞株。5.性能评价：进行较大规模培养，考察

10、细胞生长与目标产物合成的稳定性。6.细胞株获得：得到适合工业化生产的细胞株，保种。（1）一般步骤：）一般步骤：（2）细胞株定向富集驯化）细胞株定向富集驯化激素自养型细胞株的筛选驯化：激素自养型细胞株的筛选驯化：将愈伤组织或分离到的细胞接种在将愈伤组织或分离到的细胞接种在不含生长素、不含生长素、分裂素的继代培养基中分裂素的继代培养基中进行传代培养，挑选生长进行传代培养，挑选生长好的细胞进行反复继代培养驯化，可以获得激素好的细胞进行反复继代培养驯化，可以获得激素自养型细胞。自养型细胞。耐受高剂量有毒物质细胞株的筛选驯化：耐受高剂量有毒物质细胞株的筛选驯化：将愈伤组织或分离到的细胞接种在将愈伤组织或

11、分离到的细胞接种在含高浓度的乙含高浓度的乙酸盐、苯甲酸钠等可能对细胞产生毒害的化合物酸盐、苯甲酸钠等可能对细胞产生毒害的化合物的培的培养基中反复继代培养训化，不断提高这些成分含量，养基中反复继代培养训化，不断提高这些成分含量，可以获得耐受高剂量有毒物质细胞株。可以获得耐受高剂量有毒物质细胞株。（3）人工诱变筛选细胞株）人工诱变筛选细胞株悬浮培养系统：悬浮培养系统：诱变剂处理后，根据悬浮培养系统中细胞生长较诱变剂处理后，根据悬浮培养系统中细胞生长较快、细胞群体比较均匀的特点进行筛选快、细胞群体比较均匀的特点进行筛选。愈伤组织系统：愈伤组织系统：在前面筛选的基础上，用诱变剂筛选，系统包括在前面筛选

12、的基础上，用诱变剂筛选，系统包括：对愈伤组织诱变处理后，再通过选择压进行筛选。对愈伤组织诱变处理后，再通过选择压进行筛选。原生质体系统：原生质体系统：裸露的原生体容易进行诱变和筛选。裸露的原生体容易进行诱变和筛选。继代培养保存法：继代培养保存法：将悬浮培养细胞每隔将悬浮培养细胞每隔1-2周进行继代培养保存周进行继代培养保存。低温保存法：低温保存法：5-10下培养，但每隔下培养，但每隔1010天左右更换一次培养液天左右更换一次培养液。冰冻保存法：冰冻保存法：-20 或液氮下保存。或液氮下保存。3.2 细胞株保存细胞株保存Chapter 5细胞工程Copyright 2011 Wang Weido

13、ng,All rights reserved.悬浮培养：悬浮培养：将离体的植物细胞接种在液体培养将离体的植物细胞接种在液体培养基中，保持良好分散状态下的培养。基中，保持良好分散状态下的培养。特点：特点：1）增加细胞与培养液的接触，促进营养吸收和）增加细胞与培养液的接触，促进营养吸收和气体的良好传递；气体的良好传递；2）细胞生长快，能大量提供比较均匀的细胞；）细胞生长快，能大量提供比较均匀的细胞；3）容易实现大规模工业化培养。）容易实现大规模工业化培养。2.4 植物细胞大规模悬浮培养植物细胞大规模悬浮培养 Chapter 5细胞工程Copyright 2011 Wang Weidong,All

14、rights reserved.Steps of cell suspension cultureChapter 5细胞工程1延迟期延迟期3直线期直线期 延迟期：延迟期：适应新培养基环适应新培养基环境，很少分裂；境，很少分裂；对数期：对数期：细胞开始分裂，细胞开始分裂，数目缓慢增加；数目缓慢增加；直线期：直线期：细胞分裂旺盛，细胞分裂旺盛，数目快速增加；数目快速增加；减缓期：减缓期：细胞因营养消耗、细胞因营养消耗、老化，分裂速度减慢；老化，分裂速度减慢；平台期：平台期：死亡与生成细胞死亡与生成细胞数目平衡，净增长为零；数目平衡，净增长为零；衰亡期：衰亡期：细胞死亡速度加细胞死亡速度加快，细胞自溶

