第19章 生物技术药物制剂bpyw.docx

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1、第十九章章 生生物技术术药物制制剂第一节 概述一、生物物技术的的基本概概念 生物技技术或称称生物工工程（bbiottechhnollogyy），是是应用生生物体（包包括微生生物、动动物细胞胞，植物物细胞）或或其组成成部分（细细胞器和和酶），在在最适条条件下，生生产有价价值的产产物或进进行有益益过程的的技术。现现代生物物技术主主要包括括基因工工程、细细胞工程程与酶工工程。此此外还有有发酵工工程（微微生物工工程）与与生化工工程。 生物技技术药物物是指采采用现代代生物技技术，借借助某些些微生物物、植物物或动物物来生产产所需的的药品。采采用DNNA重组组技术或或其他生生物新技技术研制制的蛋白白质或核核

2、酸类药药物，也也称为生生物技术术药物。 近十几几年来，生生物技术术在医药药方面取取得了惊惊人的成成就，已已有不少少生物技技术药物物应用于于临床，下下面介绍绍一些国国内外已已批准上上市或正正在研究究的生物物技术药药物产品品。二、生物物技术药药物的研研究概况况 生物技技术药物物产品，目目前国内内外已批批准上市市的约440余种种，见表表19-1，正正在研究究的有数数百种之之多，部部分正在在研究的的生物技技术或其其他来源源的药物物列于表表19-2中，这这些药物物均属肽肽类与蛋蛋白质类类药物。表19-1 已批准准上市的的生物技技术药物物产品药品名称称用 途途批准时间间人胰岛素素糖尿病治治疗药19822人

3、生长激激素（hhGH）治疗侏儒儒症19855-2bb干扰素素治疗毛细细胞白血血病、乙乙型肝炎炎19866OKT33单抗（小小鼠抗TT细胞单单抗）急性肝移移植排斥斥反应19866乙肝疫苗苗预防乙型型肝炎19866组织溶纤纤酶原激激活素急性心肌肌梗死19877人促红细细胞生成成素（EEPO）慢性肾衰衰贫血19877-lbb干扰素素慢性肉芽芽肿疾病病19900GM-集集落刺激激因子（GGM-CCSF）骨髓移植植中性、白白细胞减减少症19911G-集落落刺激因因子（GG-CSSF）肿瘤化学学辅助治治疗、白白血病、艾艾滋病19911白细胞介介素-22肾细胞癌癌19922凝血VIIII因因子血友病1992

4、2人肿瘤坏坏死因子子突变体体肺、胃、结结肠肿瘤瘤19955幼畜腹泻泻疫苗预防仔猪猪腹泻上市-n33干扰素素生殖器疣疣19899小鼠抗 CD33抗体肾移植排排斥反应应19866单克隆抗抗体（诊诊断剂）结肠、直直肠、卵卵巢癌诊诊断19922重组DNNA酶囊性纤维维变性，改改进胸功功能19944抗血小板板凝聚单单克隆抗抗体防动脉突突然关闭闭高危性性血管成成形术病病人19955重组葡糖糖脑苷脂脂-米葡葡糖脑酶酶戈谢病（各各器官积积聚葡糖糖脑苷脂脂）19944重组-16干干扰素缓解上皮皮癌、肾肾癌、多多发性骨骨髓瘤19933环孢素 A抑制T淋淋巴细胞胞功能19966降钙素治疗骨质质疏松19966重组-干

5、扰素素免疫功能能障碍、癌癌症、感感染性疾疾病19922奥曲肽（ooctrreottidee）胃肠胰内内分泌肿肿瘤、消消化性溃溃疡出血血、肢端端肥大症症、垂体体瘤、柯柯兴氏综综合症、糖糖尿病等等19988*grllanuloocyttemmacrrophhagee coolonnystiimullatiing facctorr（GMMCSFF），粒粒-巨噬噬细胞集集落刺激激因子表19-2 部分正正在研究究的生物物技术及及其他来来源的蛋蛋白质药药物药 物物作用与用用途血管紧张张素 DD抑制剂剂降压心房肽激激素（aatriiopeeptiins）调节心血血管功能能降钙素基基因相关关因子血管舒张张药-

6、内啡啡肽镇痛神经生长长因子，hhNGFF刺激神经经生长和和修复，痴痴呆促胃液素素抑制剂剂减少胃酸酸分泌脑啡肽刺激淋巴巴细胞母母细胞化化促胸腺生生成素选择性TT细胞分分化激素素肿瘤坏死死因子控制多形形核细胞胞功能表皮生长长因子，hhNGFF促进表皮皮生长，痴痴呆生长抑素素（soomattosttatiix）抑制胃液液素分泌泌促性腺素素促进排卵卵、精子子生成促黄体生生成素释释放激素素（LHHRH）促进下丘丘脑性闭闭经妇女女排卵催产素促进分娩娩促甲状腺腺素释放放激素（TTRH）延长哺乳乳期妇女女的不育育和泌乳乳加压素治疗尿崩崩症人尿激酶酶原溶血栓，抗抗凝剂人超氧化化物歧化化酶肾移植，烧烧伤白细胞介介

