薏苡种质资源ISSR分子标记筛选及亲缘关系分析.doc

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1、薏苡种质资ISSR分子标记筛选及亲缘关系分析p 打开文本图片集【摘要】：p ：利用ISSR标记对92份薏苡种质进行遗传多样性分析p ，结果表明，从100条ISSR通用引物中筛选出11条多态性较好的引物，共扩增出49条多态性条带，多态性条带占各自总条带的比例为66.6100.0;非加权组平均法（UPGMA）和主成分分析p 法（PCA）对92份薏苡种质的聚类结果一致，均分为3个类群，云南、贵州、福建3个省份的种质表现出比较丰富的遗传多样性，其他省份的多样性水平相对较低。【关键词】：p ：ISSR标记;遗传多样性;种质资;薏苡;类群;主成分分析p 中图分类号： S519.024 文献标志码： A 文

2、章编号：1002-1302（20_）05-0032-05收稿日期：20_-04-23基金项目：贵州省科技计划（编号：黔科合重大专项字20_6023、黔科合支撑20_2608）;贵州省高层次创新型人才培养項目（编号：黔科合人才20_4016）。作者简介：陆秀娟（1989），女，布依族，贵州册亨人，从事作物栽培与生物技术研究。E-mail：lowaterve_643126.cm。通信作者：李祥栋，农艺师，从事植物生理与分子调控研究，E-mail：li_iangdongsiji163.;石 明，研究员，从事作物遗传育种研究，E-mail：shiming1616126.。种质资的遗传多样性是育种的基础

3、，科学、准确地评价种质资的遗传多样性，从整体上把握物种资的遗传变异信息及亲缘关系远近，可有针对性地选择合适亲本，为遗传育种工作提供有益参考。薏苡（Coi_ lacryma-jobi L.）是禾本科薏苡属1年生或多年生草本植物，是重要的药食同作物之一。目前，薏苡属作物在世界范围内约有10个种或变种，我国植物志将薏苡属分为5个种4个变种1。DNA分子标记是研究遗传多样性和亲缘关系的重要工具，近年来，Qin等采用扩增片段长度多态性（AFLP）、相关序列扩增多态性（SRAP）、简单重复序列标记（SSR）等分子标记方法对薏苡种质进行筛选应用2-5。Ma等利用17对SSR引物聚类分析p 来自我国和韩国的7

4、9份薏苡种质资时发现，我国薏苡和韩国薏苡有着比较远的亲缘关系，大部分我国薏苡聚为1类，而所有的韩国薏苡被聚为1类6。江忠东等以薏苡（原变种）、念珠薏苡（变种）、薏米、水生薏苡、小珠薏苡等42份薏苡属植物为材料，筛选出5对与落粒性基因相关的STS引物，并对薏苡属植物的DNA多样性进行了分析p ，根据DNA多态性特征讨论了薏苡属植物的遗传进化关系7。当前，薏苡的基因组信息尚未公布，相关遗传性研究所用的标记数量极为有限。简单重复序列区间标记（inter-simple sequence repeats，ISSR）由于不需要知道研究材料的遗传背景，多态性高、操作简单，现已被广泛应用于多种植物的遗传多样性

5、研究8-12。本研究通过筛选ISSR分子标记，对薏苡种质遗传多样性和亲缘关系进行分析p ，以期为薏苡优异资的挖掘、品种改良和分子鉴定提供理论与技术支撑。1 材料与方法1.1 试验材料供试薏苡种质材料共92份，其中，86份来自我国贵州、云南、福建等省份，5份来自老挝，1份来自韩国，详见表1。1.2 DNA提取取薏苡饱满籽粒，采用苗盘育苗;待生长至34叶，采用天根植物新型基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，1.0琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，紫外分光光度法检测DNA浓度。1.3 ISSR扩增将DNA稀释至3050 ng/L再进行扩增。PCR反应总体系为20 L：2Taq PCR MasterM

6、i_ 10 L，10 mol/L引物1.0 L，DNA模板1.0 L，ddH2O 8.0 L。反应程序：94 预变性5 min;94 变性45 s，4560 退火45 s，72 延伸1.5 min，35个循环;72 延伸5 min。12 保存，1.5琼脂糖凝胶电泳进行ISSR分型检测，ISSR引物来自网络公布的100条通用引物，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.4 结果调查与数据统计分析p 观察琼脂糖凝胶电泳结果，记录每个样品在每个引物位点上条带的有无，同一迁移位置有带的记为1，无带的记为0。采用Ntsys 2.10e软件计算遗传距离矩阵，并分别采用非加权组平均法（UPGMA法）、

7、主成分分析p （PCA）对亲缘关系进行聚类分析p 。2 结果与分析p 2.1 ISSR引物的筛选和扩增条带多态性选取编号为71、72的样品采用100条通用ISSR引物进行DNA扩增，由表2可见，共筛选得到11对多态性引物、49条多态性条带，引物最佳退火温度（Tm）在4855 之间;11对引物中每对引物的总扩增条带数为310个，多态性条带为38个，多态性条带占比在66.7100.0之间，其中，808、809、810、811、814、836、840、842、864这9对引物的多态性条带占比为100.0（图1）。此外，从扩增效果看，筛选出的引物基序分别为（AG）n、（GA）n、（CT）n、（ATG）

