微生物培训资料.ppt

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1、微生物的基本知识回顾微生物的基本知识回顾微生物的基本知识回顾微生物的基本知识回顾1.什么是微生物：什么是微生物：微生物（微生物（microorganism,microbe）是一类个体微小、）是一类个体微小、结构简单，肉眼不可见或看不清楚的微小生物的统称结构简单，肉眼不可见或看不清楚的微小生物的统称。2.微生物的特点：微生物的特点：个体微小，结构简单个体微小，结构简单:细胞大小以微米和纳米计量。细胞大小以微米和纳米计量。种类繁多、分布广泛种类繁多、分布广泛：一克沃土中含菌量高达几亿甚至几一克沃土中含菌量高达几亿甚至几十亿十亿 生长繁殖快，代谢能力强生长繁殖快，代谢能力强：大肠杆菌（大肠杆菌（Es

2、cherichia coli）在适宜的条件下，每在适宜的条件下，每20分钟即繁殖一代，分钟即繁殖一代，24小时即可繁殖小时即可繁殖72代。代。遗传稳定性差，容易发生变异遗传稳定性差，容易发生变异：自发突变频率为自发突变频率为10-6左左右右细菌的性质uu1 菌体形态菌体形态:球，杆，螺旋球，杆，螺旋革兰氏染色革兰氏染色18841884年丹麦医师年丹麦医师GramGram所发明所发明 真细菌根据细胞壁结构分为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌真细菌根据细胞壁结构分为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌uu约约4040层层网状肽聚糖网状肽聚糖覆盖覆盖在细胞表面，在细胞表面，磷壁酸磷壁酸贯贯穿于肽聚糖层，形成厚穿于肽

3、聚糖层，形成厚约约2080nm2080nm的细胞壁；的细胞壁；uu磷壁酸贯穿其中；磷壁酸贯穿其中；革兰氏阳性菌（G+）细胞壁结构uu内壁层：靠近细胞膜，为内壁层：靠近细胞膜，为1212层网状肽聚糖；层网状肽聚糖；uu外壁层：外壁层：脂多糖（脂多糖（LPSLPS）、磷脂层和脂蛋白层；）、磷脂层和脂蛋白层；革兰氏阴性菌（G-）细胞壁结构脂多糖的结构模型O-特异侧链核心多糖类脂A内毒素热源质细菌的特出结构芽孢：在其生长的一定阶段在细胞内形成圆芽孢：在其生长的一定阶段在细胞内形成圆芽孢：在其生长的一定阶段在细胞内形成圆芽孢：在其生长的一定阶段在细胞内形成圆形或椭圆形、圆柱形休眠体结构称为芽孢。形或椭圆

4、形、圆柱形休眠体结构称为芽孢。形或椭圆形、圆柱形休眠体结构称为芽孢。形或椭圆形、圆柱形休眠体结构称为芽孢。uu功能：对恶劣环境有很强的抵抗能力功能：对恶劣环境有很强的抵抗能力功能：对恶劣环境有很强的抵抗能力功能：对恶劣环境有很强的抵抗能力 ，有的芽孢，在一定条件下可保持活力数年有的芽孢，在一定条件下可保持活力数年有的芽孢，在一定条件下可保持活力数年有的芽孢，在一定条件下可保持活力数年甚至数十年之久，它本身具有一个细胞维甚至数十年之久，它本身具有一个细胞维甚至数十年之久，它本身具有一个细胞维甚至数十年之久，它本身具有一个细胞维持生命的所有功能。持生命的所有功能。持生命的所有功能。持生命的所有功能

5、。uu特点：耐高温，抗热性很强；抗化学药物特点：耐高温，抗热性很强；抗化学药物特点：耐高温，抗热性很强；抗化学药物特点：耐高温，抗热性很强；抗化学药物和酸类；对溶菌酶有抗性和酸类；对溶菌酶有抗性和酸类；对溶菌酶有抗性和酸类；对溶菌酶有抗性 。细菌的特出物质uu热原质：特点：耐高温；不具挥发性（重要疏水原理）；易被强酸、强碱热原质：特点：耐高温；不具挥发性（重要疏水原理）；易被强酸、强碱热原质：特点：耐高温；不具挥发性（重要疏水原理）；易被强酸、强碱热原质：特点：耐高温；不具挥发性（重要疏水原理）；易被强酸、强碱破坏；可滤过性；易吸附性；可稀释性（水溶性）破坏；可滤过性；易吸附性；可稀释性（水溶

