新版《医院消毒卫生标准_》修订交流分享(实验部分)[1].ppt

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1、中华人民共和国国家标准公告中华人民共和国国家标准公告20122012年第年第1313号号关于批准发布关于批准发布三相异步电动机试验方法三相异步电动机试验方法等等352352项国家标准项国家标准和和4545项国家标准样品的公告项国家标准样品的公告国家质量监督检验检疫总局、国家标准化管理委员会批准国家质量监督检验检疫总局、国家标准化管理委员会批准三相异步电动机试验方法三相异步电动机试验方法等等352352项国家标准和项国家标准和4545项国家标准样品，现予以公布。项国家标准样品，现予以公布。二二一二年六月二十九日一二年六月二十九日序号序号标准号标准号标准名称标准名称代替标准号代替标准号实施日实施日

2、期期63GB15982-201263GB15982-2012医院消毒卫生标准医院消毒卫生标准GB15982-19952012-11-01GB15982-19952012-11-012021/9/102021/9/101 1附录附录A A：采样及检查方法：采样及检查方法采样和检查原则；采样和检查原则；空气微生物污染检查法；空气微生物污染检查法；物体表面微生物污染检方法；物体表面微生物污染检方法；医务人员手卫生检查方法；医务人员手卫生检查方法；医疗器材检查方法；医疗器材检查方法；消毒剂检查方法；消毒剂检查方法；治疗用水检查方法；治疗用水检查方法；紫外线灯检查方法；紫外线灯检查方法；消毒器械检查方法

3、；消毒器械检查方法；医院污水检查方法；医院污水检查方法；疫点（区）消毒效果检测方法；大肠菌群检查方法；沙门菌检查方法；乙型溶血性链球菌检查方法；铜绿假单胞菌检查方法；金黄色葡萄球菌检查方法；其他目标微生物检查方法。2021/9/102021/9/102 2A1 A1 采样和检查原则采样和检查原则采样后应尽快对样品进行相应指标的检测，送检时间不得超过采样后应尽快对样品进行相应指标的检测，送检时间不得超过4h4h；若样；若样品保存于品保存于0 04 4时，送检时间不得超过时，送检时间不得超过24h24h。不推荐医院常规开展不推荐医院常规开展灭菌物品的无菌检查灭菌物品的无菌检查灭菌物品的无菌检查灭菌

4、物品的无菌检查，当流行病学调查怀疑医院感，当流行病学调查怀疑医院感染事件与灭菌物品有关时，进行相应物品的无菌检查。染事件与灭菌物品有关时，进行相应物品的无菌检查。常规监督检查可不进行常规监督检查可不进行致病性微生物检测致病性微生物检测致病性微生物检测致病性微生物检测，涉及疑似医院感染暴发、医，涉及疑似医院感染暴发、医院感染暴发调查或工作中怀疑微生物污染时，应进行目标微生物的检测。院感染暴发调查或工作中怀疑微生物污染时，应进行目标微生物的检测。可使用经验证的可使用经验证的现场快速检测仪器现场快速检测仪器现场快速检测仪器现场快速检测仪器进行环境、物体表面等微生物污染情进行环境、物体表面等微生物污染

5、情况和医疗器材清洁度的监督筛查；也可用于医院清洗效果检查和清洗程况和医疗器材清洁度的监督筛查；也可用于医院清洗效果检查和清洗程序的评价和验证。序的评价和验证。2021/9/102021/9/103 3A2 A2 空气微生物污染检查方法空气微生物污染检查方法1 1、采样时间、采样时间类环境在洁净系统自净后与从事医疗活动前采样；类环境在洁净系统自净后与从事医疗活动前采样；、类环境在消毒或规定的通类环境在消毒或规定的通风换气后与从事医疗活动前采样。风换气后与从事医疗活动前采样。2 2、检测方法、检测方法类环境可选择平板暴露法和空气采样器法类环境可选择平板暴露法和空气采样器法类环境可选择平板暴露法和空