15、、死亡。快，细胞自溶、死亡。Growth patterns in suspension cell culture2对数生长期对数生长期4 减缓期减缓期6 衰亡期衰亡期5 平台期平台期Chapter 5细胞工程Copyright 2011 Wang Weidong,All rights reserved.悬浮培养生物反应器要求：悬浮培养生物反应器要求：良好的良好的O O2 2传递、液体流动性和低的剪切力。传递、液体流动性和低的剪切力。按搅拌方式分为：机械式和气动式按搅拌方式分为：机械式和气动式（1）机械搅拌式机械搅拌式生物反应器：生物反应器：动力：动力：利用搅拌器使悬液产生径向和轴向流动；利用搅

16、拌器使悬液产生径向和轴向流动；挡板挡板:将涡流由径向改为轴向流动，增加将涡流由径向改为轴向流动，增加O O2 2溶解。溶解。优点：优点：搅拌充分，供搅拌充分，供O O2 2、混合效果好；、混合效果好；缺点：缺点：剪切力对细胞损伤大。剪切力对细胞损伤大。2.4.1 植物细胞悬浮培养的植物细胞悬浮培养的生物反应器生物反应器Chapter 5细胞工程气升式反应器气升式反应器优点：优点：剪切力小对细胞损伤少，结构简单，耗能低。剪切力小对细胞损伤少，结构简单，耗能低。缺点：缺点：在低气速和后期细胞密度高时，混合效果不在低气速和后期细胞密度高时，混合效果不良。良。包括：包括：（2）气升式生物反应器气升式生

17、物反应器：动力：动力：气量差在底部产生的压力；气量差在底部产生的压力；类型类型:内环流与外环流。内环流与外环流。特点：特点：混合较均一混合较均一（3）鼓泡式生物反应器：）鼓泡式生物反应器：动力：动力：底部喷出的气体冲力，液体呈无序湍流；底部喷出的气体冲力，液体呈无序湍流；特点特点:适合剪切力敏感的细胞适合剪切力敏感的细胞；缺点：；缺点：混合效率低。混合效率低。2.4.1 植物细胞悬浮培养的生物反应器植物细胞悬浮培养的生物反应器Chapter 5细胞工程Airlift systemsChapter 5细胞工程2.4.2 植物细胞培养方式植物细胞培养方式（1 1）分批培养（）分批培养（Batch

18、culture）特点：特点：一次性添加和收获培养液体，期间不更换。一次性添加和收获培养液体，期间不更换。缺点：培养后期营养不足，产率降低；缺点：培养后期营养不足，产率降低；（2 2）流加式培养：）流加式培养：特点：特点：间歇或连续补加一种或多种营养间歇或连续补加一种或多种营养（细胞初始细胞初始接种的培养液体积一般为终体积的接种的培养液体积一般为终体积的1/21/3）；整个培养过程没有培养液流出或细胞产品的收集整个培养过程没有培养液流出或细胞产品的收集。Chapter 5细胞工程Copyright 2011 Wang Weidong,All rights reserved.（3）半连续式培养半连

19、续式培养 半连续式培养半连续式培养（Semi-continuous culture）又称）又称为重复分批式培养或换液培养。在细胞增长和产为重复分批式培养或换液培养。在细胞增长和产物形成过程中，物形成过程中，每间隔一段时间每间隔一段时间从中从中取出部分培取出部分培养液或者细胞养液或者细胞，剩余的细胞作为种子，剩余的细胞作为种子，再用新的再用新的培养液补足到原有体积，培养液补足到原有体积，使生物反应器内的使生物反应器内的总体总体积不变积不变。每次稀释培养体积的每次稀释培养体积的1/2-3/4，以维持细胞的指数，以维持细胞的指数生长状态。生长状态。Chapter 5细胞工程（4）连续培养（连续培养（