6、性）破坏；可滤过性；易吸附性；可稀释性（水溶性）破坏；可滤过性；易吸附性；可稀释性（水溶性）uu内毒素：细胞壁外层，属于细胞壁的组成部分（脂质内毒素：细胞壁外层，属于细胞壁的组成部分（脂质内毒素：细胞壁外层，属于细胞壁的组成部分（脂质内毒素：细胞壁外层，属于细胞壁的组成部分（脂质A A A A）一般与细胞结合）一般与细胞结合）一般与细胞结合）一般与细胞结合在一起不分泌到环境中，只有当细菌溶解（裂解）后才释放出来，故称内在一起不分泌到环境中，只有当细菌溶解（裂解）后才释放出来，故称内在一起不分泌到环境中，只有当细菌溶解（裂解）后才释放出来，故称内在一起不分泌到环境中，只有当细菌溶解（裂解）后才释

7、放出来，故称内毒素。少量内毒素毒素。少量内毒素毒素。少量内毒素毒素。少量内毒素0.0010.0010.0010.001 g g g g入血即可引起发热反应。内毒素被吞噬细胞吞入血即可引起发热反应。内毒素被吞噬细胞吞入血即可引起发热反应。内毒素被吞噬细胞吞入血即可引起发热反应。内毒素被吞噬细胞吞饮后，细胞释放出内源性致热原，经血流到达下丘脑，饮后，细胞释放出内源性致热原，经血流到达下丘脑，饮后，细胞释放出内源性致热原，经血流到达下丘脑，饮后，细胞释放出内源性致热原，经血流到达下丘脑，体温调节中枢引体温调节中枢引体温调节中枢引体温调节中枢引起发热。起发热。起发热。起发热。uu作用特点：没有组织器官

8、的选择性作用特点：没有组织器官的选择性作用特点：没有组织器官的选择性作用特点：没有组织器官的选择性uu 肌体发热，腹泻，出血性休克或其他组织损伤肌体发热，腹泻，出血性休克或其他组织损伤肌体发热，腹泻，出血性休克或其他组织损伤肌体发热，腹泻，出血性休克或其他组织损伤uu 不能经甲醛脱毒不能经甲醛脱毒不能经甲醛脱毒不能经甲醛脱毒2、菌落（菌落（colony）：）：单个单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可肉眼可见见的、的、有一定形态结构的有一定形态结构的子细胞

9、生长群体。子细胞生长群体。菌落菌落单位为单位为CFU(Colony-Forming Units)。众多菌落连成一片菌苔（lawn）通常情况下，纯培养能较好地被研究、利用和重复结果，通常情况下，纯培养能较好地被研究、利用和重复结果，因此，把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、因此，把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是微生物学研究的基础。纯化出来的纯培养技术是微生物学研究的基础。3 细菌纯培养的群体生长规律 把一定微生物接种到一把一定微生物接种到一把一定微生物接种到一把一定微生物接种到一定量的液体培养基中，在定量的液体培养基中，在定量的液体培养基中，在定量的液体

10、培养基中，在一定条件下进行一次性培一定条件下进行一次性培一定条件下进行一次性培一定条件下进行一次性培养，定时取样测定活菌数，养，定时取样测定活菌数，养，定时取样测定活菌数，养，定时取样测定活菌数，以以以以活菌数的对数值活菌数的对数值活菌数的对数值活菌数的对数值为纵坐为纵坐为纵坐为纵坐标，以标，以标，以标，以培养时间培养时间培养时间培养时间为横坐标，为横坐标，为横坐标，为横坐标，就可以画出一条有规律的就可以画出一条有规律的就可以画出一条有规律的就可以画出一条有规律的曲线，这就是微生物的典曲线，这就是微生物的典曲线，这就是微生物的典曲线，这就是微生物的典型生长曲线（型生长曲线（型生长曲线（型生长曲

11、线（繁殖曲线繁殖曲线繁殖曲线繁殖曲线）.一般把典型生长曲线划分一般把典型生长曲线划分一般把典型生长曲线划分一般把典型生长曲线划分为为为为适应期、对数增长期适应期、对数增长期适应期、对数增长期适应期、对数增长期（指数期）、稳定期和衰（指数期）、稳定期和衰（指数期）、稳定期和衰（指数期）、稳定期和衰亡期亡期亡期亡期等四个时期。等四个时期。等四个时期。等四个时期。适应期对数增长期稳定期衰亡期uu球菌（直径）：球菌（直径）：球菌（直径）：球菌（直径）：0.5 10.5 1 m m m mm m uu杆菌（直径杆菌（直径杆菌（直径杆菌（直径长度）：长度）：长度）：长度）：0.2 1 0.2 1 m m