6、气采样器法类环境可选择平板暴露法和空气采样器法，参照，参照GB50333GB50333医院洁净手术部建筑技术规医院洁净手术部建筑技术规范范要求进行检测。空气采样器法可选择六级撞击式空气采样器或其他经验证的空气采样要求进行检测。空气采样器法可选择六级撞击式空气采样器或其他经验证的空气采样器。检测时将采样器置于室内中央器。检测时将采样器置于室内中央0.8m0.8m1.5m1.5m高度，按采样器使用说明书操作，每次采样高度，按采样器使用说明书操作，每次采样时间不应超过时间不应超过30min30min。房间大于。房间大于10m10m2 2者，每增加者，每增加10m10m2 2增设一个采样点。增设一个采

7、样点。、类环境采用平板暴露法类环境采用平板暴露法类环境采用平板暴露法类环境采用平板暴露法：室内面积：室内面积 30m30m2 2，设内、中、外对角线，设内、中、外对角线3 3点，内、外点，内、外点应距墙壁点应距墙壁1m1m处；室内面积处；室内面积30m30m2 2，设，设44角及中央角及中央55点，点，4 4角的布点部位应距墙壁角的布点部位应距墙壁1m1m处。处。将普通营养琼脂平皿将普通营养琼脂平皿(90mm)(90mm)放置各采样点，采样高度为距地面放置各采样点，采样高度为距地面0.8m0.8m1.5m1.5m；采样时将；采样时将平皿盖打开，扣放于平皿旁，暴露规定时间（平皿盖打开，扣放于平皿

8、旁，暴露规定时间（类环境暴露类环境暴露15min15min，、类环境暴露类环境暴露5min5min）后盖上平皿盖及时送检。将送检平皿置）后盖上平皿盖及时送检。将送检平皿置363611恒温箱恒温箱培养培养培养培养48h48h，计数菌落数，必，计数菌落数，必要时分离致病性微生物。要时分离致病性微生物。3 3、结果计算、结果计算平板暴露法按平均每皿的菌落数报告：平板暴露法按平均每皿的菌落数报告：cfu/cfu/皿皿 暴露时间暴露时间。2021/9/102021/9/104 42021/9/102021/9/105 52021/9/102021/9/106 62021/9/102021/9/107 7

9、A3 A3 物体表面污染检查方法物体表面污染检查方法1 1、采样时间、采样时间潜在污染区、污染区消毒后采样。潜在污染区、污染区消毒后采样。清洁区根据现场情况确定清洁区根据现场情况确定清洁区根据现场情况确定清洁区根据现场情况确定。2 2、采样面积、采样面积被采表面被采表面100cm100cm2 2，取全部表面；被采表面，取全部表面；被采表面 100cm100cm2 2，取，取100cm100cm2 2。采样方法采样方法用用5cm5cm5cm5cm灭菌规格板放在被检物体表面，用浸有无菌灭菌规格板放在被检物体表面，用浸有无菌PBSPBS或生理盐或生理盐水采样液的棉拭子水采样液的棉拭子1 1支，在规格

10、板内横竖往返各涂抹支，在规格板内横竖往返各涂抹5 5次，并随之转动棉次，并随之转动棉拭子，连续采样拭子，连续采样1 14 4个规格板面积，剪去手接触部分，将棉拭子放入装个规格板面积，剪去手接触部分，将棉拭子放入装有有10mL10mL采样液的试管中送检。门把手等小型物体则采用棉拭子直接涂抹采样液的试管中送检。门把手等小型物体则采用棉拭子直接涂抹物体采样。若采样物体表面有消毒剂残留时，采样液应含相应中和剂。物体采样。若采样物体表面有消毒剂残留时，采样液应含相应中和剂。3 3、检测方法、检测方法把采样管充分振荡后，取不同稀释倍数的洗脱液把采样管充分振荡后，取不同稀释倍数的洗脱液1.0mL1.0mL接

11、种平皿，将接种平皿，将冷至冷至40404545的熔化营养琼脂培养基每皿倾注的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15mL15mL20mL20mL，363611恒温箱培养恒温箱培养48h48h，计数菌落数，必要时分离致病性微生物。，计数菌落数，必要时分离致病性微生物。2021/9/102021/9/108 8A4 A4 医务人员手卫生检查方法医务人员手卫生检查方法11采样时间采样时间采取手卫生后，在接触病人或从事医疗活动前采样。采取手卫生后，在接触病人或从事医疗活动前采样。22采样方法采样方法将浸有无菌将浸有无菌0.03mol/L0.03mol/L磷酸盐缓冲液或生理盐水采样液的棉拭子一支在双手磷酸盐缓冲液