7、素-66肿瘤、骨骨髓移植植，刺激激造血白细胞介介素-111促血小板板生成链激酶，LLSK溶血栓人成纤维维细胞生生长因子子神经损伤伤人胰岛素素生长因因子侏儒症肝细胞生生长因子子重型肝炎炎肝癌单克克隆抗体体肝癌乙肝单克克隆抗体体乙肝反义寡聚聚核苷酸酸HIV感感染和艾艾滋病TK载体体产生细细胞脑癌巨核细胞胞与发育育因子刺激血小小板生成成脂质体包包被 IIL-22，OTTX-2287肿瘤抗 CDD20 基基因工程程抗体B细胞淋淋巴瘤表19-2中所所列药物物，如环环孢素 A（ccycllospporiin AA）、降降钙素（ccalccitooninn）、促促黄体生生成素释释放激素素（luuteiini

8、zzingg hoormoone relleasse hhormmonee，LHHRH）类类似物、催催产素、加加压素等等，用提提取或其其他方法法生产，已已在临床床上使用用。 随着生生物技术术药物的的发展，肽肽和蛋白白质药物物制剂的的研究与与开发，已已成为医医药工业业中一个个重要的的领域，同同时给药药物制剂剂带来了了新的挑挑战。由由于生物物技术产产品多为为多肽和和蛋白质质类，性性质很不不稳定，极极易变质质，因此此如何将将这类药药物制成成安全、有有效、稳稳定的制制剂，就就是摆在在我们面面前的一一大难题题。例如如降钙素素基因相相关肽是是治疗高高血压的的有效药药物，但但该药物物很不稳稳定，虽虽然早已已

9、开发，但但由于存存在以上上问题，至至今未形形成产品品。另一一方面这这类药物物对酶敏敏感又不不易穿透透胃肠粘粘膜，故故只能注注射给药药，使用用很不方方便。因因此，运运用制剂剂手段将将这类药药物制成成口服制制剂或通通过其他他途径给给药，以以提高其其稳定性性和患者者使用的的顺应性性，是一一项非常常有意义义的工作作，具有有潜在的的研究价价值和广广阔的应应用前景景。三、生物物技术药药物的结结构特点点与理化化性质 生物技技术药物物多为多多肽类及及蛋白质质类药物物，这些些药物的的化学结结构相当当复杂，理理化性质质也有它它的特殊殊性，因因此在设设计与评评价这类类药物的的给药系系统时必必须首先先了解其其结构特特

10、性与理理化性质质。 （一）蛋蛋白质的的结构特特点1蛋白白质的组组成和一一般结构构 蛋蛋白质是是由许多多氨基酸酸按一定定顺序排排列，通通过肽键键相连而而成的多多肽链。蛋蛋白质分分子量很很大，一一般在551035106。蛋白白质的肽肽链结构构包括氨氨基酸组组成、氨氨基酸排排列顺序序、肽链链数目、末末端组成成和二硫硫键的位位置等。组成蛋白白质的氨氨基酸有有20多多种，一一个氨基基酸的羧羧基可以以和另一一个氨基基酸的氨氨基缩合合失去11分子水水而生成成肽，两两个氨基基酸缩合合成的肽肽称为二二肽，由由十个以以上氨基基酸组成成的肽称称多肽。连连接氨基基酸之间间的键称称为酰胺胺键，又又称肽键键，是蛋蛋白质中

11、中氨基酸酸之间连连接最基基本的共共价键。蛋蛋白质多多肽链中中许多氨氨基酸按按一定的的顺序排排列，每每种蛋白白质都有有特定的的氨基酸酸排列顺顺序。蛋蛋白质结结构可分分为一、二二、三、四四级结构构。一级级结构为为初级结结构，指指蛋白质质多肽链链中的氨氨基酸排排列顺序序，包括括肽链数数目和二二硫键位位置；二二、三、四四级结构构为高级级结构或或空间结结构。高高级结构构和二硫硫键对蛋蛋白质的的生物活活性有重重要影响响。2蛋白白质的高高级结构构 蛋蛋白质的的高级结结构包括括二级、三三级与四四级结构构。二级级结构指指蛋白质质分子中中多肽链链骨架的的折叠方方式，即即肽链主主链有规规律的空空间排布布，一般般有a

12、螺旋旋结构与与b折叠形形式。三三级结构构是指一一条螺旋旋肽链，即即已折叠叠的肽链链在分子子中的空空间构型型，即分分子中的的三维空空间排列列或组合合方式系系一条多多肽链中中所有原原子的空空间排布布。四级级结构是是指具有有三级结结构的蛋蛋白质各各亚基聚聚合而成成的大分分子蛋白白质。四四级结构构可以由由两个以以上的小小亚基聚聚合而成成。所谓谓亚基，就就是含有有二条或或多条多多肽链的的蛋白质质，这些些多肽链链彼此以以非共价价键相联联，每一一条多肽肽链都有有自己的的三级结结构，此此多肽链链就是该该蛋白质质分子的的亚单位位（亚基基）。蛋蛋白质高高级结构构见图119-11。图19-1蛋白质高级结构见 药剂学