12、m mm m 1 5 1 5 m m m mmm青霉的分生孢子头青霉的分生孢子头青霉的分生孢子头青霉的分生孢子头根霉的孢子囊和孢囊孢子根霉的孢子囊和孢囊孢子根霉的孢子囊和孢囊孢子根霉的孢子囊和孢囊孢子酵母菌是对一类单细胞真菌的通称；酵母菌是对一类单细胞真菌的通称；有球形、卵形、椭圆形、圆柱形等；有球形、卵形、椭圆形、圆柱形等；大小在大小在5-20 m霉菌的霉菌的霉菌的霉菌的细胞呈细胞呈细胞呈细胞呈分枝或分枝或分枝或分枝或不分枝不分枝不分枝不分枝的丝状，的丝状，的丝状，的丝状，直径约直径约直径约直径约2 210 10 m细菌菌落细菌菌落 放线菌菌落放线菌菌落 霉菌霉菌菌落菌落湿干薄而小薄而小厚而

13、大厚而大密而小密而小厚而大厚而大细菌细菌酵母酵母放线菌放线菌霉菌霉菌酵母菌2010年版中国药典微生物检验主要年版中国药典微生物检验主要增修订内容增修订内容u1.培养基的质量控制培养基的质量控制u2.菌种的质量控制菌种的质量控制1.微生物检验培养基质量控制技术微生物检验培养基质量控制技术 培养基是微生物试验的基础，直接影培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。适宜的培养基制响微生物试验结果。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。提供优质培养基的保证。1.1培养基制备过程中的注意事项培养基制备过程中的注意事项 培养基的水化培养

14、基的水化 培养基水化时不得用铜锅或铁锅培养基水化时不得用铜锅或铁锅,以防有离以防有离 子混入培养基中子混入培养基中,影响微生物的生长；影响微生物的生长；配制培养基最常用的溶剂是纯化水配制培养基最常用的溶剂是纯化水,不能含不能含 有任何可能抑制或影响微生物生长的物质；有任何可能抑制或影响微生物生长的物质；培养基制备过程中的注意事项培养基制备过程中的注意事项 1.1.2 培养基的溶解培养基的溶解 在培养基分装灭菌前在培养基分装灭菌前,各成分应溶解均匀各成分应溶解均匀,使用电炉等设备煮沸培养基时使用电炉等设备煮沸培养基时,应用小火应用小火加热加热,并边加热边搅拌并边加热边搅拌,避免培养基焦化或避免培

15、养基焦化或爆沸溢出。爆沸溢出。培养基制备过程中的注意事项培养基制备过程中的注意事项1.1.3 培养基的灭菌培养基的灭菌 已配制好的培养基必须立即灭菌已配制好的培养基必须立即灭菌 湿热灭菌必须严格控制灭菌温度和时湿热灭菌必须严格控制灭菌温度和时间间培养基制备过程中的注意事项培养基制备过程中的注意事项 1.1.4 培养基的培养基的pH微生物必须在适宜的微生物必须在适宜的微生物必须在适宜的微生物必须在适宜的pHpH范围内才能正常生长繁范围内才能正常生长繁范围内才能正常生长繁范围内才能正常生长繁殖殖殖殖或体现其生物特性。或体现其生物特性。或体现其生物特性。或体现其生物特性。调整培养基的调整培养基的调整

16、培养基的调整培养基的pH,pH,应用应用应用应用1 mol/LNaOH1 mol/LNaOH或或或或1 1 mol/L mol/L HClHCl调整调整调整调整pHpH，一般灭菌前比最终，一般灭菌前比最终，一般灭菌前比最终，一般灭菌前比最终pHpH高高高高0.20.20.30.3。培养基制备过程中的注意事项培养基制备过程中的注意事项 1.1.5 培养基的保温培养基的保温 灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度,避免长时间保存在灭菌锅内避免长时间保存在灭菌锅内,造成过度灭菌造成过度灭菌,影响培养基的营养成分或选择性效果。影响培养基的营养成分或选择性效果。1.2

17、培养基质量控制（培养基质量控制（2010版药典）版药典）培养基适用性检查培养基适用性检查计数培养基计数培养基 控制菌检查用控制菌检查用培养基培养基 培养基适用性检查的基础培养基适用性检查的基础一、对照培养基一、对照培养基 系指按培养基处方系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查。由中国药品生物培养基适用性检查。由中国药品生物制品检定所研制及分发。制品检定所研制及分发。1.2.2 计数培养基适用性检查计数培养基适用性检查 大肠埃希菌大肠埃希菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 白色念珠菌白色念珠菌 黑曲霉黑曲霉 白色念珠

18、菌白色念珠菌营养琼脂培养基营养琼脂培养基Nutrient Agar(NA)玫瑰红钠琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基 酵母浸出粉胨葡萄糖酵母浸出粉胨葡萄糖 琼脂培养基琼脂培养基（YPD）Yeast Peptone Dextrose Agar 50-100CFU 1.2.2 计数培养基适用性检查计数培养基适用性检查 结果判定结果判定 被检培养基上的菌落平均数被检培养基上的菌落平均数 对照培养基上的菌落平均数对照培养基上的菌落平均数 菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致 70%菌落计数法证明培养基生长能力USPuuUSPUSP要求每批配制培养基作促生长能力测试要求