12、或生理盐水采样液的棉拭子一支在双手指曲面从指根到指端来回涂擦各两次（一只手涂擦面积约指曲面从指根到指端来回涂擦各两次（一只手涂擦面积约30cm30cm2 2），并随之转），并随之转动采样棉拭子，剪去手接触部分，将棉拭子放入装有动采样棉拭子，剪去手接触部分，将棉拭子放入装有10mL10mL采样液的试管内送检。采样液的试管内送检。采样面积按平方厘米（采样面积按平方厘米（cmcm2 2）计算。若采样时手上有消毒剂残留，采样液应含相）计算。若采样时手上有消毒剂残留，采样液应含相应中和剂。应中和剂。33检测方法检测方法把采样管充分振荡后，取不同稀释倍数的洗脱液把采样管充分振荡后，取不同稀释倍数的洗脱液1

13、.0mL1.0mL接种平皿，将冷至接种平皿，将冷至40404545的熔化营养琼脂培养基每皿倾注的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15mL15mL20mL20mL，363611恒温箱培恒温箱培养养48h48h，计数菌落数，必要时分离致病性微生物。，计数菌落数，必要时分离致病性微生物。2021/9/102021/9/109 9手、物表采样液手、物表采样液吐温吐温8080（2%2%）20g20g卵磷脂（卵磷脂（0.3%0.3%）3g3g硫代硫酸钠（硫代硫酸钠（5 H2O5 H2O）（）（0.5%0.5%）7.85g7.85g蛋白胨蛋白胨 10g10g氯化钠氯化钠 8.5g8.5gPBS 1000mlPBS

14、 1000ml 最终最终pH7.2pH7.27.47.42021/9/102021/9/101010A5 A5 医疗器材检查方法医疗器材检查方法1 1、采样时间、采样时间在消毒或灭菌处理后，存放有效期内采样。在消毒或灭菌处理后，存放有效期内采样。2 2、灭菌医疗器材的检查方法、灭菌医疗器材的检查方法可用破坏性方法取样的，如一次性输液（血）器、注射器和可用破坏性方法取样的，如一次性输液（血）器、注射器和注射针等注射针等参照参照参照参照中华人民共和国药典中华人民共和国药典中华人民共和国药典中华人民共和国药典“无菌检查法无菌检查法无菌检查法无菌检查法”进行进行进行进行。对不能用破坏性方法取样的医疗器

15、材，应在环境洁净度对不能用破坏性方法取样的医疗器材，应在环境洁净度1000010000级下的局部洁净度级下的局部洁净度100100级的单向流空气区域内或隔离级的单向流空气区域内或隔离系统中，用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子在被检物体表系统中，用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子在被检物体表面涂抹，采样取全部表面或不少于面涂抹，采样取全部表面或不少于100cm100cm2 2；然后将除去手；然后将除去手接触部分的棉拭子进行无菌检查。接触部分的棉拭子进行无菌检查。2021/9/102021/9/101111手机采样方法决定检测结果！手机采样方法决定检测结果！棉签涂擦法不能体现手机的无菌性！棉签涂擦法不

16、能体现手机的无菌性！3 3、牙科手机：、牙科手机：应在环境洁净度应在环境洁净度1000010000级下的局部洁净度级下的局部洁净度100100级的单向流空级的单向流空气区域内或隔离系统中，将每支手机分别置于含气区域内或隔离系统中，将每支手机分别置于含20mL20mL25mL25mL采样液的采样液的无菌大试管（内径无菌大试管（内径无菌大试管（内径无菌大试管（内径25mm25mm）中，液面高度应中，液面高度应大于大于4.0cm4.0cm，于旋涡混合器上洗涤震荡，于旋涡混合器上洗涤震荡30s30s以上，取洗脱液进以上，取洗脱液进行无菌检查。行无菌检查。2021/9/102021/9/101212消毒