20、Continuous culture）含义：含义：指在培养过程中，指在培养过程中，以一定速度不断添加营养液以一定速度不断添加营养液，同时以同样速度排出同时以同样速度排出培养物，维持恒定体积的培培养物，维持恒定体积的培养。养。特点：特点：（1）新鲜培养基不）新鲜培养基不断加入，断加入，保证了养分的充分供应；保证了养分的充分供应；（2）可使细胞保持在增殖）可使细胞保持在增殖旺盛的对数生长期中；旺盛的对数生长期中；（3）适于大规模工业化生产）适于大规模工业化生产加入培养基加入培养基排出培养基及其培养物排出培养基及其培养物Chapter 5细胞工程2.5 植物细胞固定化培养植物细胞固定化培养优点：优点

21、：（1 1）细胞细胞生长较为缓慢生长较为缓慢，利于次级代谢产物的，利于次级代谢产物的积累。积累。（2 2）利于利于保持培养液液体性质保持培养液液体性质，利于传质；，利于传质；（3 3）细胞经包埋后使所受的细胞经包埋后使所受的剪切力损伤减小剪切力损伤减小；（4 4）利于进行利于进行连续培养和生物转化连续培养和生物转化（细胞生长与产物合细胞生长与产物合成分成两个阶段，次级代谢产物合成在生长停止后才大量合成成分成两个阶段，次级代谢产物合成在生长停止后才大量合成）。细胞固定化培养细胞固定化培养细胞固定化培养细胞固定化培养（Cell immobilization Cell immobilization

22、cultureculture）是指将游离的细胞包埋在支持物内部是指将游离的细胞包埋在支持物内部是指将游离的细胞包埋在支持物内部是指将游离的细胞包埋在支持物内部或表面、培养液呈流动状态进行培养的一门技术。或表面、培养液呈流动状态进行培养的一门技术。或表面、培养液呈流动状态进行培养的一门技术。或表面、培养液呈流动状态进行培养的一门技术。Chapter 5细胞工程 植物细胞固定化需要采用固定剂，是一些多糖和多聚类植物细胞固定化需要采用固定剂，是一些多糖和多聚类化合物，常用的包括海藻酸盐、琼脂糖、卡拉胶等。化合物，常用的包括海藻酸盐、琼脂糖、卡拉胶等。1、海藻酸盐、海藻酸盐固定化固定化在在Ca2+离子

23、等多离子等多价阳离子的存价阳离子的存在下，在下，海藻酸盐的羧基和海藻酸盐的羧基和Ca2+之间以离子键形成不溶于水的之间以离子键形成不溶于水的海藻酸钙海藻酸钙，从而在，从而在细胞细胞表面形表面形成凝胶成凝胶。如果采用如果采用磷酸、柠檬酸、磷酸、柠檬酸、EDTA等等螯合剂处理将螯合剂处理将Ca2+离离子除去，又能使胶体子除去，又能使胶体溶解释放溶解释放出细胞。出细胞。无菌空气入口无菌空气入口玻璃瓶玻璃瓶细胞和褐藻酸钠混合液细胞和褐藻酸钠混合液空气出口空气出口形成胶体颗粒的喷射口形成胶体颗粒的喷射口隔滤板隔滤板装有装有CaCl2溶液溶液的烧瓶的烧瓶2.5.1 植物细胞固定化方法海藻酸盐固定化细胞步骤

24、海藻酸盐固定化细胞步骤Chapter 5细胞工程 常用方法：常用方法：（1 1）滴入法：）滴入法：将细胞悬浮液与灭菌的含将细胞悬浮液与灭菌的含NaClNaCl的卡拉胶溶液混的卡拉胶溶液混匀，然后滴入含中匀，然后滴入含中KClKCl的培养基中，使其分散成小颗粒。过滤、的培养基中，使其分散成小颗粒。过滤、清洗颗粒后转入适当的培养基中进行培养。清洗颗粒后转入适当的培养基中进行培养。（2 2）模铸法：）模铸法：将细胞将细胞-卡拉胶溶液注入柱形铸模中形成颗粒。卡拉胶溶液注入柱形铸模中形成颗粒。（3 3）两相法：）两相法：将细胞将细胞-卡拉胶溶液与无菌豆油或石蜡油搅拌卡拉胶溶液与无菌豆油或石蜡油搅拌混匀，