13、第4版图20-2图19-1 蛋蛋白质高高级结构构示意图图 蛋白质质分子的的构象又又叫空间间结构、高高级结构构、立体体结构、三三维构象象等，它它是指蛋蛋白质分分子中所所有原子子在三维维空间中中的排布布。这种种空间排排布的变变化，仅仅涉及到到氢键等等次级键键的生成成与断裂裂，但不不涉及共共价键的的生成与与断裂。蛋蛋白质分分子只有有在其立立体结构构呈特定定的构象象（coonfoormaatioon）时时才有生生物活性性，形成成稳定的的蛋白质质分子构构象的作作用力有有氢键、疏疏水作用用力（hhydrrophhobiic fforcce）、离离子键、范范德华力力、二硫硫键与配配位键。除除二硫键键为共价价

14、键外，其其余都是是非共价价键，维维持蛋白白质构象象是弱作作用力。蛋蛋白质分分子二级级结构中中a螺旋、b折折叠的形形成依靠靠氢键，可可以说蛋蛋白质分分子内部部布满了了氢键。疏疏水作用用力也称称疏水键键，疏水水键是两两个疏水水基为了了避开水水相而群群集在一一起的作作用力，在在维持蛋蛋白质三三级结构构方面起起重要作作用，也也是形成成生物膜膜的主要要作用力力。范德德华力对对稳定和和维持三三级、四四级结构构十分重重要。离子键对对于维持持蛋白质质四级结结构是不不可缺少少的。不不少蛋白白质含有有金属离离子，而而金属离离子通过过配位键键与蛋白白质结合合，故结结合蛋白白质是由由氨基酸酸成分与与非氨基基酸成分分通

15、过配配位键组组成。 （二）蛋蛋白质的的理化性性质1蛋白白质的一一般理化化性质 蛋白白质的分分子量，小小的有几几千，如如胰岛素素（单体体60000）；大的上上千万，如如斑纹病病毒（烟烟草）（66107）。蛋蛋白质在在水中形形成亲水水胶体，颗颗粒大小小在l nm 1000nmm之间。它它不能透透过半透透膜。由由于蛋白白质分子子中存在在极性基基团如-NH33+、-COOO-、-NNH2、-OOH、-SH等等，可形形成水化化层而稳稳定。（1）旋旋光性：蛋白质质分子总总体旋光光性由构构成氨基基酸各个个旋光度度的总和和决定，通通常是右右旋，它它由螺旋旋结构引引起。蛋蛋白质变变性，螺螺旋结构构松开，则则其左

16、旋旋性增大大。 （2）紫紫外吸收收：大部部分蛋白白质均含含有带苯苯核的苯苯丙氨酸酸、酪氨氨酸与色色氨酸，苯苯核在紫紫外2880nmm有最大大吸收。氨氨基酸在在紫外2230nnm显示示强吸收收。 （3）蛋蛋白质两两性本质质与电学学性质：蛋白质质除了肽肽链N-末端有有自由的的氨基和和C-末末端有自自由的羧羧基外，在在氨基酸酸的侧链链上还有有很多解解离基团团，如赖赖氨酸的的e-氨基基，谷氨氨酸的羧基等等。这些些基团在在一定 pH条条件下都都能发生生解离而而带电。因因此蛋白白质是两两性电解解质，在在不同 pH条条件下蛋蛋白质会会成为阳阳离子、阴阴离子或或二性离离子。2蛋白白质的不不稳定性性蛋白质质的稳

17、定定性对于于蛋白质质类药物物的制剂剂研究、生生产、贮贮存等极极为重要要。引起起蛋白质质不稳定定的原因因很多，如如前所述述，共价价键与非非共价键键的破坏坏与生成成，均可可引起蛋蛋白质类类药物的的不稳定定。（1）由由于共价价键引起起的不稳稳定性：共价键键改变引引起蛋白白质不稳稳定的化化学反应应有水解解、氧化化和消旋旋化，此此外还有有蛋白质质的特有有反应，即即二硫键键的断裂裂与交换换。有时时几种反反应同时时进行。虽虽然大多多数降解解过程在在升高温温度时发发生，但但是蛋白白质稳定定性监测测数据表表明其降降解过程程不符合合 Arrrheeniuus关系系，故蛋蛋白质类类药物稳稳定性的的加速实实验中应应慎

18、重选选择其最最高温度度。如白白细胞介介素-ll（innterrleuukinn-1）在溶溶液中高高于和低低于399时存在在不同的的失活机机制，此此实例排排除了从从加速温温度数据据预测处处方有效效期的可可能性。但但文献报报道组织织溶纤酶酶原激活活素（ttisssue plaasmiinoggen acttivaatorr）在440和40以下的的稳定性性研究中中成功地地将数据据外推到到5。蛋白白质的降降解途径径有： 1）蛋蛋白质的的水解：蛋白质质可被酸酸、碱和和蛋白酶酶催化水水解，使使蛋白质质分子断断裂，分分子量逐逐渐变小小，成为为分子量量大小不不等的肽肽段和氨氨基酸。水水解分完完全水解解与不完完

