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1、学科分类号 本 科 毕 业 论 文题 目 百蕊草离体培养条件的优化研究 姓 名 学 号 院 (系) 专 业 年 级 指导教师 职 称 二一年月贵州师范学院本科毕业论文（设计）诚信声明本人郑重声明：所呈交的本科毕业论文(设计)，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 本科毕业论文作者签名： 年 月 日目录摘要1Abstract2引言31实验材料31.1供试材料31.2外

2、植体选取32培养基及培养条件43实验方法步骤43.1百蕊草愈伤组织的诱导与初代培养43.2培养基及培养条件优化43.3外植体表面消毒接种及消毒时间对外植体消毒效果的影响53.4不同培养条件对愈伤组织的影响53.4.1不同PH值对诱导愈伤组织的影响53.4.2不同培养温度对诱导愈伤组织的影响54结果分析64.1 不同消毒时间对外植体消毒效果的影响64.2 不同培养基对诱导愈伤组织的影响74.3 不同pH值对诱导愈伤组织的影响84.4 不同培养温度对诱导愈伤组织的影响95 结果与讨论105.1 外植体的接种诱导105.2 百蕊草外植体最佳表面消毒时间105.3诱导愈伤组织的培养基及培养条件10参考

3、文献12致 谢13I贵州师范学院毕业论文（设计）摘 要以野生或人工种植百蕊草的幼嫩茎及叶片为外植体进行愈伤组织的诱导。用控制变量法探究百蕊草外植体的最佳消毒时间、离体培养的培养基适宜配方及适宜的pH值、培养温度。通过系统的研究，多次实验，优化百蕊草愈伤组织的诱导及离体培养的外界条件，从而提高外植体的诱导率，愈伤组织的增殖率，悬浮培养的成功率，百蕊草素的提取率。为百蕊草愈伤组织的诱导和生物法提取百蕊草素提供参考。研究结果：诱导愈伤组织的适宜培养基为MS+1 mg/L6-BA+0.15 mg/LNAA+0.1 mg/L2,4-D,适宜的pH为5.8-6.0，适宜为温度22-26。关键词: 百蕊草；

4、离体培养 ；愈伤组织 AbstractWith a wild or core grass were planted young stems and leaves as explant callus induction. With the control variable method to explore the core grass were the best explants disinfection time and the in vitro culture medium formula and suitable pH, culture temperature. Through syst

5、ematic research, experiment many times, optimization of callus induction and core grass in vitro culture of external conditions, thus improve the induction rate of explants, callus proliferation rate, the success rate of the suspension culture core grass element extraction yield. For the callus indu

6、ction and core grass biological method of extracting core grass element to provide the reference. Results: (1) induction of callus of suitable culture medium for MS+1 mg/L6-BA+0.15 mg/LNAA+0.1 mg/L2,4-D, (2) the appropriate pH 5.8 6.0, (3) suitable for 22 to 26 temperature.Keywords: The core of gras

7、s; Tissue culture; Callus; Expand training12贵州师范学院毕业论文（设计） 引言百蕊草，为檀香科植物，别名百乳草、小草、地石榴等1，始载于图经本草。百蕊草为多年生寄生草本植物，根上有寄生根，常附着在其他活体植物根上而生长2。百蕊草味辛，徽苦、性寒，归肺，脾，肾经。全草入药有清热解毒，补肾涩精的功效。多用于治疗各种炎症，如急性乳腺炎，肺炎，咽炎等疾病3。通过组织培养方法在人工控制条件下培养外植体再生器官或植株，可以在不受植株体其它部分干拢下研究被培养部分生长和分化的规律，诱导获得大量愈伤组织后，再进行细胞悬浮培养获得大量百蕊草悬浮细胞系。再用细胞系进行百

8、蕊草素的提取。生物法提取百蕊草素的研究可快速繁殖植物种苗和愈伤组织得到大量的原料以用来提取百蕊草素等有用的化学成分。通过组织培养的外植体百蕊草苷含量和野生或栽培种相当，具有同等药效，组培苗完全可以替代野生或栽培种4。因此本选题的目的在于结合前人的研究成果，优化和完善百蕊草快速繁殖技术，实现规模化生产组培苗及其愈伤组织，为从百蕊草中提取百蕊草苷等次生代谢物解决资源问题；该技术应用将会在获得含有效成分高的百蕊草药物资源的同时不受地区、季节与气候限制，便于工厂化生产等优势，此研究对实现百蕊草组培苗产业化、保护野生资源、发展绿色可持续的天然药用植物产业，具有重要意义。1 实验材料1.1 供试材料供试材