25、形成液滴置于冰浴中不断搅拌，凝固成均匀颗粒，再离混匀，形成液滴置于冰浴中不断搅拌，凝固成均匀颗粒，再离心除去油相和大部分溶液。心除去油相和大部分溶液。2 2、卡拉胶固定化、卡拉胶固定化Chapter 5细胞工程 琼脂糖琼脂糖(Agarose)固定化：固定化：（1 1）凝块法：）凝块法：将细胞悬浮于灭菌的琼脂糖中，搅拌待凝将细胞悬浮于灭菌的琼脂糖中，搅拌待凝结包埋细胞后，将凝块挤进无菌金属网中，使其分散成小结包埋细胞后，将凝块挤进无菌金属网中，使其分散成小颗粒。清洗颗粒后转入适当的培养基中进行培养。颗粒。清洗颗粒后转入适当的培养基中进行培养。（2 2）模铸法：）模铸法：同卡拉胶法同卡拉胶法（3

26、3）两相法：）两相法：同卡拉胶法同卡拉胶法 优点：优点：与海藻酸盐、与海藻酸盐、卡拉卡拉胶等固定化方法相比，胶等固定化方法相比，不需不需要其它离要其它离子来保证胶的稳定性。子来保证胶的稳定性。不足：不足：制得的颗粒较大、形状不规则制得的颗粒较大、形状不规则。3 3、琼脂糖、琼脂糖(Agarose)固定化固定化Chapter 5细胞工程 固定化后需要测定细胞存活率大小，方法有：固定化后需要测定细胞存活率大小，方法有：（1 1）荧光染色观察法：）荧光染色观察法：根据活细胞对根据活细胞对FDAFDA（二乙酸荧光素）（二乙酸荧光素）黄绿色黄绿色荧光染料能被吸收荧光染料能被吸收，而死细胞无法吸收原理鉴定

27、。，而死细胞无法吸收原理鉴定。（2 2）呼吸强度测定：）呼吸强度测定：用用氧电极法氧电极法测定固定化细胞的呼吸强度判断存活率。测定固定化细胞的呼吸强度判断存活率。（3 3）细胞分解和生长速率的测定：）细胞分解和生长速率的测定：通过测定细胞的通过测定细胞的湿重或干重增加率湿重或干重增加率反映细胞活性大小。反映细胞活性大小。2.5.2 2.5.2 固定化细胞活力测定固定化细胞活力测定Chapter 5细胞工程常用的反应系统有常用的反应系统有2 2种：种：流化床生物反应器流化床生物反应器(Fluid-bed bioreactor)：通过通过通通入液体或气体入液体或气体使固定化细胞悬浮于反应器中；使固

28、定化细胞悬浮于反应器中；优点：优点：细胞包埋颗粒小，传质效率高；细胞包埋颗粒小，传质效率高；缺点：缺点：剪切力剪切力或碰撞会破坏固定化细胞。或碰撞会破坏固定化细胞。2.5.3 植物细胞固定化生物反应器植物细胞固定化生物反应器细胞固定在支持物（如筛网）的细胞固定在支持物（如筛网）的内部内部或表面或表面，细胞固定不动，培养物流体，细胞固定不动，培养物流体按一定方向（从下向上）从反应器中按一定方向（从下向上）从反应器中流过实现混合和传质。流过实现混合和传质。优点优点：单位体积细胞的容量大。单位体积细胞的容量大。缺点缺点：混合效率低、细胞颗粒大，混合效率低、细胞颗粒大，易造成传质困难；易造成传质困难；

29、固定床颗粒或固定床颗粒或支持物碎片会阻塞液体的流动；支持物碎片会阻塞液体的流动；固定材料易变形，阻塞筛网。固定材料易变形，阻塞筛网。细胞固定化生物反应器 填充床生物反应器填充床生物反应器(Pipe-conebio-filter reactor)两相培养技术：两相培养技术：指在细胞培养体系中加入指在细胞培养体系中加入有机溶剂（如有机溶剂（如豆油、石蜡油）或吸附性的多聚化合物豆油、石蜡油）或吸附性的多聚化合物，而细胞在水相，而细胞在水相生长，生长，合成的次级代谢产物立即转移到有机相，减少了合成的次级代谢产物立即转移到有机相，减少了对产物的反馈抑制作用，提高了产量对产物的反馈抑制作用，提高了产量，再