19、全水解解。完全全水解是是在5.7moolLL盐酸中中，于1110高温220h可完全全变成氨氨基酸。在在此条件件下，能能使色氨氨酸破坏坏，谷氨氨酰胺变变为谷氨氨酸，天天冬酰胺胺变为天天冬氨酸酸，后二二者的水水解作用用也叫脱脱酰胺作作用（ddeammidaatioon）。酸酸水解可可使胱氨氨酸变成成半胱氨氨酸，丝丝氨酸、苏苏氨酸也也有不同同程度的的破坏。不不完全水水解是在在酶或稀稀酸等较较温和的的条件下下进行，水水解产物物有肽段段与氨基基酸。蛋蛋白质在在4.2mool/LLnaOOH溶液液中水解解10hh，使蛋蛋白质完完全水解解，碱水水解对半半脱氨酸酸、丝氨氨酸、苏苏氨酸、精精氨酸等等有破坏坏作用

20、，同同时使各各种氨基基酸发生生消旋。 2）蛋蛋白质的的氧化：蛋白质质中具有有芳香侧侧链的氨氨基酸，如如甲硫氨氨酸、半半胱氨酸酸可以在在一些氧氧化剂的的作用下下氧化，甲甲硫氨酸酸可氧化化成甲硫硫氨酸亚亚砜而使使一些多多肽类激激素和蛋蛋白质失失去活性性。半胱胱氨酸的的巯基根根据不同同的反应应条件，可可依次氧氧化为次次磺酸（RRSOHH）、二二硫化物物（RSSSH）、亚亚磺酸（RRSO22H），最最后成磺磺酸（RRSO33H）、半半胱氨酸酸，即半半胱磺酸酸。影响响氧化的的因素有有温度、ppH值、缓缓冲介质质、催化化剂的种种类和氧氧的强度度等。巯巯基的氧氧化在碱碱性条件件下，特特别是在在金属离离子（如

21、如Cu22+）的的存在下下容易发发生。 3）外外消旋作作用（rraceemizzatiion）：某些旋旋光性物物质在化化学反应应过程中中，由于于不对称称碳原子子上的基基团在空空间位置置上发生生转移，使使D-或L-型化合合物转变变为D-型和LL-型各550的的混合物物，彼此此旋光值值抵消，失失去旋光光性，这这种现象象称为外外消旋作作用。当当蛋白质质用碱水水解时往往往会使使某些氨氨基酸产产生消旋旋作用。影影响氨基基酸消旋旋作用的的因素有有温度、ppH值、离离子强度度和金属属离子螯螯合作用用。蛋白白质中氨氨基酸的的消旋作作用一般般能使氨氨基酸成成为非代代谢的形形式（nnonmmetaabolliza

22、ablee foormss）。 4）二二硫键断断裂及其其交换：二硫键键（-SS-S-）又叫叫二硫桥桥或硫硫硫桥，是是很强的的化学键键。它是是由两个个半胱氨氨酸侧链链上的-SH巯巯基脱氢氢相连而而成。二二硫键把把同一肽肽链（肽肽链内）或或不同肽肽链（肽肽链间）的的不同部部分连接接起来，对对稳定蛋蛋白质的的构象起起重要作作用。在在某些蛋蛋白质中中，二硫硫键一旦旦破坏，蛋蛋白质的的生物活活性即丧丧失，蛋蛋白质分分子中二二硫键数数目愈多多，则结结构稳定定性和抗抗拒外界界因素的的能力也也愈强。蛋白质分分子中二二硫键断断裂接着着重排能能够改变变蛋白质质的三级级结构，因因此影响响其生物物活性。二二硫键交交换

23、（bbisuulfiide bonnd eexchhangge）可可由硫醇醇类催化化，如下下式所示示：HSR RSSR RSSR十HSR有人证实实核糖核核酸酶（rriboonuccleaase）在在90加热去去活化作作用就是是二硫键键交换所所致，这这个过程程由于硫硫醇类物物质如半半胱氨酸酸的存在在而加速速。（2）由由非共价价键引起起的不稳稳定性：引起蛋蛋白质不不可逆失失活作用用的下列列主要类类型，即即聚集（aaggrregaatioon）、宏宏观沉淀淀、表面面吸附与与蛋白质质变性，这这些都是是由于与与空间构构象有关关的非共共价键引引起，这这些现象象在开发发蛋白质质与多肽肽类药物物制剂中中常会带

24、带来许多多困难。（三）蛋蛋白质类类药物的的评价方方法 在前面面讨论蛋蛋白质药药物不稳稳定的原原因时已已经看出出，要开开发蛋白白质类药药物，需需要多种种分析方方法。1液相相色谱法法 液液相色谱谱法是评评价蛋白白质的纯纯度与稳稳定性的的常用方方法。在在蛋白质质分析中中通常采采用反相相高效液液相色谱谱法（RRP-HHPLCC）、离离子交换换色谱法法（IEEC）与与分子排排阻色谱谱法（SSizee exxcluusioon cchroomattogrraphhy，SSEC）。反反相色谱谱法是以以非极性性固定相相与含水水的极性性流动相相为基础础的分析析方法，对对于大分分子蛋白白质，以以C4或 CC8烷基