19、每批配制培养基作促生长能力测试要求每批配制培养基作促生长能力测试要求每批配制培养基作促生长能力测试uu菌种选择（变化大）：菌种选择（变化大）：菌种选择（变化大）：菌种选择（变化大）：每个微生物单独测试每个微生物单独测试每个微生物单独测试每个微生物单独测试uu大豆酪蛋白消化培养基：金葡，铜绿，枯草大豆酪蛋白消化培养基：金葡，铜绿，枯草大豆酪蛋白消化培养基：金葡，铜绿，枯草大豆酪蛋白消化培养基：金葡，铜绿，枯草uu沙堡葡萄糖培养基：白念，黑曲沙堡葡萄糖培养基：白念，黑曲沙堡葡萄糖培养基：白念，黑曲沙堡葡萄糖培养基：白念，黑曲uu方法：在培养中加入少量中（方法：在培养中加入少量中（方法：在培养中加入

20、少量中（方法：在培养中加入少量中（不超过不超过不超过不超过100cfu100cfu）的）的）的）的微生物，按要求培养。对于新鲜制备的菌液，生长微生物，按要求培养。对于新鲜制备的菌液，生长微生物，按要求培养。对于新鲜制备的菌液，生长微生物，按要求培养。对于新鲜制备的菌液，生长与前批已通过测试的培养基的前次测试结果一致。与前批已通过测试的培养基的前次测试结果一致。与前批已通过测试的培养基的前次测试结果一致。与前批已通过测试的培养基的前次测试结果一致。标准：标准：标准：标准：uu计数结果与标准接种物的计算量差别小于系数计数结果与标准接种物的计算量差别小于系数计数结果与标准接种物的计算量差别小于系数计

21、数结果与标准接种物的计算量差别小于系数2 2（即即即即 计数结果在标准接种物数量的计数结果在标准接种物数量的计数结果在标准接种物数量的计数结果在标准接种物数量的50%-200%50%-200%）。）。）。）。1.2.3 控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用培养基适用性检查 促生长能力促生长能力 抑制能力抑制能力 指示能力指示能力 检查项目检查项目1.2.3 控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用培养基适用性检查 促生长能力检查促生长能力检查增菌培养基促生长能力检查：增菌培养基促生长能力检查：分别接种不大于分别接种不大于100cfu 的试验菌于被检培的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相

22、应控制菌检查规定养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及的培养温度及最短培养时间最短培养时间下培养。与对照培下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。试验菌应生长良好。培养基基本要求培养基基本要求1.2.3 控制菌控制菌检查用培养基适用性检查检查用培养基适用性检查 促生长能力检查促生长能力检查固体培养基促生长能力检查：固体培养基促生长能力检查：取试验菌各取试验菌各0.1ml（含菌数（含菌数50100cfu）分别分别涂布涂布于被检培养基和对照培养基平板上，于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养在相应控制菌检查规

23、定的培养温度及最短培养时间下培养。被检培养基与对照培养基生长的时间下培养。被检培养基与对照培养基生长的菌落大小形态特征应一致。菌落大小形态特征应一致。培养基基本要求培养基基本要求USP控制菌检查用固体培养基能力检查：控制菌检查用固体培养基能力检查：uu使用表面涂布法，在培养中加入少量中使用表面涂布法，在培养中加入少量中（不超过不超过100cfu）的微生物，在规定温度）的微生物，在规定温度下培养不超过规定的最短时间。清楚的观下培养不超过规定的最短时间。清楚的观察到与前批已通过测试的培养基的前次测察到与前批已通过测试的培养基的前次测试结果一致。试结果一致。uu注：有生长就行，无数字上要求。注：有生

24、长就行，无数字上要求。1.2.3 控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用培养基适用性检查 抑制能力检查抑制能力检查培养基抑制能力检查：培养基抑制能力检查：接种不少于接种不少于100cfu 的试验菌于被检培的试验菌于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及度及最长时间最长时间下培养，下培养，试验菌应不得生长。试验菌应不得生长。针对选择性培养基：胆盐乳糖培养基、胆盐乳糖发酵针对选择性培养基：胆盐乳糖培养基、胆盐乳糖发酵培养基、四硫磺酸亮绿培养基；（金黄色葡萄球菌）培养基、四硫磺酸亮绿培养基；（金黄色葡萄球菌）溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基，亚碲酸盐肉汤培养