30、通过对有机相，再通过对有机相的不断回收与循环利用，实现连续培养。的不断回收与循环利用，实现连续培养。要求要求：有机相对细胞无毒，不影响细胞生产与产物合成；有机相对细胞无毒，不影响细胞生产与产物合成；产物易溶于有机相中；产物易溶于有机相中；水相与有机相易分离；水相与有机相易分离；有机相或多聚化合物不能吸附培养基营养成份。有机相或多聚化合物不能吸附培养基营养成份。2.6 植物细胞两相培养植物细胞两相培养植物天然产物包括初级和次级代谢产物：植物天然产物包括初级和次级代谢产物：初级代谢产物初级代谢产物（Primary metabolites）是通过初级代谢是通过初级代谢产生的维持细胞生命活动必需的物质

31、，产生的维持细胞生命活动必需的物质，如氨基酸、核苷酸、如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素多糖、脂类、维生素等。在不同种类的细胞中，初级代谢等。在不同种类的细胞中，初级代谢产物的种类基本相同。产物的种类基本相同。任何一种初级产物的合成发生障碍任何一种初级产物的合成发生障碍都会影响细胞正常的生命活动，甚至导致死亡都会影响细胞正常的生命活动，甚至导致死亡。次级代谢产物次级代谢产物（Secondary metabolites）是通过次级代是通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物化合物，例如例如抗生素抗生素、激素激素、生物碱、毒素生物碱

32、、毒素等。由于等。由于次级代谢产物次级代谢产物大多具有生物活性，因此是植物代谢产物研究的重点大多具有生物活性，因此是植物代谢产物研究的重点。5.3 植物细胞培养生产次级代谢产物植物细胞培养生产次级代谢产物优点：优点：减少耕地占用，不受季节、地域限制；减少耕地占用，不受季节、地域限制；可以排除病菌和害虫的影响可以排除病菌和害虫的影响(密闭无菌操作密闭无菌操作)；可通过选择优良株系和优化培养条件提高代谢可通过选择优良株系和优化培养条件提高代谢物产量；物产量；能通过改造生物合成途径获得新有用物质。能通过改造生物合成途径获得新有用物质。由于资源短缺和需求量增加，依靠从栽培植物由于资源短缺和需求量增加，

33、依靠从栽培植物提取天然的次级代谢产物途径很难满足人类需求，提取天然的次级代谢产物途径很难满足人类需求，而利用植物细胞生物反应器大量培养次生代谢产而利用植物细胞生物反应器大量培养次生代谢产物成为最有效途径。物成为最有效途径。Chapter 5细胞工程1 1、药用代谢产物、药用代谢产物 这是重要应用领域，包括生物碱、萜类、苷类、酮类等。这是重要应用领域，包括生物碱、萜类、苷类、酮类等。例如，紫杉醇（例如，紫杉醇（TaxolTaxol）是从红豆杉属植物中分离得到的）是从红豆杉属植物中分离得到的一种一种二萜烯类二萜烯类化合物，化合物，治疗乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的药物治疗乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的药物。通

34、过植物细胞培养技术生产有价值的次生代谢产物通过植物细胞培养技术生产有价值的次生代谢产物需求：需求：仅美国每年就有仅美国每年就有50 000名妇女患卵巢名妇女患卵巢癌，每年需约癌，每年需约24kg紫杉醇；还有约紫杉醇；还有约40 000名名妇女死于乳腺癌，年需求量将增至妇女死于乳腺癌，年需求量将增至100kg。全世界每年需要全世界每年需要500kg紫杉醇才能满足广大紫杉醇才能满足广大癌症患者需求。癌症患者需求。生产生产1 kg紫杉醇需要砍伐紫杉醇需要砍伐60年生大树年生大树3000-4000棵棵。紫杉醇在。紫杉醇在树皮、嫩芽中含量树皮、嫩芽中含量最高最高。若光从树皮中提取紫杉，每年需砍伐。若光从