25、键键合于硅硅胶上或或聚合物物担体上上作固定定相，固固定相应应有较宽宽范围的的孔体积积（直径径约3000nmm或更大大），以以便分子子量约为为50000或更更大的蛋蛋白质能能够充分分扩散到到固定相相骨架中中。流动动相一般般用不同同浓度的的乙腈水水溶液，并并含有离离子对试试剂，如如三氟醋醋酸（00.1），磷磷酸盐或或缓血酸酸胺缓冲冲液用以以调节ppH以获获得最佳佳分离效效果。应应用反相相 HPPLC法法，由于于有机溶溶剂、疏疏水的相相互作用用及分离离时所用用的低ppH值，会会使一些些蛋白质质变性。然然而该方方法对几几种蛋白白质特别别有用，并并被广泛泛应用于于胰岛素素制剂的的质量分分析。药药典中胰胰

26、岛素一一般用生生物效价价法测定定，因此此在使用用时应建建立RPP-HPPLC与与生物效效价法之之间的相相互关系系。RPP-HPPLC还还应用于于疟疾蛋蛋白抗原原（maalarria prooteiin aantiigenns）、白白细胞介介素-22、突变变蛋白（mmuteeinss）、人人生长激激素及重重组人体体干扰素素制剂稳稳定性的的检测。离离子交换换色谱法法用于从从N-末末端甲硫硫氨基型型分离重重组白介介素-ll。分子子排阻色色谱可以以测定-干扰扰素、白白介素-2在升升温贮存存、机械械搅拌后后及快速速冰冻熔熔化后的的聚集情情况。2光谱谱法 通过对对蛋白质质吸收、辐辐射、散散射光的的定量分分

27、析可以以提供有有价值的的信息，了了解蛋白白质的量量、构象象和聚集集倾向。用用于评价价蛋白质质药物的的光谱方方法有紫紫外（UUV）、可可见吸收收光谱、旋旋光色散散（ORRD）、圆圆二色谱谱（CDD）、荧荧光、红红外（IIR）和和拉曼（RRamaan）光光谱。紫紫外吸收收常用于于测定溶溶液中蛋蛋白质的的浓度。蛋蛋白质在在23002880nmm间的吸吸收是由由酪氨酸酸（Ammax=2744nm）、色色氨酸（AAmaxx=2800nm）、苯苯丙氨酸酸（Ammax=2544nm）、芳芳环侧链链所决定定。当蛋蛋白质在在溶液中中聚集时时，由于于光散射射，在33104000nm处处有一倾倾斜基线线，这使使得吸

28、收收测定倾倾向于2280nnm。光光散射可可测定制制剂中蛋蛋白质的的聚集数数量，散散射强度度是单位位体积散散射中心心数的函函数。在在4500nm处处测定牛牛生长激激素的浊浊度可用用以评价价其不同同折叠构构象的溶溶解度。浊浊度的测测定仅限限于颗粒粒比光波波长小的的情况，此此时浊度度才与聚聚集程度度呈线性性关系。蛋蛋白质的的远紫外外圆二色色谱直接接反映蛋蛋白质的的二级结结构，一一种不对对称分子子如蛋白白质大分分子可显显示圆二二色谱。这这项技术术可用于于测定蛋蛋白质二二级结构构的变化化与稳定定性、热热处理或或冰冻与与熔化之之间的函函数关系系。有人人用远紫紫外CDD法研究究了牛生生长激素素分离片片段的

29、螺螺旋结构构。发现现螺旋量量依赖于于pH值值及肽的的浓度。3电泳泳 电电泳技术术是根据据在电场场的作用用下，蛋蛋白质在在载体凝凝胶上产产生特征征性迁移移，迁移移率是所所带净电电荷及其其大小的的函数，以以此来分分离混合合蛋白质质。在蛋蛋白质的的分析中中广泛使使用十二二烷基硫硫酸钠-聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳（SDDS-PPAGEE）、等等电点聚聚焦（iisocclecctriic ffocuusinng，IIEF）和和新的毛毛细管电电泳（EEC）法法。SDDS-PPAGEE电泳先先用SDDS阴离离子表面面活性剂剂使样品品变性，随随后通过过聚丙烯烯酰胺担担体进行行电泳。本本法用于于测定蛋蛋白质亚亚单

30、位组组成和分分子量，可可取得满满意效果果。4生物物活性测测定与免免疫测定定 重重组DNNA和杂杂交瘤技技术产品品应进行行生物活活性的测测定，蛋蛋白质药药物制剂剂的稳定定性也应应检测其其生物活活性。生生物活性性检测是是利用体体内模型型或体外外组织或或活性蛋蛋白质多多肽的特特异性生生物学反反应，通通过剂量量（或浓浓度）效效应曲线线进行定定量（绝绝对量或或比活性性单位）。用用理化方方法代替替生物活活性测定定时，需需建立两两种方法法之间的的相关性性。生物物活性测测定是制制订这类类药物制制剂质量量标准的的最基本本方法。免疫测定定通常是是采用免免疫化学学法，例例如一种种蛋白质质与含适适当比例例的特异异抗体