17、医疗器材的检查方法消毒医疗器材的检查方法可可整件整件放入无菌试管的，用洗脱液浸没后震荡放入无菌试管的，用洗脱液浸没后震荡30s30s以上，取洗脱液以上，取洗脱液1.0mL1.0mL接种平皿，将冷至接种平皿，将冷至40404545的熔化营养琼脂培养基每皿倾注的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15mL15mL20mL20mL，363611恒温箱培养恒温箱培养48h48h，计数菌落数（，计数菌落数（cfu/cfu/件），必要时分离件），必要时分离致病性微生物。可用致病性微生物。可用破坏性方法取样破坏性方法取样的，在的，在100100级超净工作台称取级超净工作台称取1 110g10g样品，放入装有样品，放入

18、装有10mL10mL采样液的试管内进行洗脱，取洗脱液采样液的试管内进行洗脱，取洗脱液1.0mL1.0mL接接种平皿，计数菌落数（种平皿，计数菌落数（cfu/gcfu/g），必要时分离致病性微生物。对不能用破），必要时分离致病性微生物。对不能用破坏性方法取样的医疗器材，在坏性方法取样的医疗器材，在100100级超净工作台，用浸有无菌生理盐水采级超净工作台，用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子在被检物体表面样液的棉拭子在被检物体表面涂抹采样涂抹采样，被采表面，被采表面100cm100cm2 2，取全部表，取全部表面，被采表面面，被采表面 100cm100cm2 2，取，取100cm100cm2 2，然

19、后将除去手接触部分的棉拭子，然后将除去手接触部分的棉拭子进行洗脱，取洗脱液进行洗脱，取洗脱液1.0mL1.0mL接种平皿，将冷至接种平皿，将冷至40404545的熔化营养琼的熔化营养琼脂培养基每皿倾注脂培养基每皿倾注15mL15mL20mL20mL，363611恒温箱培养恒温箱培养48h48h，计数菌落，计数菌落数（数（cfu/cmcfu/cm2 2），必要时分离致病性微生物。），必要时分离致病性微生物。2021/9/102021/9/101313消毒后内镜采样方法消毒后内镜采样方法取清洗消毒后内镜，采用无菌注射器抽取取清洗消毒后内镜，采用无菌注射器抽取50mL50mL含相应中和含相应中和剂的

20、洗脱液，从剂的洗脱液，从活检口活检口注入冲洗内镜管路，并全量收集（注入冲洗内镜管路，并全量收集（可可使用使用MODELBL100MODELBL100型蠕动泵型蠕动泵【1.01.0100.0100.0转转/min/min】）送检。）送检。将洗脱液充分混匀，取洗脱液将洗脱液充分混匀，取洗脱液1.0mL1.0mL接种平皿，将冷至接种平皿，将冷至40404545的熔化营养琼脂培养基每皿倾注的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15mL15mL20mL20mL，363611恒温箱培养恒温箱培养48h48h，计数菌落数（，计数菌落数（cfu/cfu/件）。将件）。将剩余剩余洗脱液洗脱液在无菌条件下采用滤膜（在无菌条

21、件下采用滤膜（0.45m0.45m）过滤浓缩过滤浓缩，将滤，将滤膜接种于凝固的营养琼脂平板上（注意不要产生气泡），置膜接种于凝固的营养琼脂平板上（注意不要产生气泡），置363611温箱培养温箱培养48h48h，计数菌落数。，计数菌落数。2021/9/102021/9/101414采样前准备无菌手套，80ML容量的螺口瓶及中和剂。采样前需要瓶口酒精灯烧灼消毒。抽取中和剂，需要用50的一次性注射器抽取，注意无菌操作。将中和剂从内镜注水口缓缓注入，避免喷溅，注意无菌操作，手不能接触到“推柱”内侧。同时将出水端放入螺口瓶中，注意不要污染。盖上盖子前仍酒精灯瓶口烧灼盖上盖子前仍酒精灯瓶口烧灼再旋紧盖子，