35、树皮中提取紫杉，每年需砍伐150-200万棵万棵左右的大树。左右的大树。2 2、天然食品和食品添加剂、天然食品和食品添加剂 如胡萝卜素、叶黄素、甜菊苷、辣椒素等，因为化学合成如胡萝卜素、叶黄素、甜菊苷、辣椒素等，因为化学合成色素和甜味剂越来越受到担心和严格限制。色素和甜味剂越来越受到担心和严格限制。3 3、杀虫剂和杀菌剂、杀虫剂和杀菌剂 如利用万寿菊细胞生产噻吩烷，香草生产鱼藤酮杀虫剂。如利用万寿菊细胞生产噻吩烷，香草生产鱼藤酮杀虫剂。4 4、饲料、精细化工等产品、饲料、精细化工等产品 如用培养的槡、榆等细胞，再加入大豆粉、糖、淀粉等可如用培养的槡、榆等细胞，再加入大豆粉、糖、淀粉等可充足供应

36、蚕养殖业的饲料。充足供应蚕养殖业的饲料。精细化工产品种类繁多（精细化工产品种类繁多（3636类），附加值高，具有功能性类），附加值高，具有功能性或最终使用性。除上述医药、农药、添加剂外，还包括染料、或最终使用性。除上述医药、农药、添加剂外，还包括染料、涂料、香精、洗涤剂、化妆品、涂料、香精、洗涤剂、化妆品、金属表面处理剂、芳香消臭剂等产品。金属表面处理剂、芳香消臭剂等产品。通过植物细胞培养技术生产有价值的次生代谢产物通过植物细胞培养技术生产有价值的次生代谢产物 聚酮途径聚酮途径：聚酮类：聚酮类化合物包括抗生素、化合物包括抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤免疫抑制剂、抗肿瘤药物等。药物等。莽草酸途径莽草

37、酸途径：类黄：类黄酮，生物碱包括喹啉酮，生物碱包括喹啉类、异喹啉类、吡咯类、异喹啉类、吡咯啶类、乌头类、吲哚啶类、乌头类、吲哚类、大环类等。类、大环类等。甲瓦龙（戊二羟）甲瓦龙（戊二羟）酸途径酸途径：主要是萜类：主要是萜类、甾体类化合物。甾体类化合物。3.1 植物次级代谢产物的合成途径植物次级代谢产物的合成途径Chapter 5细胞工程（1）细胞株）细胞株 植物不同部位的细胞产生次生代谢产物的能力是植物不同部位的细胞产生次生代谢产物的能力是不同的，所以不同的，所以在进行植物细胞培养生产有价值的代在进行植物细胞培养生产有价值的代谢产物时，谢产物时，必须弄清楚产物的合成部位必须弄清楚产物的合成部位

38、，也就是应，也就是应该考虑到不同部位该考虑到不同部位来源细胞的特性来源细胞的特性。筛选出筛选出稳定、高产、稳定、高产、生长速度快生长速度快的细胞株的细胞株是细胞是细胞大规模培养次生代谢产物的前提。缺乏适合的细胞大规模培养次生代谢产物的前提。缺乏适合的细胞株是目前许多代谢产物无法利用细胞培养生产的主株是目前许多代谢产物无法利用细胞培养生产的主要限制之一。要限制之一。1、细胞遗传特性、细胞遗传特性3.2 植物次级代谢产物合成的影响因素植物次级代谢产物合成的影响因素Chapter 5细胞工程 次级代谢产物的生物合成涉及次级代谢产物的生物合成涉及多基因参与（基因多基因参与（基因簇）簇），机制非常复杂，

39、不同于蛋白质合成，影响因素，机制非常复杂，不同于蛋白质合成，影响因素非常多。非常多。结合目标产物进行生物合成机制研究，揭示代谢结合目标产物进行生物合成机制研究，揭示代谢途径及诱导合成机制途径及诱导合成机制是细胞培养的重要生物学问是细胞培养的重要生物学问题，有利于指导建立优化的培养工艺与技术。题，有利于指导建立优化的培养工艺与技术。（2 2）生物合成机制）生物合成机制植物次级代谢产物合成的影响因素植物次级代谢产物合成的影响因素Chapter 5细胞工程 化学因素：化学因素：主要包括主要包括培养基、前体和调节因子培养基、前体和调节因子等。等。（1）培养基：）培养基：一方面是保证植物一方面是保证植物