31、血血清，即即免疫血血清（用用动物免免疫所得得）混合合，则会会形成沉沉淀，这这种建立立在沉淀淀反应基基础上的的免疫化化学方法法非常适适合于蛋蛋白质的的定性及及定量分分析、蛋蛋白质制制剂（混混杂有其其他蛋白白质）的的均一性性试验以以及蛋白白质混合合物组分分的鉴定定。这种种方法也也可作为为蛋白质质结构研研究的辅辅助手段段。与其其他方法法相比较较，主要要优点是是可用于于定量化化学分析析不能检检测的情情况，例例如测定定蛋白质质混合物物的一种种组分。第二节 蛋白白质类药药物制剂剂的处方方与工艺艺蛋白质类类药物制制剂的研研制关键键是解决决这类药药物的稳稳定性问问题。对对于注射射给药则则采用适适当的辅辅料，设

32、设计合理理的处方方与工艺艺，而非非注射给给药还需需解决生生物利用用度问题题。本节节主要讨讨论这类类药物的的注射剂剂型。一、蛋白白质类药药物的一一般处方方组成目前临床床上应用用的蛋白白质类药药物注射射剂，一一类为溶溶液型注注射剂，另另一类是是冻干粉粉注射剂剂。溶液液型使用用方便，但但需在低低温（228）下保保存。冻冻干粉型型比较稳稳定，但但工艺较较为复杂杂。二、液体体剂型中中蛋白质质类药物物的稳定定化在液体剂剂型中蛋蛋白质类类药物的的稳定化化方法分分为两类类：改造其其结构；加入适适宜辅料料。改变变蛋白质质结构，如如改变蛋蛋白质一一级序列列、改变变取代反反应官能能团和化化学修饰饰的方法法，以提提高

33、蛋白白质空间间伸展自自由能，改改变与溶溶剂接触触的性质质，该方方法不属属于制剂剂学范畴畴，故在在此不做做详细讨讨论。通通过加入入各类辅辅料，改改变蛋白白类药物物溶剂的的性质是是药物制制剂中常常用的稳稳定化方方法。蛋白类药药物的稳稳定剂有有以下几几类：1缓冲冲液 因为蛋蛋白质的的物理化化学稳定定性与ppH值有有关，通通常蛋白白质的稳稳定pHH值范围围很窄，应应采用适适当的缓缓冲系统统，以提提高蛋白白质在溶溶液中的的稳定性性。例如如红细胞胞生成素素采用枸枸橼酸钠钠-枸橼酸酸缓冲剂剂，而-N3干扰素素则用磷磷酸盐缓缓冲系统统，人生生长激素素在5mmmollL的的磷酸盐盐缓冲液液可减少少聚集。缓缓冲盐

34、类类除了影影响蛋白白质的稳稳定性外外，其浓浓度对蛋蛋白质的的溶解度度与聚集集均有很很大影响响。组织织溶纤酶酶原激活活素在最最稳定的的pH条条件下，药药物的溶溶解度不不足以产产生治疗疗效果，因因此加入入带正电电荷的精精氨酸以以增加蛋蛋白质在在所需ppH值下下的溶解解度。2表面面活性剂剂 由由于离子子型表面面活性剂剂会引起起蛋白质质的变性性，所以以在蛋白白质药物物，如-2bb干扰素素、G-CSFF、组织织溶纤酶酶原激活活素等制制剂中均均加入少少量非离离子表面面活性剂剂，如吐吐温800来抑制制蛋白质质的聚集集，其机机理可能能是因为为表面活活性剂倾倾向于排排列在气气液界面面上，从从而使蛋蛋白质离离开界

35、面面来抑制制蛋白质质的变性性。3糖和和多元醇醇 糖糖和多元元醇属于于非特异异性蛋白白质稳定定剂。蔗蔗糖、海海藻糖、甘甘油、甘甘露醇、山山梨醇（浓浓度1%100%）最最常用。糖糖和多元元醇的稳稳定作用用与其浓浓度密切切相关，不不同糖和和多元醇醇的稳定定程度取取决于蛋蛋白质的的种类。还还原糖与与氨基酸酸有相互互作用，因因此避免免使用。4盐类类 盐盐可以起起到稳定定蛋白质质的作用用，有时时也可以以破坏蛋蛋白质的的稳定性性，这主主要取决决于盐的的种类、浓浓度、离离子相互互作用的的性质及及蛋白质质的电荷荷。低浓浓度的盐盐通过非非特异性性静电作作用提高高蛋白质质的稳定定性。如如SO42-、HPOO42-、

36、CHCCOO-、（CHH3）N+、NH4+、K+、Na+等能增增加溶液液的离子子强度，提提高疏水水作用，降降低疏水水基团的的溶解度度，使蛋蛋白质发发生盐析析。此外外它们使使水分子子聚集在在蛋白质质周围被被优先水水化，所所有这些些都使蛋蛋白质更更加紧密密稳定。经经常使用用的盐NNaCll在稳定定蛋白质质中起关关键作用用，实验验表明它它能提高高牛血清清白蛋白白（BSSA）的的变性温温度和热热焓。5聚乙乙二醇类类 高高浓度的的聚乙二二醇类常常作为蛋蛋白质的的低温保保护剂和和沉淀结结晶剂。研研究表明明不同分分子量的的PEGG作用不不同，如如PEGG3000浓度00.5%或2%可抑制制重组人人角化细细胞