8、n，其中以（AG）n、（GA）n重复基序为主，这从侧面反映出薏苡基因组AG、GA重复序列比较丰富，为下一步利用ISSR开发定向薏苡SSR标记创造了条件。2.2 薏苡种质聚类分析p 2.2.1 非加权组平均法（UPGMA） 由表3、图2可见，以相似性系数0.57为标准，可将92份薏苡种质划分为2个大类3个类群;第大类包含2个亚类，即-1亚类、-2亚类，第-1亚类共48份，占供试种质的52.17，分别为我国云南15份、贵州13份、福建5份、湖南4份、河北2份、辽宁2份、浙江1份、江苏1份、其他1份，老挝4份;第-2亚类共8份资，占供试种质的8.70，均来自我国，其中云南6份、贵州2份;第类共36份

9、资，占供试种质的39.13，分别为我国云南8份、贵州9份、四川3份、福建3份、河北2份、山西2份、浙江1份、江苏1份、山东1份、北京1份、其他3份，老挝、韩国各1份。从聚类结果整体来看，云南、贵州、福建3个省份的种质表现出较为丰富的遗传多样性，其他国家或地区的多样性水平相对较低，这可能与不同地区供试种质数目的多少也有一定关系。2.2.2 主成分分析p 法（PCA） 通过对92份薏苡种质进行主成分分析p （PCA），结果表明，第一、第二主成分值分别为 13.73、3.28，贡献率分别为34.12、8.16，前2个主成分的累积贡献率为42.28，并可将92份薏苡种质聚类分为A、B、C这3个类群（图

10、3）。主成分分析p 与UPGMA法聚类分析p 的结果基本一致，相比之下，类群A、B和-1、-2类群基本吻合，且2个类群的发散方向比较一致，均汇集成一个大类;类群C与类群A、B有不同的发散方向，且离远点的距离较远，因此，C类群与其他2个类群相比，具有更高的遗传异质性。3 结论与讨论种质资遗传多样性评价是育种的基础。ISSR标记属显性标记，具有多态性高、在不同作物中通用性强的优势，被广泛用于多种作物的品种鉴定及遗传多样性分析p 评价中，特别是适用于没有参考基因组序列信息的物种。汪斌等利用ISSR标记结合SRAP、SSR标记，绘制了红麻、黄麻的DNA指纹图谱用于不同品种的分子识别12-13;马红勃等

11、采用筛选的68个ISSR和SRAP标记，构建了187个单株的F2连锁遗传图谱，可用于烟草重要农艺性状的基因定位和分子辅助选择14;李本英等筛选出18个ISSR标记，分析p 了18个种群134份云南茶树种质的亲缘关系和多样性，全部材料间的相似系数为0.4450.819，平均为0.51215;李超等利用ISSR标记技术，分析p 163份核桃种质的遗传多样性和遗传结构时发现，居群间的遗传距离与居群的地理距离之间具有较高的相关性16;雒新艳等利用ISSR标记探讨了5个瓣类大菊品种的遗传多样性、分化程度和亲缘关系17;刘娟等则利用ISSR标记遗传距离结合不同取样策略，构建了野杏的核心种质18。夏发刚等利

12、用16对SRAP引物初步构建了73份薏苡种质资的DNA指纹图谱，为薏苡遗传研究、品种选育与资保护提供了一定依据，但是在更多资的指纹鉴定中却力有未逮19。本研究从100对ISSR通用引物中筛选出11对多态性引物，可较好地划分92份薏苡种质，在薏苡基因组信息未公布而分子标记相对缺乏的前提下，可用作薏苡分子指纹鉴定和遗传多样性研究的重要候选标记，并与有限的SRAP、SSR标记联合使用，用于薏苡的遗传分析p 。一直以来，非加权组平均法（UPGMA法）聚类分析p 是遗传多样性、亲缘关系分析p 的重要方法，而主成分分析p 在研究物种亲缘关系、不同种群的地理生态分布等方面有所应用。聚类分析p 提供了丰富的数

13、量信息，能够量化地表现出不同种质间的关系20;而主成分分析p 则从不同的方向和层面提供更多个体或居群之间的信息，能够直观、形象地描述种质资或居群间的来（或遗传）差异21。有研究表明，种质资个体或居群间的亲缘关系往往和地理分布有一定的关联性22，但也有例外，本研究将92份薏苡种质划分为3类，但并不是来自同一地区的种质都聚在一起，如编号为75、76、77、78的样品和编号为74、79、80的样品均为福建来种质，却分别聚为2个类群，亲缘关系和地理来之间并未表現出明显的关联性，这可能与取样的不均衡性和标记数量较少有关。张大乐等以聚类和主成分分析p 方法揭示了12个啤酒大麦品种的遗传背景差异23;宋烨等