25、溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基，亚碲酸盐肉汤培养基、卵黄氯化钠琼脂培养基，甘露醇氯化钠琼脂培养基、卵黄氯化钠琼脂培养基，甘露醇氯化钠琼脂培养基，念珠菌显色培养基。（大肠埃希菌）基，念珠菌显色培养基。（大肠埃希菌）1.2.3 控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用培养基适用性检查 指示能力检查指示能力检查固体培养基指示能力检查：固体培养基指示能力检查：取试验菌各取试验菌各0.1ml（含菌数不大于（含菌数不大于100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。时间下培养。被检培

26、养基中试验菌生长的菌落被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。基一致。针对鉴别培养基针对鉴别培养基1.2.3 控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用培养基适用性检查 指示能力检查指示能力检查液体培养基指示能力检查：液体培养基指示能力检查：分别接种不大于分别接种不大于100cfu 的试验菌于被的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。养。与对照培养基管比较，被检培养基管与对照培养基管比较，被检培养基管试

27、验菌生长情况、指示剂反应等应与对照试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。培养基一致。针对鉴别培养基针对鉴别培养基典型特征典型特征大肠杆菌在伊红美蓝琼脂大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB，曙红亚甲蓝，曙红亚甲蓝)上典型特征上典型特征典型特征黑曲霉和白色念珠菌在玫瑰红钠琼脂黑曲霉和白色念珠菌在玫瑰红钠琼脂Rose Bengal Agar上典型特征上典型特征典型特征典型特征金黄色葡萄球菌在甘露醇氯化钠金黄色葡萄球菌在甘露醇氯化钠Mannitol Salt Agar琼脂上典型特征琼脂上典型特征典型特征典型特征沙门氏菌在沙门氏菌在SS琼脂上琼脂上沙门氏菌在沙门氏菌在BS琼脂（亚硫酸铋琼脂）上琼脂（

28、亚硫酸铋琼脂）上培养基质量控制（培养基质量控制（2010版药典）版药典）实验室配制的培养基的常规监控项目实验室配制的培养基的常规监控项目pH 适用性检查试验适用性检查试验 定期的稳定性定期的稳定性 检查以确定有效期检查以确定有效期 2.菌种的质量控制菌种的质量控制2.1 概念概念uu标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。遗传学特性得到确认和保证并可

29、追溯的菌株。uu标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培养物。养物。养物。养物。uu商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。菌株等效的菌株。菌株等效的菌株。菌株等效的菌株。uu代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养，代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养，代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养，代：将活的微生物接种

30、到新鲜培养基中进行培养，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，新培养物对接种培养物而言就称为一代。新培养物对接种培养物而言就称为一代。新培养物对接种培养物而言就称为一代。新培养物对接种培养物而言就称为一代。uu工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物。中国医学菌种保藏中心提供的标准菌株 美国国家菌种保藏中心提供的标准菌株 法国生物梅里埃公司

31、提供的商业派生菌株（Bioball)低温冷冻保藏的标准储备菌株低温蜡封保藏的标准储备菌株 我所制备的工作菌株uu中国药典中国药典中国药典中国药典20102010年版年版年版年版 在方法的附录中对菌种的规定同在方法的附录中对菌种的规定同在方法的附录中对菌种的规定同在方法的附录中对菌种的规定同20052005年版年版年版年版 在新增的在新增的在新增的在新增的“药品微生物实验室规范指导原则药品微生物实验室规范指导原则药品微生物实验室规范指导原则药品微生物实验室规范指导原则”中对菌种中对菌种中对菌种中对菌种有了较为明确的规定有了较为明确的规定有了较为明确的规定有了较为明确的规定uu允许使用标准菌株和商

32、业派生菌株允许使用标准菌株和商业派生菌株允许使用标准菌株和商业派生菌株允许使用标准菌株和商业派生菌株uu标准菌株应按保藏机构提供的说明进行复活标准菌株应按保藏机构提供的说明进行复活标准菌株应按保藏机构提供的说明进行复活标准菌株应按保藏机构提供的说明进行复活uu标准储备菌株应进行纯度和特性确认标准储备菌株应进行纯度和特性确认标准储备菌株应进行纯度和特性确认标准储备菌株应进行纯度和特性确认uu标准储备菌株建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存或超标准储备菌株建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存或超标准储备菌株建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存或超标准储备菌株建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存或超低温冷冻保藏的方法低温冷

33、冻保藏的方法低温冷冻保藏的方法低温冷冻保藏的方法uu标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株菌株菌株菌株uu冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用uu工作菌株不可替代标准菌株，商业派生菌株仅可用作工作菌株不可替代标准菌株，商业派生菌株仅可用作工作菌株不可替代标准菌株，商业派生菌株仅可用作工作菌株不可替代标准菌株，商业派生菌株仅可用作工作菌株工作