37、生长长因子（rrhKGGF）的的聚集；PEGG2000、4000、6600和和10000可稳稳定BSSA和溶溶菌酶。6大分分子化合合物 研究表表明很多多大分子子化合物物具有稳稳定蛋白白质的作作用。其其机制可可能是通通过大分分子的表表面活性性、蛋白白质-蛋蛋白质相相互作用用的空间间隐蔽以以及提高高粘度来来限制蛋蛋白质运运动或通通过优先先吸附于于大分子子以起到到稳定作作用，人人血清白白蛋白（HAS）已在许多蛋白质类生物技术来源的药物制剂中作稳定剂。近年来也有采用环糊精制成包合物来增加蛋白质药物的溶解度，例如用2-羟丙基-b-环糊精是较有前途的稳定剂，其本身又是增溶剂可静脉注射，可用来抑制hGH的界

38、面变性，抑制rhKGF的聚集，稳定白介素-2和牛胰岛素等。7组氨氨酸、甘甘氨酸、谷谷氨酸和和赖氨酸酸的盐酸酸盐等 可不不同程度度地抑制制4510 mM磷磷酸盐缓缓冲液中中rhKKGF的的聚集。8金属属离子 一些些金属离离子，如如钙、镁镁、锌与与蛋白质质结合，使使整个蛋蛋白质结结构更加加紧密、结结实、稳稳定。不不同金属属离子的的稳定作作用视离离子的种种类、浓浓度不同同而不同同，应通通过稳定定性实验验选择金金属离子子的种类类和浓度度。三、固体体状态蛋蛋白质药药物的稳稳定性与与工艺蛋白质类类药物的的非注射射给药存存在生物物利用度度低等问问题，因因此目前前多以注注射途径径给药。在在一些蛋蛋白质药药物不

39、能能采用溶溶液型制制剂时，往往往用冷冷冻干燥燥与喷雾雾干燥的的工艺使使形成固固体状态态以提高高这类制制剂的稳稳定性，关关于冷冻冻干燥及及喷雾干干燥的一一般工艺艺过程在在本书的的第四章章中已有有论述，下下面仅就就蛋白质质类药物物的特殊殊性作一一说明。（一）冷冷冻干燥燥蛋白质质药物制制剂用冷冻干干燥法制制备蛋白白质类药药物制剂剂时主要要考虑两两个问题题，一是是选择适适宜的辅辅料，优优化蛋白白质药物物在干燥燥状态下下的长期期稳定性性。二是是考虑辅辅料对冷冷冻干燥燥过程中中一些参参数的影影响，如如最高与与最低干干燥温度度，干燥燥时间，冷冷冻干燥燥产品的的外观等等。虽然冻干干可以使使蛋白质质药物稳稳定，

40、但但不应忽忽略有些些蛋白质质药物在在冻干过过程中反反而失去去活性，主主要原因因是：从液态态到固态态的相变变过程中中，包在在蛋白质质周围的的水分子子被除去去而失活活；高浓度度的盐和和缓冲组组分的结结晶或缓缓冲液ppKa对对温度敏敏感而导导致pHH变化、浓浓缩时蛋蛋白质有有限的溶溶解度等等均能导导致蛋白白质药物物失活。在在选择冻冻干制剂剂的缓冲冲体系时时，要考考虑到温温度对ppH值和和溶解度度的影响响。在蛋白质质类药物物冻干过过程中常常加入某某些冻干干保护剂剂来改善善产品的的外观和和稳定性性，如甘甘露醇、山山梨醇、蔗蔗糖、葡葡萄糖、右右旋糖酐酐等。溶液中的的成分也也可以影影响冷冻冻干燥过过程中与与

41、热有关关的工艺艺参数。冻冻干过程程中与热热有关的的性质有有：制剂剂的冷冻冻温度、有有可能使使饼状物物熔化或或坍塌的的温度及及有可能能使产品品发生降降解的温温度。控控制这些些参数，使使产品冷冷冻适度度，饼状状物不融融化、不不坍塌也也不降解解，DSSC是表表征与优优化冻干干工艺有有用的技技术。在在冻干过过程中还还应考虑虑药物的的含水量量与饼状状物的物物理状态态（无定定性或晶晶形）。其其物理状状态与冷冷冻过程程的温度度及添加加剂有关关。无定定形的水水分含量量一般较较高，这这是因为为在干燥燥过程中中水蒸气气的蒸发发减慢的的缘故。水水分的增增加会降降低饼状状物的物物理稳定定性并可可能导致致贮藏过过程中饼

42、饼状物的的坍塌。此此外水分分也可以以影响蛋蛋白质的的化学稳稳定性。因因此，严严格控制制产品的的含水量量，对保保证产品品的质量量是十分分重要的的。（二）喷喷雾干燥燥蛋白质质药物制制剂喷雾干燥燥工艺广广泛应用用于蛋白白质类药药物的控控释制剂剂、吸入入剂、微微球制剂剂等新型型给药系系统的研研制中。在在喷雾干干燥过程程中可加加入稳定定剂，如如蔗糖能能提高氧氧血红蛋蛋白（ooxyhhemoogloobinn）的稳稳定性。喷喷雾干燥燥的缺点点是操作作过程中中损失大大（特别别是小规规模生产产），水水分含量量高。但但只要精精心控制制工艺参参数，选选择适合合稳定剂剂，可生生产出粒粒径为33mm 5mm，水分分含