22、及时送检。再旋紧盖子，及时送检。1234562021/9/102021/9/101515A6 A6 消毒剂检查方法消毒剂检查方法1 1、消毒剂采样分库存消毒剂和使用中消毒液。、消毒剂采样分库存消毒剂和使用中消毒液。2 2、消毒剂有效成分含量检查方法、消毒剂有效成分含量检查方法库存消毒剂的有效成分含量应依照库存消毒剂的有效成分含量应依照消毒技术规范消毒技术规范或产品企业标准进行检测；或产品企业标准进行检测；使用中消毒液的有效浓度测定可用前述方法，也可使用经国家卫生行政部门批准使用中消毒液的有效浓度测定可用前述方法，也可使用经国家卫生行政部门批准的消毒剂浓度试纸（卡）进行监测。的消毒剂浓度试纸（卡

23、）进行监测。3 3、使用中消毒液染菌量检查方法、使用中消毒液染菌量检查方法用无菌吸管按无菌操作方法吸取用无菌吸管按无菌操作方法吸取1.0mL1.0mL被检消毒液，加入被检消毒液，加入9mL9mL中和剂中混匀；醇类中和剂中混匀；醇类与酚类消毒剂用普通营养肉汤中和，含氯消毒剂、含碘消毒剂和过氧化物消毒剂与酚类消毒剂用普通营养肉汤中和，含氯消毒剂、含碘消毒剂和过氧化物消毒剂用含用含0.1%0.1%硫代硫酸钠中和剂，洗必泰、季铵盐类消毒剂用含硫代硫酸钠中和剂，洗必泰、季铵盐类消毒剂用含0.3%0.3%（W/VW/V）吐温）吐温8080和和0.3%0.3%卵磷脂中和剂，醛类消毒剂用卵磷脂中和剂，醛类消毒

24、剂用0.3%0.3%甘氨酸中和剂，有表面活性剂的各种复甘氨酸中和剂，有表面活性剂的各种复方消毒剂可在中和剂中加吐温方消毒剂可在中和剂中加吐温8080至至3%3%（W/VW/V）；也可使用该消毒剂消毒效果检测；也可使用该消毒剂消毒效果检测的中和剂鉴定实验确定的中和剂。用无菌吸管吸取一定稀释比例的中和后混合液的中和剂鉴定实验确定的中和剂。用无菌吸管吸取一定稀释比例的中和后混合液1.0mL1.0mL接种平皿，将冷至接种平皿，将冷至40404545的熔化营养琼脂培养基每皿倾注的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15mL15mL20mL20mL，361361恒温箱恒温箱培养培养72h72h，计数菌落数；必要时分

25、离致病性微生物。，计数菌落数；必要时分离致病性微生物。消毒液染菌量消毒液染菌量(cfu/mL)(cfu/mL)平均每皿菌落数平均每皿菌落数1010稀释倍数稀释倍数(A.6)(A.6)2021/9/102021/9/101616使用中消毒液采样液使用中消毒液采样液吐温吐温8080（3%3%）30g30g卵磷脂（卵磷脂（0.3%0.3%）3g3g硫代硫酸钠（硫代硫酸钠（5 H2O5 H2O）（）（0.5%0.5%）7.85g7.85g甘氨酸甘氨酸 （0.5%0.5%）5g5g营养肉汤营养肉汤 1000ml1000ml调节调节pH7.2pH7.27.47.42021/9/102021/9/10171

26、7A7 A7 治疗用水检查方法治疗用水检查方法血液透析相关治疗用水按血液透析相关治疗用水按YY 0572YY 0572血液透析和相关血液透析和相关治疗用水治疗用水进行检测。进行检测。1 1、试样应在收集后、试样应在收集后30min30min内进行检测，或立即放在内进行检测，或立即放在1155下储存，下储存，24h24h内检测。内检测。2 2、应采用、应采用倾注平板法倾注平板法倾注平板法倾注平板法细菌总数计数。培养基应为胰蛋白酶大豆琼脂或等细菌总数计数。培养基应为胰蛋白酶大豆琼脂或等价物，价物，35353737培养培养48h48h，48h48h后若呈阴性可后若呈阴性可72h72h后再检查。也可采