34、菌株工作菌株工作菌株uu菌种鉴定菌种鉴定简单的讲可以采用目前比较成熟的商品化鉴定简单的讲可以采用目前比较成熟的商品化鉴定简单的讲可以采用目前比较成熟的商品化鉴定简单的讲可以采用目前比较成熟的商品化鉴定技术，如技术，如技术，如技术，如APIAPI鉴定条鉴定条鉴定条鉴定条基本程序为：基本程序为：基本程序为：基本程序为：uu对疑似菌种进行纯培养对疑似菌种进行纯培养对疑似菌种进行纯培养对疑似菌种进行纯培养uu进行染色镜检进行染色镜检进行染色镜检进行染色镜检uu根据染色情况，并结合显色培养基等鉴定的初步信根据染色情况，并结合显色培养基等鉴定的初步信根据染色情况，并结合显色培养基等鉴定的初步信根据染色情况

35、，并结合显色培养基等鉴定的初步信息，选择合适的鉴定条息，选择合适的鉴定条息，选择合适的鉴定条息，选择合适的鉴定条uu根据操作说明书，得到各生化反应的鉴定结果，通根据操作说明书，得到各生化反应的鉴定结果，通根据操作说明书，得到各生化反应的鉴定结果，通根据操作说明书，得到各生化反应的鉴定结果，通过查阅检索表，得到菌种鉴定的初步结果过查阅检索表，得到菌种鉴定的初步结果过查阅检索表，得到菌种鉴定的初步结果过查阅检索表，得到菌种鉴定的初步结果uu也可以采用半自动或全自动的微生物鉴定系统也可以采用半自动或全自动的微生物鉴定系统也可以采用半自动或全自动的微生物鉴定系统也可以采用半自动或全自动的微生物鉴定系统

36、菌种的管理uu菌种的采购uu菌种的复苏uu菌种的传代uu菌种的保藏uu菌种的使用和销毁uu菌种的采购每年年底，由实验室菌种管理人员提出下一年每年年底，由实验室菌种管理人员提出下一年度菌种采购的计划，计划购置的菌种一般为药度菌种采购的计划，计划购置的菌种一般为药典收载的标准菌种，填写请购单，经批准后，典收载的标准菌种，填写请购单，经批准后，由所采购部门向指定的菌种保藏机构购置。由所采购部门向指定的菌种保藏机构购置。所购菌种均为冷冻干燥菌种。所购菌种均为冷冻干燥菌种。采购部门购入菌种后，应及时移交实验室。实采购部门购入菌种后，应及时移交实验室。实验室菌种管理人员应仔细核对菌种发放单和冷验室菌种管理

37、人员应仔细核对菌种发放单和冷冻干燥菌种管标签等各项信息，确认无误后，冻干燥菌种管标签等各项信息，确认无误后，置置4 46 6暂存。暂存。浙江省食品药品检验所菌种管理程序：浙江省食品药品检验所菌种管理程序：uu菌种的复苏菌种在打开前应仔细核对标签上菌名、菌号。菌种在打开前应仔细核对标签上菌名、菌号。并注意一株菌种使用一套打开用具，严防交叉并注意一株菌种使用一套打开用具，严防交叉污染。污染。菌种复苏应在生物安全柜内操作。菌种复苏应在生物安全柜内操作。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、生孢梭菌和白色念珠菌可同时接种液沙门菌、生孢梭菌和白色念珠

38、菌可同时接种液体培养基和琼脂培养基斜面，枯草芽孢杆菌、体培养基和琼脂培养基斜面，枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、藤黄微球菌和黑曲霉可接种琼短小芽孢杆菌、藤黄微球菌和黑曲霉可接种琼脂培养基斜面。脂培养基斜面。取琼脂培养基斜面上的菌苔按要求对菌种的纯取琼脂培养基斜面上的菌苔按要求对菌种的纯度进行鉴定。度进行鉴定。浙江省食品药品检验所菌种管理程序：浙江省食品药品检验所菌种管理程序：uu菌种的传代应在生物安全柜中进行菌种的传代应在生物安全柜中进行菌种的传代 。取经过纯度鉴定的第取经过纯度鉴定的第1 1代菌种管（琼脂培养基代菌种管（琼脂培养基斜面培养物）用于传代制备第斜面培养物）用于传代制备第2 2代菌种。

39、代菌种。接种完毕，液体培养基或琼脂培养基斜面应在接种完毕，液体培养基或琼脂培养基斜面应在规定的温度下培养适宜的时间，芽孢杆菌宜培规定的温度下培养适宜的时间，芽孢杆菌宜培养养5 56 6天，黑曲霉宜培养天，黑曲霉宜培养5 57 7天，其他菌种一天，其他菌种一般培养般培养18182424小时。小时。浙江省食品药品检验所菌种管理程序：浙江省食品药品检验所菌种管理程序：uu菌种的保藏保存的容器为无菌冻存管，保藏温度为保存的容器为无菌冻存管，保藏温度为-70-70。在冷冻前，应贴上菌种标签。标签内容应包括在冷冻前，应贴上菌种标签。标签内容应包括菌名、菌号、传代日期和有效期。菌名、菌号、传代日期和有效期。