43、量为为56的的活性产产品。第三节 蛋白白质类药药物新型型给药系系统一、新型型注射（植植入）给给药系统统临床经验验表明，很很多蛋白白质类药药物在体体内血浆浆半衰期期短，清清除率高高，因而而需要延延长其在在体内的的平均驻驻留时间间，或改改变蛋白白质在体体内的药药物动力力学性质质，有时时需要制制成非零零级脉冲冲式释药药系统（如如疫苗）。为为满足这这些要求求，既可可以对蛋蛋白质分分子进行行化学修修饰，也也可以控控制蛋白白质进入入血流的的释放速速度等。目目前已有有用PEEG修饰饰蛋白质质分子以以延长蛋蛋白质药药物在血血浆中的的半衰期期。例如如 PEEG与蛋蛋白质连连接分子子变大而而不易被被肾小球球滤过，

44、或或者由于于蛋白质质的代谢谢和排泄泄所需的的细胞受受体的相相互作用用受到空空间位阻阻。腺苷苷酸脱氨氨酶（aadennosiine deaaminnasee，ADDA）即即采用形形成PEEG-AADA这这种方法法，治疗疗因ADDA缺乏乏而引起起免疫缺缺损综合合征的患患者，此此药已经经获FDDA批准准生产（一）控控释微球球制剂为了达到到蛋白质质类药物物控制释释放，可可将其制制成生物物可降解解的微球球制剂，目目前已经经实际应应用的生生物可降降解材料料有聚乳乳酸（PPLA）或或聚丙交交酯乙交酯酯（pooly(lacttidee-coo-gllycoolidde)，PPLGAA）。PPLGAA也可叫叫聚

45、乳酸酸乙醇酸酸共聚物物（coopolly(llactticglyycollic) accid），改改变丙交交酯与乙乙交酯的的比例或或分子量量，可得得到不同同时间生生物可降降解性质质的材料料。首次次经FDDA批准准的蛋白白质类药药物微球球制剂是是醋酸亮亮丙瑞林林（leeuprroliide aceetatte）聚聚丙交酯酯乙交酯酯微球。此此种微球球供肌内内注射，用用于治疗疗前列腺腺癌，可可控制释释放达330d之久，改改变了普普通注射射剂需每每天注射射的传统统，使用用方便。用于制备备生物大大分子药药物控释释微球的的方法很很多，根根据不同同性质的的载体材材料可选选择不同同的制备备方法。如如相分离离凝

46、聚法法、乳化化蒸发法法、复乳乳液中干干燥法、低低温喷雾雾提取法法、喷雾雾干燥法法以及超超临界萃萃取法等等，参见见第十六六章第四四节。以以下介绍绍几种常常用于制制备多肽肽、蛋白白质等生生物大分分子药物物微球的的方法。1复乳乳液中干干燥法 将药药物与保保护剂（多多为水溶溶性高分分子聚合合物）溶溶于水作作为水相相，将聚聚酯（如如PLAA、PLLGA等等）类高高分子材材料溶于于二氯甲甲烷作为为油相，两两者在一一定温度度下（低低于400）高速速搅拌得得W/OO型初乳乳，冰浴浴冷却至至10以下，倒倒至一定定浓度的的PVA水水溶液中中，经高高速搅拌拌得W/O/WW型复乳乳，一定定温度下下搅拌蒸蒸去有机机溶剂

47、固固化微球球（或减减压去有有机溶剂剂），离离心水洗洗，真空空干燥即即得。该该方法是是制备多多肽、蛋蛋白质等等生物大大分子药药物微球球的常用用方法，其其特点为为药物包包封率较较高，药药物活性性损失小小，设备备和工艺艺简单，但但首日突突释明显显，较难难放大生生产，目目前用此此法研究究制备的的药物有有干扰素素、白细细胞介素素、亮丙丙瑞林、人人生长激激素、环环孢素以以及促红红细胞生生长素（EPO）等。2低温温喷雾提提取法 将生生物大分分子药物物与保护护剂的均均匀粉末末加至生生物可降降解性聚聚合物的的有机溶溶剂（如如二氯甲甲烷）中中混合形形成混悬悬液，将将此混悬悬液经喷喷头雾化化后喷入入冰冻的的乙醇溶溶液（该该溶液可可与上述述溶液混混溶，但但聚合物物不溶于于此溶液液），在在低温（-70）状态下，聚合物载体中的有机溶剂在乙醇中不断扩散完全，分离微球，低温干燥除去乙醇得粉末状微球，该方法的特点：包封率高，微球粒径集中，工艺稳定，可实现产业化，但其活性损失较复乳液中干燥法大。3喷雾雾干燥法法 将将生物大大分子药药物及其其稳定剂剂的混合合粉末（或或水溶液液）与溶溶有高分分子聚合合物的有有机