40、细胞生物量的增长细胞生物量的增长；另外一方面是要保证细胞能合成和另外一方面是要保证细胞能合成和积累次级代谢产物积累次级代谢产物。普通的培养基一般仅能满足第一方面的需要，对普通的培养基一般仅能满足第一方面的需要，对于第二方面的需求，于第二方面的需求，必须针对具体的培养对象和目的，必须针对具体的培养对象和目的，对培养基进行优化，对培养基进行优化，从而保证最大限度地从而保证最大限度地积聚目积聚目标产物。标产物。2、培养条件的影响、培养条件的影响Chapter 5细胞工程 前体前体指在生物合成反应的中间过程中某一阶段前的指在生物合成反应的中间过程中某一阶段前的物质，都可以说是该阶段物质的前体物质。物质

41、，都可以说是该阶段物质的前体物质。如果在培养基中加入外源前体将会有助于合成该代如果在培养基中加入外源前体将会有助于合成该代谢产物或使其产量增加。谢产物或使其产量增加。但同一前体物，在细胞不同生但同一前体物，在细胞不同生长时期加入，对次级代谢产物合成所起作用也不同，甚长时期加入，对次级代谢产物合成所起作用也不同，甚至起抑制作用。至起抑制作用。例如见例如见P59P59（2 2）前体（）前体（precursor precursor）（3 3）调节因子：）调节因子：是指那些通过细胞信号转导作用于细是指那些通过细胞信号转导作用于细胞胞次生代谢相关的基因表达次生代谢相关的基因表达，改变细胞次生代谢，改变细

42、胞次生代谢相关酶相关酶活力活力，最终使细胞次生代谢水平发生改变的，最终使细胞次生代谢水平发生改变的生长调节物生长调节物质质。生长调节剂的种类与浓度影响细胞生长与分化，影生长调节剂的种类与浓度影响细胞生长与分化，影响次生代谢产物的合成水平。响次生代谢产物的合成水平。Chapter 5细胞工程 物理因素物理因素 主要包括：主要包括：光照、光照、pH值值、流体、气体、流体、气体等。等。（1）光照：）光照：光照时间长短、光质、光强光照时间长短、光质、光强等都会对代谢产物等都会对代谢产物合成和积聚产生作用。合成和积聚产生作用。光对许多酶有诱导或抑制作用光对许多酶有诱导或抑制作用。例。例如，黄酮类物质的积

43、累是需光照的，特别是紫外光。如，黄酮类物质的积累是需光照的，特别是紫外光。（2）pHpH值：值：会影响培养液的会影响培养液的渗透压、酸碱度、酶的活性渗透压、酸碱度、酶的活性，从而影响细胞代谢产物合成。植物细胞液体培养的从而影响细胞代谢产物合成。植物细胞液体培养的 pH pH 变变化最佳在化最佳在5.55.55.85.8之间之间。（3 3）流体性质：）流体性质：由于植物细胞培养过程中容由于植物细胞培养过程中容易结团易结团，同时，同时不少细胞在培养过程中容易不少细胞在培养过程中容易分泌粘多糖分泌粘多糖等物质，粘附于反等物质，粘附于反应器内表面，应器内表面，使传氧速率降低，影响细胞生长。使传氧速率降

44、低，影响细胞生长。粘度变化可以由细胞本身或其分泌物等引起。前者包粘度变化可以由细胞本身或其分泌物等引起。前者包括细胞浓度、年龄、大小、结团情况等。括细胞浓度、年龄、大小、结团情况等。Chapter 5细胞工程（4）气体）气体 与微生物不同，植物细胞都是与微生物不同，植物细胞都是好气性好气性的，通过光合作的，通过光合作用合成有机物，因此用合成有机物，因此O O2和和CO2的含量与传递的含量与传递对培养过程对培养过程影响较大，影响较大，过高过低过高过低都会对细胞培养产生不良影响。都会对细胞培养产生不良影响。氧气从气相到流体表面的传递（体积溶氧系数）、氧气从气相到流体表面的传递（体积溶氧系数）、O