27、用后再检查。也可采用膜膜膜膜过滤技术过滤技术过滤技术过滤技术滤除滤除500mL500mL1000mL1000mL水水,并在并在R2AR2A低营养琼脂培养基上低营养琼脂培养基上,可可28283232下培养下培养5d5d或更长时间。或更长时间。3 3、应用、应用鲎试剂法鲎试剂法鲎试剂法鲎试剂法检查内毒素。检查内毒素。其他治疗用水参照相关标准执行。其他治疗用水参照相关标准执行。口腔诊疗冲洗用水等。口腔诊疗冲洗用水等。2021/9/102021/9/101818内毒素：主要成分为脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），LPS主要致热及毒性部分为脂质A（Lipid A）。内毒素有高水溶性

28、，高耐热性，难以灭活及清除，有极强的发热效应，是最常见的外致热源，是血液制品和输液过程中的主要污染物。2021/9/102021/9/101919细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。2021/9/102021/9/102020细菌内毒素检查包括两种方法：凝胶法：系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。光度测定法：浊度法/显色基质法供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU 与

29、1 个内毒素国际单位（IU）相当。2021/9/102021/9/102121试验环境：百级洁净工作台。本试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染。本试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染。试验用器材：仪器仪器：试管恒温仪（恒温水浴箱）、试管、刻度吸管、移液器等。材料：材料：细菌内毒素标准品、鲎试剂、细菌内毒素检查用水等。2021/9/102021/9/102222细菌内毒素国家标准细菌内毒素国家标准品（品（RSERSE）系自）系自大肠大肠埃埃希菌提取精制而成，希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标定细菌内毒素工作标准品的效价

30、。准品的效价。细菌内毒素工作标准细菌内毒素工作标准品品(CSE)(CSE)系以细菌内毒系以细菌内毒素国家标准品为基准素国家标准品为基准标定其效价，用于试标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各复核、干扰试验及各种阳性对照。种阳性对照。细菌内毒素标准品：细菌内毒素标准品：2021/9/102021/9/102323细菌内毒素检查用水：细菌内毒素检查用水：细菌内毒素检查用水：细菌内毒素检查用水：系指内毒素含量小于系指内毒素含量小于0.015EU0.015EUmlml（用于凝胶法）或（用于凝胶法）或0.005EU/ml0.005EU/ml（用于光度侧定法）且（用于光度

31、侧定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。试验所用的器皿：试验所用的器皿：试验所用的器皿：试验所用的器皿：需经处理，以去除可能存在的外源性内需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250250、3030分钟以上分钟以上)去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。头等，应选用标明无内毒素并且对试验

32、无干扰的器械。供试品溶液的制备：供试品溶液的制备：供试品溶液的制备：供试品溶液的制备：一般要求供试品溶液的一般要求供试品溶液的pHpH值在值在6.06.08.08.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pHpH值，可使用酸、值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节碱溶液或适宜的缓冲液调节pHpH值。酸或碱溶液须用细菌值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。须经过

33、验证不含内毒素和干扰因子。2021/9/102021/9/102424 内毒素限值的确定内毒素限值的确定内毒素限值的确定内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（药品、生物制品的细菌内毒素限值（L L）一般按）一般按以下公式确定：以下公式确定：L=K/ML=K/M 式中式中LL为供试品的细菌内毒素限值，一般以为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/mlEU/ml、EU/mgEU/mg或或EUEU/U/U（活性单位）表示；（活性单位）表示；KK为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kghEU/(kgh）表示，注射剂）表示，注射剂K

34、=5EU/(kgh)K=5EU/(kgh)，放射性药品注射剂，放射性药品注射剂K=2.5EU/K=2.5EU/（kgh)kgh)，鞘内用注射剂，鞘内用注射剂K=0.2EU/K=0.2EU/（kgh)kgh)；MM为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kghml/(kgh）、）、mg/(kghmg/(kgh）或）或U/(kghU/(kgh）表示，人均体重按）表示，人均体重按60kg60kg计算，人体计算，人体表面积按表面积按1.62m21.62m2计算。注射时间若不足计算。注射时间若不足11小时，按小时，按11小时计算。供试小时计算。供试品每