14、采用12对SSR引物，通过聚类和主成分分析p 将20个苹果品种划分为4个类群，比较准确地反映了不同苹果品种的亲缘关系和加工品质特点24。本研究通过非加权组平均法（UPGMA）和主成分分析p 法（PCA）对92份薏苡种质进行聚类分析p ，均分为3个类群，聚类结果基本一致，与前人的研究结论23-24相似。UPGMA聚类和主成分分析p 在遗传关系聚类分析p 方面各有所长，可结合2种分析p 方法互为印证、补充，更准确地判断不同个体或居群间的遗传关系。【参考文献】：p ：1中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第十卷第二分册）M.北京：科学出版社，1997：289.2Qin F，Li J S，Li

15、 _ H，et al.AFLP and RFLP linkage map in Coi_J.Geic Resources and Crop Evolution，20_5，52（2）：209-214.3王 硕，何金宝，农民英，等.薏苡种质资的SRAP分子标记研究J.中草药，20_，46（1）：112-117.4郭银萍，彭忠华，赵 致，等.基于SSR标记的贵州薏苡种质资遗传多样性分析p J.植物遗传资学报，20_，13（2）：317-320.5Ma K H，Kim K H，Di_i A，et al.Newly developed polymorphic microsatellite markers

16、 in Jobs tears（Coi_ lacryma-jobi L.）J.Molecular Ecology Notes，20_6，6（3）：689-691.6Ma K H，Kim K H，Di_it A，et al.Assessment of geic diversity and relationships among Coi_ lacryma-jobi accessions using microsatellite markersJ.Biologia Plantarum，20_6，54（2）：272-278.7江忠东，郭菊卉，陈庆富.薏苡属植物DNA多样性分析p J.广东农业科学，20_

17、，40（2）：124-127，142.8方雪恩，陈 沁，印丽萍，等.ISSR在高粱属植物遗传关系研究中的应用（英文）J.作物学报，2021，34（8）：1480-1483.9李 强，刘庆昌，翟 红，等.中国甘薯主要亲本遗传多样性的ISSR分析p J.作物学报，2021，34（6）：972-977.10王海飞，关建平，孙雪莲，等.世界蚕豆种质资遗传多样性和相似性的ISSR分析p J.中国农业科学，2021，44（5）：1056-1062.11李宗艳，秦艳玲，蒙进芳，等.西南牡丹品种起的ISSR研究J.中国农业科学，20_，48（5）：931-940.12汪 斌，祁 伟，兰 涛，等.应用ISSR分

18、子标记绘制红麻种质资DNA指纹图谱J.作物学报，2021，37（6）：1116-1123.13巫桂芬，徐鲜均，徐建堂，等.利用SRAP、ISSR、SSR标记绘制黄麻基因分子指纹图谱J.作物学报，20_，41（3）：367-377.14马红勃，祁建民，李延坤，等.烟草SRAP和ISSR分子遗传连锁图谱构建J.作物学报，2021，34（11）：1958-1963.15刘本英，李友勇，唐一春，等.云南茶树资遗传多样性与亲缘关系的ISSR分析p J.作物学报，2021，36（3）：391-400.16李 超，罗淑萍，曾 斌，等.核桃种质资遗传多样性的ISSR分析p J.中国农业科学，2021，44（9

19、）：1871-1879.17雒新艳，王 晨，戴思兰，等.基于ISSR标记的大菊品种资遗传多样性分析p J.中国农业科学，20_，46（11）：2394-2402.18劉 娟，廖 康，赵世荣，等.利用ISSR分子标记构建野杏核心种质资J.中国农业科学，20_，48（10）：20_-2028.19夏法刚，黄金星，季彪俊，等.基于SRAP标记的薏苡种质资遗传多样性及DNA指纹图谱构建J.植物遗传资学报，20_，18（3）：413-420.20王薇薇，郭 军，梅 燚，等.大蒜种质资的综合评价与聚类分析p J.江苏农业学报，20_，33（2）：397-403.21何虎翼，谭冠宁，何新民，等.63份马铃薯

20、品种（系）资农艺性状的主成分与聚类分析p J.江苏农业学报，20_，33（1）：27-33.22张 晗，王建成，王东建，等.中国高粱地方品种遗传多样性评价及中、外高粱遗传变异水平比较J.作物学报，2021，37（2）：224-234.23张大乐，李锁平，雷进生，等.利用SSR标记对12个啤酒大麦品种的聚类分析p 和主坐标分析p J.河北农业大学学报，20_7，30（3）：26-31.24宋 烨，翟 衡，姚玉新，等.苹果加工品种遗传多样性分析p J.中国农业科学，20_6，39（1）：139-144.杨志坚，温杭凯，陈选阳，等.金边龙舌兰组织培养技术研究J.江苏农业科学，20_，47（5）：37-39.第 8 页 共 8 页