9、料为野生的百蕊草幼嫩茎和叶片，取自贵州省贵阳市花溪区。1.2 外植体选取选取选取植株上的幼嫩、健壮无病虫害的茎和叶作为外植体诱导愈伤组织。2 培养基及培养条件 培养基见实验方法与步骤培养室温度253，光照时间1012 h/d，光照强度15001800 Lx。3 实验方法与步骤通过控制变量和正交实验的方法，用新鲜百蕊草植株经消毒处理后接种在愈伤组织诱导培养基上，培养观察一段时间后分析对比找出培养百蕊草愈伤组织的细胞分裂素6-BA和生长激素NAA、2,4-D用量的最好配方。通过连续几周的观察，对比分析确定正交实验组中最有利于百蕊草愈伤组织分化培养的培养基激素配比，再利用确定的最好配方进行百蕊草愈伤

10、组织的扩大培养，以获得大量愈伤组织用于细胞悬浮系的建立。3.1 百蕊草愈伤组织的诱导与初代培养取新鲜幼嫩、健壮的外植体用自来水冲洗干净后用75酒精浸泡10s，经无菌水清洗2次后用0.1的升汞溶液消毒5 min，无菌水浸洗3次，再用无菌水浸泡10 min，用无菌水洗2次，最后将枝条和叶片剪成约1.0 cm长的小段，接种于1/2MS+1 mg/L6-BA+0.4 mg/LNAA+0.1 mg/L2,4-D愈伤组织诱导培养基中。培养两周后。百蕊草叶片渐渐分化变粗，一个月以后便形成绿色块状愈伤组织。3.2 培养基及培养条件优化将初代诱导分化形成的愈伤组织切成0.5-0.8 cm2块转接在培养基中，置于

11、同一光照培养箱下培养观察记录。筛选最好的诱导愈伤组织的配方。培养基筛选采用正交设计实验（见表1），并控制pH值，光照培养箱温度、光照时间、光照强度一致，观察，对比分析，可以得到较为准确的培养愈伤组织的配方，再用较好的配方分别控制培养基pH值，温度为自变量，来确定培养百蕊草愈伤组织最佳的培养基pH值和光照培养箱温度。表1. 诱导愈伤组织正交实验培养基配方表培养基编号基本培养基6-BA mg/LNAA mg/L2,4-D mg/LC1MS00.050C2MS10.150.1C3MS20.450.2C41/2MS00.150C51/2MS10.450.1C61/2MS20.050.2C71/4MS0

12、0.450C81/4MS10.050.1C91/4MS20.150.23.3 外植体表面消毒接种及消毒时间对外植体消毒效果的影响从植株上取具45片叶，长约6 cm的新生幼嫩枝条，用自来水清洗干净，然后在超净工作台上，设置75酒精浸泡消毒8，9，10，11，12 s，0.1的升汞溶液灭菌8 min及75酒精浸泡消毒10 s，0.1的升汞溶液灭菌6，7，8，9，10 min为梯度。每次无菌水浸洗3次后浸泡5 min，然后将叶片切成两段、枝条剪成带有腋芽约1.0 cm长的小段，接种于上表C2培养基中。3.4 不同培养条件对愈伤组织的影响3.4.1 不同pH值对诱导愈伤组织的影响按筛选出的C2配方MS

13、+1 mg/L6-BA+0.15 mg/LNAA+0.1 mg/L2,4-D配制培养基。设置pH值5.2、5.4、5.6、5.8、6.0梯度。将长势较好的愈伤组织块切成0.5-0.8 cm2大小接入培养基中，置于相同培养条件下培养观察记录，以筛选百蕊草培养基最佳的pH值。3.4.2 不同培养温度对诱导愈伤组织的影响按C2配方MS+1 mg/L6-BA+0.15 mg/LNAA+0.1 mg/L2,4-D配制培养基，用光照培养箱设置不同培养温度，其他培养条件相同，将长势较好的愈伤组织块切成0.5-0.8 cm2大小接入培养基中，培养观察，筛选百蕊草愈伤组织培养的温度。4 结果与分析4.1 不同消

14、毒时间对外植体消毒效果的影响百蕊草外植体经消毒处理接种在培养基中，四天就能明显发现，消毒不完全的叶片或茎底端开始生长霉菌或其他微生物，两周后消毒完全的百蕊草叶片或茎开始膨大变粗。其消毒时间及30 d后的生长情况见表2。 表2. 不同消毒时间对外植体消毒效果的影响组别75%酒精消毒时间/s升汞(0.1g/L)消毒时间/min接种瓶数/瓶成活瓶数/瓶污染瓶数/瓶死亡瓶数/瓶污染率/%成活率/%死亡率/%组1881001001000-组298101909010-组3108103707030-组411810622206020组51281020802080组6106101909010-组71071046