35、平方米体表面积剂量乘以品每平方米体表面积剂量乘以0.0270.027即可转换为每千克体重剂量即可转换为每千克体重剂量（MM）。）。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。情况做必要调整，但需说明理由。2021/9/102021/9/102525确定最大有效稀释倍数（确定最大有效稀释倍数（确定最大有效稀释倍数（确定最大有效稀释倍数（MVD MVD MVD MVD）最大有效稀释倍数是最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数(

36、1MVD)1MVD)，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定的检测。用以下公式来确定MVD:MVD:MVD=cL/MVD=cL/式中式中L L 为供试品的细菌内毒素限值；为供试品的细菌内毒素限值；c c 为供试品溶液的浓度，当为供试品溶液的浓度，当L L 以以EU/ml EU/ml 表示时，则表示时，则c c等等于于1.0ml/ml 1.0ml/ml，当，当L L 以以EU/mg EU/mg 或或EU/U EU/U 表示时，表示时，c c的的单位需为单位需为mg/ml mg/ml 或或U/mlU/ml。如供试品为注射用无菌粉末

37、。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则或原料药，则MVD MVD 取取1 1，可计算供试品的最小有效稀释浓，可计算供试品的最小有效稀释浓度度c=/L c=/L；为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度 EU/ml),EU/ml),或或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。2021/9/102021/9/102626计算举例：计算举例：当当L L以以EU/mlEU/ml表示时，则表示时，则C C等于等于1.0ml/ml 1.0ml/ml 适用于供试品为溶液状态，并且规定限值为应小适用于供试品为溶液状态，并且规定

38、限值为应小于于xx EU/mlxx EU/ml。例：计算限值为例：计算限值为2.0 EU/ml2.0 EU/ml，使用灵敏度为，使用灵敏度为0.25 0.25 EU/mlEU/ml的鲎试剂进行检验，则的鲎试剂进行检验，则 MVD=1.0ml/mlMVD=1.0ml/ml 2.0 2.0 EUEU/ml0.25EU/ml=8ml0.25EU/ml=8倍倍2021/9/102021/9/102727鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验：在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml 表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的

39、改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。2021/9/102021/9/102828根据鲎试剂灵敏度的标示值（根据鲎试剂灵敏度的标示值（），将细菌内毒），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡棍合器上混匀毒素检查用水溶解，在旋涡棍合器上混匀1515分钟，分钟，然后制成然后制成22、0.50.5和和0.250.25四个浓度的内四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀混匀30 30 秒钟。取分装有秒钟。取分装有0.1ml 0.1ml 鲎试剂溶液的鲎试剂溶液的10m

40、m75mm 10mm75mm 试管或复溶后的试管或复溶后的0.1ml/0.1ml/支规格的鲎试支规格的鲎试剂原安瓶剂原安瓶18 18 支，其中支，其中16 16 管分别加入管分别加入0.1ml 0.1ml 不同不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做做4 4 管；另外管；另外2 2 管加人管加人0.1ml 0.1ml 细菌内毒素检查用细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放人闭管口，垂直放人37 37 士士1 1 的恒温器中，保的恒温器中，保温温60 60 分钟分钟2 2

41、 分钟。分钟。2021/9/102021/9/102929结果判断：将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转l80，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。2021/9/102021/9/103030当最大浓度当最大浓度22管均为阳性，最低浓度管均为阳性，最低浓度0.250.25管均为阴性，管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效按下式计算反应终点阴性对照管为阴性，试验方为有效按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（

42、cc）。）。clg-1（X/4)式中式中 X X 为反应终点浓度的对数值（为反应终点浓度的对数值（lg lg）。反应终点）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。浓度。当当cc在在0.50.52(2(包括包括0.50.52)2)时，方可用于细时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。为该批鲎试剂的灵敏度。2021/9/102021/9/103131内毒素浓度内毒素浓度22 0.50.50.25 0.25 阴性对照阴性对照 终点终点 鲎试剂鲎试剂 平行管平行管 0.50.