45、O2与与CO2的浓度及的浓度及pH值值达到一定平衡状态时，细胞才能良达到一定平衡状态时，细胞才能良好生长。好生长。氧的传递氧的传递与通气速率、培养液混合程度、培养液流变与通气速率、培养液混合程度、培养液流变特性、气液界面面积等因素有关；而特性、气液界面面积等因素有关；而氧的吸收氧的吸收与反应器与反应器类型、细胞生长速率、温度、类型、细胞生长速率、温度、pH、营养组成、细胞浓、营养组成、细胞浓度等相关。度等相关。Chapter 5细胞工程（1）通气和搅拌引起的流体压力，易造成细胞剪切损伤、通气和搅拌引起的流体压力，易造成细胞剪切损伤、有益气体散失及产生泡沫的问题，有益气体散失及产生泡沫的问题，都

46、影响细胞生长和产物都影响细胞生长和产物积累。积累。剪切力比较大，细胞会自溶，剪切力比较大，细胞会自溶，可以通过可以通过低剪切力的生物低剪切力的生物反应器反应器 开发与开发与耐受高剪切力的细胞株筛耐受高剪切力的细胞株筛选选来实现。来实现。细胞很容易细胞很容易被包埋在泡沫被包埋在泡沫里，造成非均相培养，也可从里，造成非均相培养，也可从营养液中带出来，造成损失或污染。可以通过营养液中带出来，造成损失或污染。可以通过消泡剂、挡消泡剂、挡板去除泡沫板去除泡沫。5.3.2.3 植物细胞放大培养中的影响因素植物细胞放大培养中的影响因素放大培养是指与实验室摇瓶培养相比较的工业化大规模放大培养是指与实验室摇瓶培

47、养相比较的工业化大规模培养，会出现细胞产量和次生产物合成能力下降问题。培养，会出现细胞产量和次生产物合成能力下降问题。Chapter 5细胞工程（2）细胞密度过大易引起流体粘度增加，造成营养细胞密度过大易引起流体粘度增加，造成营养吸收、传气问题。吸收、传气问题。（3）反应器死角易造成细胞粘附、死亡、营养吸收反应器死角易造成细胞粘附、死亡、营养吸收及传气问题。及传气问题。（4）对次生代谢产物合成机制和途径的不深入了解，对次生代谢产物合成机制和途径的不深入了解，致使很难维持最佳培养条件。致使很难维持最佳培养条件。（5）还有次生产物过多积累会反馈抑制合成效率，还有次生产物过多积累会反馈抑制合成效率，

48、须及时收获。须及时收获。5.3.2.3 植物细胞放大培养中的影响因素植物细胞放大培养中的影响因素Chapter 5细胞工程Copyright 2012,All rights reserved.利用植物细胞大规模悬浮培养为生产有用代谢产物利用植物细胞大规模悬浮培养为生产有用代谢产物提供了有效途径，但是由于提供了有效途径，但是由于植物细胞容易积聚植物细胞容易积聚、细胞分、细胞分化、剪切力敏感、代谢途径复杂性化、剪切力敏感、代谢途径复杂性等因素使工业规模化等因素使工业规模化培养受到限制。此外，植物细胞培养在培养受到限制。此外，植物细胞培养在放大过程中往往放大过程中往往产量产量会比实验室摇瓶培养会比实验室摇瓶培养下降许多下降许多的问题。的问题。迄今为止，只有少数植物细胞培养实现了工业化，迄今为止，只有少数植物细胞培养实现了工业化，例如两步法生产紫草宁、迷迭香宁酸、肉桂酰丁二胺等。例如两步法生产紫草宁、迷迭香宁酸、肉桂酰丁二胺等。This chapter is over!植物细胞培养生产代谢产物问题总结植物细胞培养生产代谢产物问题总结