40、所有冻存管应立即置低温冰箱中，迅速冷冻。所有冻存管应立即置低温冰箱中，迅速冷冻。该方法保藏菌种的有效期规定为该方法保藏菌种的有效期规定为6 6个月个月 。浙江省食品药品检验所菌种管理程序：浙江省食品药品检验所菌种管理程序：uu菌种的使用和销毁菌种的使用和销毁 本所保藏的菌种主要供本所检验工作使用并可对外提本所保藏的菌种主要供本所检验工作使用并可对外提供给有关涉药单位。本所提供的菌种为第二代低温冷供给有关涉药单位。本所提供的菌种为第二代低温冷冻菌种。冻菌种。本所检验工作所需菌种，领用人应向菌种管理人员领本所检验工作所需菌种，领用人应向菌种管理人员领取，并在菌种领用记录上记录菌名、数量、领用取，并

41、在菌种领用记录上记录菌名、数量、领用人等信息。人等信息。外单位向我所购买菌种，应凭单位介绍信，并注明菌外单位向我所购买菌种，应凭单位介绍信，并注明菌名、菌号、数量，必要时可预约购买。名、菌号、数量，必要时可预约购买。本所保藏的菌种，一般应每年更换原种（每年打开一本所保藏的菌种，一般应每年更换原种（每年打开一套冷冻干燥菌种传代制备第套冷冻干燥菌种传代制备第1 1代原种保存）。代原种保存）。过期菌种应及时销毁，销毁时应经过期菌种应及时销毁，销毁时应经121121 20 20分钟的生分钟的生物灭活处理。物灭活处理。浙江省食品药品检验所菌种管理程序：浙江省食品药品检验所菌种管理程序：uu通过制备工作菌

42、种进行菌种保藏的方法优点优点uu操作简便操作简便uu成本低成本低uu比较容易掌握比较容易掌握缺点缺点uu保存期比较短保存期比较短uu反复传代有引起变异的可能反复传代有引起变异的可能uu通过制备标准储备菌种进行菌种保藏的方法优点优点uu保存期较长保存期较长uu反复传代导致菌种变异的风险较小反复传代导致菌种变异的风险较小缺点缺点uu操作相对复杂操作相对复杂uu成本较高成本较高uu操作流程相对较长，受到污染的风险较高操作流程相对较长，受到污染的风险较高菌种保藏方法举例菌种保藏方法举例申请号申请号申请号申请号/专利号：专利号：专利号：专利号：200810124325 200810124325uu本发明

43、提供了一种菌种保藏方法，采用半固体、低温密封培本发明提供了一种菌种保藏方法，采用半固体、低温密封培本发明提供了一种菌种保藏方法，采用半固体、低温密封培本发明提供了一种菌种保藏方法，采用半固体、低温密封培养的方法：将菌种接种于无菌的半固体培养基中，倒入无菌养的方法：将菌种接种于无菌的半固体培养基中，倒入无菌养的方法：将菌种接种于无菌的半固体培养基中，倒入无菌养的方法：将菌种接种于无菌的半固体培养基中，倒入无菌液体石蜡后竖直存放入液体石蜡后竖直存放入液体石蜡后竖直存放入液体石蜡后竖直存放入的环境温度中保存。所述菌的环境温度中保存。所述菌的环境温度中保存。所述菌的环境温度中保存。所述菌种为金黄色葡萄

44、球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽种为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽种为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽种为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色链珠菌。具体过程为：制孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色链珠菌。具体过程为：制孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色链珠菌。具体过程为：制孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色链珠菌。具体过程为：制备半固体培养基，分装、灭菌，然后培养天，确定无备半固体培养基，分装、灭菌，然后培养天，确定无备半固体培养基，分装、灭菌，然后培养天，确定无备半固体培养基，分装、灭菌，然后培养天，确定无菌后将菌种穿刺

45、接种于半固体培养基中，平行于培养基平面菌后将菌种穿刺接种于半固体培养基中，平行于培养基平面菌后将菌种穿刺接种于半固体培养基中，平行于培养基平面菌后将菌种穿刺接种于半固体培养基中，平行于培养基平面穿刺接种不少于点。倒入高的无菌液体石蜡，穿刺接种不少于点。倒入高的无菌液体石蜡，穿刺接种不少于点。倒入高的无菌液体石蜡，穿刺接种不少于点。倒入高的无菌液体石蜡，用封口膜密封，竖直存放入用封口膜密封，竖直存放入用封口膜密封，竖直存放入用封口膜密封，竖直存放入的电冰箱中保存。采用的电冰箱中保存。采用的电冰箱中保存。采用的电冰箱中保存。采用本发明可延长菌种的保存时间，同时菌种的浓度保持相对稳本发明可延长菌种的