15、06040-组8108106404060-组910910523205030组10101010316103060图1. 相同升汞消毒时间，不同酒精消毒时间对外植体消毒效果的影响图2. 相同酒精消毒时间，不同升汞消毒时间对外植体消毒效果的影响由于百蕊草叶片相对较为柔弱，消毒时间过短则容易污染，时间过长会杀死叶片细胞，导致百蕊草愈伤组织诱导失败。通过图1、图2可以看出随着酒精消毒时间和升汞消毒时间的增加，其外植体污染率逐渐减小，死亡率、成活率逐渐增大。因此取成活率最高的时间作为酒精配合升汞做表面消毒的最佳组合时间，酒精消毒11s，升汞消毒8min。此时成活率相对较高，且污染率和死亡率相对较低。4.2

16、 不同培养基对诱导愈伤组织的影响将成活的百蕊草愈伤组织转接在不同培养基中后观察，两周后即可看到愈伤组织逐渐膨大，边缘有透明组织，说明细胞在不断增殖。其培养基组合及30 d后的生长情况见表3。 表3. 不同培养基对诱导愈伤组织的影响编号1周后2周后3周后4周后5周后6周后C1无明显变化无明显变化无明显变化有少量芽组织变大一点有少量芽组织变大，芽长大，组织偏黄C2无明显变化组织块变大一点组织变大明显变大再变大一点组织边缘有白色组织不变大，白色组织增多变黄C3无明显变化无明显变化组织变大一点组织变大有少量芽组织变大芽长大偏黄组织变黄C4无明显变化无明显变化组织变大一点组织变大明显变大组织边缘有白色组

17、织不变大，白色组织增多变黄C5无明显变化组织变大一点组织变大明显变大再变大一点组织边缘有白色组织，少部分分化出苗不变大，白色组织增多变黄C6无明显变化组织变大一点组织变大明显变大再变大一点组织边缘有白色组织，少部分分化出苗不变大，白色组织增多变黄C7无明显变化无明显变化有少量芽组织变大一点有少量芽芽长大长高偏黄C8无明显变化无明显变化有少量芽组织变大一点有少量芽芽长大长高偏黄C9无明显变化无明显变化有少量芽组织变大一点有少量芽芽长大长高偏黄通过6周的培养与观察、对比分析：随着MS营养成分含量的降低其愈伤组织长势越来越差，降到1/4 MS时会分化出苗，使愈伤组织诱导率下降。从上述实验数据可以看出

18、C2、C5、C6三个配方诱导率和长势较好，但C2相对比较更稳定，愈伤组织长势更好。实验过程中发现C5和C6部分会分化出苗。一个月之后由于营养被吸收逐渐减少，愈伤组织逐渐变白玻璃化5，最后变黄，然后枯萎死亡，因此在愈伤组织继代培养时不能超过一个月后才转接，变白或变黄后的组织转接后很难成活，长势较差，甚至直接变黄死亡，造成材料的浪费。4.3 不同pH值对诱导愈伤组织的影响接种两周后，可以明显看出培养瓶中愈伤组织膨大。其pH值组合及30 d后的生长情况见表4。 表4. 不同pH值对诱导愈伤组织的影响PH值接种后平均鲜重/g培养后平均鲜重/g平均净增重/g增殖率/%5.20.460.510.0510.

19、875.40.500.630.1326.005.60.450.920.47104.445.80.471.541.07227.666.00.461.511.05228.266.20.490.970.52106.12注：鲜重=接种后总重量-接种前培养瓶与培养基的重量图3. 不同pH值对诱导愈伤组织的影响通过一段时间培养与观察、对比分析，可以看出随着pH值的增大，其愈伤组织的增值率逐渐增大，当pH值超过6.0时，其增值率迅速下降，在实践中,百蕊草愈伤组织的诱导与培养培养适宜pH值应控制在5.8-6.0范围内，其愈伤组织长势较好，而pH为5.2、5.4、5.6、6.2时虽然也会增殖，但有些很快就变黄玻

20、璃化死亡，说明培养基过酸或过碱不适合百蕊草愈伤组织增殖与培养。4.4 不同培养温度对诱导愈伤组织的影响愈伤组织的培养温度一般在24左右，培养温度梯度及30 d后的生长情况见表5。 表5. 不同培养温度对诱导愈伤组织的影响培养温度/接种后平均鲜重/g培养30d后平均鲜重/g平均净增增重/g增值率/%200.560.710.1526.79220.511.460.95186.27240.551.961.41256.3626280.570.521.540.850.970.33170.1863.46图4. 不同温度对对诱导愈伤组织的影响实验结果表明，随着培养温度的升高，愈伤组织的增殖率逐渐增大，当温度超