43、50.50.5c=lg-1（(lg+lg+lg0.5+lg0.5)/4)=0.7072021/9/102021/9/103232干扰试验干扰试验：按表1 制备溶液A、B、C 和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。2021/9/102021/9/103333表表表表11凝胶法干扰试验溶液的制备凝胶法干扰试验溶液的制备凝胶法干扰试验溶液的制备凝胶法干扰试验溶液的制备编号编号内毒素浓度内毒素浓度/被加入内被加入内毒素的溶液毒素的溶液稀释用液稀释用液稀释倍数稀释倍数所含内毒素所含内毒素的浓度的浓度平行管数平行管数A A无无/供

44、试品溶液供试品溶液2 2B B2/2/供试品溶液供试品溶液供试品溶液供试品溶液1 1224 42 2114 44 40.50.54 48 80.250.254 4C C2/2/检查用水检查用水检查用水检查用水1 1224 42 2114 44 40.50.54 48 80.250.254 4D D无无/检查用水检查用水2 22021/9/102021/9/103434 注：注：A A为供试品溶液；为供试品溶液；B B为干扰试剂系列；为干扰试剂系列；C C鲎试剂标示灵敏度的对照系列；鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D D为阴性对照。为阴性对照。只有当溶液只有当溶液A A 和阴性对照溶液和阴性对照溶液

45、D D 的所有平行管都为阴性，并且系列溶液的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液溶液C C 和和B B 的反应终点浓度的几何平均值（的反应终点浓度的几何平均值（EsEs和和Et Et）:Es=lg Es=lg-1-1（Xs/4 Xs/4）Et=lgEt=lg-1-1（Xt:/4Xt:/4）式中式中Xs XtXs Xt分别为系列溶液分别为系列溶液C C 和溶液和溶液B B 的反应终点浓度的对数值（的反应终点浓度的对数值（lglg）。）。当当EsEs在在0.50.52

46、2（包括（包括0.50.5和和22）及）及EtEt在在0.5Es0.5Es 2 Es 2 Es（包括（包括0.5Es0.5Es和和 2 Es2 Es）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于在小于MVD MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD MVD 的进一步稀释，再重复干扰试验。的进一步稀释，再重复干扰试验。可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）

47、排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。经过处理的供试品溶液进行干扰试验。当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。检查法时，须进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试

48、验结果的变化时，须重新进行干扰试验。能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。2021/9/102021/9/103535内毒素浓度内毒素浓度 2.0 0.5 0.252.0 0.5 0.25终点终点终点终点供试品阴性对照供试品阴性对照（溶液（溶液A A）内毒素内毒素/供试品溶液供试品溶液（系列溶液（系列溶液B B）内毒素内毒素/检查用水检查用水 （系列溶液（系列溶液C C）2.02.02.02.0阴性对照（溶液阴性对照（溶液D D）E Es s=lg=lg-1-1(X(Xs s/4)=E/4)=Et t=lg=lg-1-1(X(Xt t/4)=1.41/4)=1.41 2021/9/102

49、021/9/103636凝胶限度试验凝胶限度试验 ：按表2 制备溶液A、B、C 和D。使用稀释倍数为MVD 并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A 和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。2021/9/102021/9/103737表表表表22凝胶限度试验溶液的制备凝胶限度试验溶液的制备凝胶限度试验溶液的制备凝胶限度试验溶液的制备编号编号内毒素浓度被加入内毒家的溶液内毒素浓度被加入内毒家的溶液平行管数平行管数A A无供试品溶液无供试品溶液2 2B B22供试品溶液供试品溶液2 2C C22检查用水检查用水2 2D D无检查用水无检查用水2 2注：A 为供试品溶液；B 为供试品阳性对照；C 为阳

50、性对照；D 为阴性对照。2021/9/102021/9/103838结果判断结果判断结果判断结果判断：保温保温6060分钟分钟22分钟后观察结果。分钟后观察结果。若阴性对照溶液若阴性对照溶液 DD的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液BB的平行管均为阳性，阳性对照溶液的平行管均为阳性，阳性对照溶液CC的平行管均为阳性，的平行管均为阳性，试验有效。试验有效。供试品溶液供试品溶液供试品阳性对照供试品阳性对照阳性对照阳性对照阴性对照阴性对照 2021/9/102021/9/103939若溶液A 的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定；若溶液A 的两个平行管均为阳性