46、保存时间，同时菌种的浓度保持相对稳本发明可延长菌种的保存时间，同时菌种的浓度保持相对稳本发明可延长菌种的保存时间，同时菌种的浓度保持相对稳定，为生产、试验节约了大量的成本，减少了菌种使用后废定，为生产、试验节约了大量的成本，减少了菌种使用后废定，为生产、试验节约了大量的成本，减少了菌种使用后废定，为生产、试验节约了大量的成本，减少了菌种使用后废弃物的处理和排放，减少了对环境的危害。弃物的处理和排放，减少了对环境的危害。弃物的处理和排放，减少了对环境的危害。弃物的处理和排放，减少了对环境的危害。斜面保藏保藏法:uu一般使用营养琼脂培养基一般使用营养琼脂培养基,生孢梭菌使用液生孢梭菌使用液体硫乙醇

47、酸盐培养基体硫乙醇酸盐培养基,在在3035培养培养1824小时小时.存活时间存活时间13个月个月.斜面保藏斜面保藏的菌种在冰箱中放置应注意控制温度的菌种在冰箱中放置应注意控制温度,一般一般不宜低于不宜低于4,也可以放置在室温中也可以放置在室温中,但应控但应控制温度不超过制温度不超过25.有关菌种的常见问题uu阳性菌的制备：领取工作菌种，从斜面上取一定量的培养物，稀释至系列梯度的菌悬液，分别测各梯度菌悬液的菌落数。临用时，取相应稀释菌悬液用于阳性试验，同时用平皿法测定加入的菌液中的菌落数。是否可行？对照用菌液的制备应取工作菌种，接种置适宜对照用菌液的制备应取工作菌种，接种置适宜的液体培养基中，经

48、培养后获得浓菌液，再进的液体培养基中，经培养后获得浓菌液，再进行稀释和确定菌浓度行稀释和确定菌浓度uu菌种传代至第5代时，还能不能用该斜面菌种接种制备工作用菌液严格讲，这种操作是不符合药典规定的。药典严格讲，这种操作是不符合药典规定的。药典所指的传代次数不超过所指的传代次数不超过5 5代，应该是指用于实代，应该是指用于实验的工作用菌液。因此，从保藏的角度看，制验的工作用菌液。因此，从保藏的角度看，制备成的斜面保藏菌种只能到第备成的斜面保藏菌种只能到第4 4代。代。uu阳性对照是否必须购买菌种？有效期一般为多长时间？对照用菌种应采用标准菌种，一般应外购对照用菌种应采用标准菌种，一般应外购有效期根

49、据不同菌种，不同的保藏方法而异，有效期根据不同菌种，不同的保藏方法而异，如采用斜面移植保藏法，不能形成芽孢的细菌如采用斜面移植保藏法，不能形成芽孢的细菌有效期一般为有效期一般为1 1个月，能形成芽孢的细菌有效个月，能形成芽孢的细菌有效期一般为期一般为3 3个月，真菌的有效期为个月，真菌的有效期为3 3个月。个月。uu如何对菌种进行复壮，传代之前是否一定要做微生物学鉴定，确认是否有变异。复壮的方法应根据待复壮的菌种的保藏形式来复壮的方法应根据待复壮的菌种的保藏形式来确定。对冻干菌种，复壮操作较为繁琐确定。对冻干菌种，复壮操作较为繁琐微生物传代中的菌种确认是必须的。微生物传代中的菌种确认是必须的。

50、uu以短小芽孢杆菌为例说说细菌鉴定通过显微鉴别，为不呈链状排列的杆菌，革兰通过显微鉴别，为不呈链状排列的杆菌，革兰氏染色为阳性。氏染色为阳性。营养琼脂斜面上菌苔光滑，薄，闪光，蔓延，营养琼脂斜面上菌苔光滑，薄，闪光，蔓延，不粘着，常常是浅黄色。不粘着，常常是浅黄色。生化试验可选做明胶穿刺、淀粉水解和硝酸盐生化试验可选做明胶穿刺、淀粉水解和硝酸盐还原还原 ，结果为明胶缓慢液化，淀粉水解阴性，结果为明胶缓慢液化，淀粉水解阴性，硝酸盐还原阴性。硝酸盐还原阴性。采用采用APIAPI鉴定条，结合染色镜检和接触酶实验鉴定条，结合染色镜检和接触酶实验等结果等结果微生物基本操作uu1、纯培养技术uu2、微生物