21、过24后，其增值殖率快速减小。说明百蕊草愈伤组织的培养在22-26时均可以使其快速增殖，而培养温度低于20时，愈伤组织会分化出苗，降低增殖率甚至不增殖，而温度高于28时，百蕊草愈伤组织增殖率迅速下降，增值率很低，甚至烧苗死亡。5 结果与讨论5.1 外植体的接种诱导从外植体的接种诱导来看，选择较幼嫩的外植体比相对较老的外植体愈伤组织的诱导率更高，其长势也较好。因此，在生产实践中应选择新鲜、幼嫩健康的外植体。对于愈伤组织诱导的分化与增殖，在组织培养中，植物激素对植物组织分化的调节起重要作用，特别是细胞分裂素与生长素的比例6。5.2 百蕊草外植体最佳表面消毒时间通过实验，得出百蕊草外植体最佳酒精消毒

22、最佳时间为11 s，升汞消毒时间为8 min，由于百蕊草叶片相对较为柔弱，消毒时间过短则容易污染，时间过长会杀死叶片细胞，此数据可以为百蕊草外植体的消毒提供参考。5.3诱导愈伤组织的培养基及培养条件诱导愈伤组织的培养基为MS+1 mg/L6-BA+0.15 mg/LNAA+0.1 mg/L2，4-D。诱导率为100。培养基PH值为5.8-6.0之间。培养温度为22-24最佳。但本实验所设计的处理组合较少，要达到更好的处理效果还有待更深入系统地研究，如设置不同光照强度，不同光照时间，不同培养基硬度等培养条件对愈伤组织的影响的研究。以完善百蕊草愈伤组织的培养条件的优化。 参考文献1 国家中医药管理

23、局. 中华本草M. 上海科学技术出版社, 2005. 2 武祖发,梁盖敏,刘守金.百蕊草的生药研究与寄主调查J.中草药 1993,24(08). 3 安徽省百蕊草研究协作小组. 百蕊草治疗急性炎症疾患的临床观察J. 新医药学杂志, 1972(78):38.4 袁艺, 吴松涛, 刘莉华,等. 百蕊草野生苗与组培苗山萘素含量的研究J. 激光生物学报, 2002, 11(6):431-433.5 王先荣, 王兆全, 杜安全. 百蕊草有效成分的化学研究百蕊草素的提取、分离和鉴定J. 现代应用药学, 1994(4):15-15.6 周宜君, 周生闯, 刘玉,等. 植物生长调节剂对植物愈伤组织的诱导与分化

24、的影响J. 中央民族大学学报:自然科学版, 2007, 16(1):23-28.7 袁艺, 田胜尼, 戴建勇,等. 白蕊草组织培养和快速繁殖的研究J. 激光生物学报, 2002, 11(5):338-342.8 韦三立.花卉组织培养M.北京:中国林业出版社,2000.129 鲁云霞, 汪俊松. 百蕊草的化学成分研究J. 中草药, 2004, 35(5):491-493.10 刘永松, 罗曼, 潘玲,等. 抗菌中草药百蕊草的研究进展J. 药学进展, 2006, 30(6):252-256.致 谢时光荏苒，转眼间大学的美好时光就要结束了，一切仿佛还停留在昨天，今天却即将离开这培育我们的母校，还有悉

25、心教导我们的老师。春梦秋云，好聚好散。离校日期已日趋渐进，毕业论文的完成也随之进入了尾声。从开始进入课题到论文的顺利完成，帮助我最大的就是我的毕业论文导师，她不仅是我的导师，更是一个和蔼善良的人，在我完成毕业论文的整个过程中，她给了我极大的帮助和认真的教授。在毕业论文写作进行的过程中，我也多次迷茫，遇到很多问题，是她耐心的帮助和指导，才让我从论文的选题、实验、搭好论文框架再到论文修改，一步一步的完成了论文，并在此期间给我提出了很多宝贵的意见与建议。在生活中，王老师就像我的朋友和亲人一样，处处地关心和照顾我们，和我们一起度过紧张而又快乐的大学时光。其次，也很感谢朋友同学的支持和帮助，尤其是我的好搭档。我们一起做实验，一起整理数据真的很开心。四年寒窗，在学校收获了很多，知识，技能，人际交往等等，以及在阅读、实践中所培养的思维方式、表达能力和广阔视野。还有思想上极大的转变都是我一生的财富。我很庆幸这四年来遇到的良师益友，他们无论在学习上、生活上，还是工作上，都给予了我极大的帮助和照顾，再一次感谢黄老师给予我的帮助，致以我诚挚的谢意！