保健食品中罗格列酮和格列苯脲快速检测,胶体金免疫层析法（KJ202002）.docx

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1、保健食品中罗格列酮和格列苯脲快速检测,胶体金免疫层析法（KJ202002）附件2 保健食品中罗格列酮和格列苯脲的快速检测 胶体金免疫层析法 （KJ201902） 1 范围 本方法规定了保健食品中罗格列酮和格列苯脲的胶体金免疫层析快速筛查方法。 本方法适用于声称具有协助降血糖功能的保健食品中罗格列酮和格列苯脲成分的快速筛查。 2 原理 本方法采纳竞争抑制免疫层析原理。样品中的罗格列酮和格列苯脲等物质经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的改变。通过检测线与限制线（C线）颜色深浅比较，对样品中罗格列酮和格列苯脲成分进行定性

2、判定。 3 试剂与材料 3.1 试剂 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。 3.1.1 甲醇：色谱纯。 3.1.2 三羟甲基氨基甲烷，Tris碱。 3.1.3 浓盐酸。 3.1.4 吐温-20。 3.1.5 盐酸溶液：量取浓盐酸（3.1.3）16.7 mL，用水溶解并稀释至100 mL。 3.1.6 缓冲液：称取12.1 g Tris碱（3.1.2），加适量水溶解，混匀，用盐酸溶液（3.1.5）调整pH至8.0，加入5.0 g吐温-20（3.1.4）搅拌匀称，定容至1000 mL。 3.2 参考物质 参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相

3、对分子量见表1，纯度均99%。 表1 参考物质信息表 序号 中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子量 1 马来酸罗格列酮 Rosiglitazone maleate 155141-29-0 C18H17N3O3S 355.41 2 格列苯脲 Glyburide 10238-21-8 C23H28ClN3O5S 494.00 注：或等同可溯源物质。 3.3 标准溶液配制 3.3.1 罗格列酮标准储备液（1.0 mg/mL）：精密称取适量罗格列酮参考物质（3.2），用甲醇（3.1.1）溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备液。-20避光保存，有效期1年。 3.3

4、.2 罗格列酮标准工作液（10g/mL）：精密移取适量罗格列酮标准储备液（1.0mg/mL）（3.3.1）分别置于10mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为10g/mL的标准工作液。-20避光保存，有效期3个月。 3.3.3 格列苯脲标准储备液（1.0 mg/mL）：精密称取适量格列苯脲参考物质（3.2），用甲醇（3.1.1）溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备液。-20避光保存，有效期1年。 3.3.4 格列苯脲标准工作液（10g/mL）：精密移取适量格列苯脲标准储备液（3.3.3）分别置于10mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀释至刻度，

5、摇匀，制成浓度为10g/mL的标准工作液。-20避光保存，有效期3个月。 3.4 材料 罗格列酮胶体金免疫层析试剂盒及配套的试剂（可选），适用基质为保健食品。 格列苯脲胶体金免疫层析试剂盒及配套的试剂（可选），适用基质为保健食品。 4 设备与仪器 4.1 设备 4.1.1 天平：感量为0.1 mg和0.01 g。 4.1.2 涡旋混合器。 4.1.3 移液器：20-200 L，100-1000 L，5 mL。 4.1.4 离心机：转速可达4000 r/min以上。 4.2 仪器 4.2.1 读数仪：产品配套可运用的检测仪器（可选）。 4.2.2 环境条件：温度10-40，相对湿度80%。 5

6、分析步骤 5.1 试样制备 液体样品充分混匀，固体样品充分粉碎混匀。 5.2 试样提取和净化 5.2.1 液体基质 量取0.5 mL0.02 mL试样于15 mL离心管中，加入4 mL缓冲液（3.1.6），涡旋混合30 s，作为待测液。 5.2.2 固体基质 精确称取试样0.5 g0.01 g于15 mL离心管中，加1 mL甲醇（3.1.1），涡旋30 s，4000 rpm离心2 min或静置2 min。取250 L上清液于2 mL离心管中，加入750 L缓冲液（3.1.6），涡旋混合30s，作为待测液。 注：试样提取和净化（5.2）过程可根据试剂盒说明书操作，不做限定。 5.3 测定步骤 5

7、.3.1 试纸条与金标微孔测定步骤 吸取200 L样品待测液于金标微孔中，抽吸5-10次使混合匀称，室温温育5 min；温育结束后，将试纸条吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，室温温育5 min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端的吸水海绵，进行结果判定。 注：测定步骤建议根据试剂盒说明书。 5.3.2 检测卡与金标微孔测定步骤 吸取200 L上述待测液于金标微孔中，上下抽吸5-10次使混合匀称。室温温育5 min，将反应液全部加入到检测卡的加样孔中，将金标微孔中全部溶液滴加到检测卡上的加样孔中，温育5 min，进行结果判定。 注：测定步骤建议根据试剂盒说明书。 5.4 质控试验 每批样品应同时

8、进行空白试验和加标质控试验。 5.4.1 空白试验 精确称取固体空白试样0.5 g0.01 g或量取液体空白试样0.5 mL0.02 mL于15 mL离心管中，根据5.2和5.3步骤与试样同法操作。 5.4.2 加标质控试验 精确称取固体空白试样0.5 g0.01 g或量取液体空白试样0.5 mL0.02 mL于15 mL离心管中，加入适量标准工作液（3.3.2），使罗格列酮参考物质浓度为1.0 g/g或1.0 g/mL，根据5.2和5.3步骤与试样同法操作。 精确称取固体空白试样0.5 g0.01 g或量取液体空白试样0.5 mL0.02 mL于15 mL离心管中，加入适量标准工作液（3.3

9、.4），使格列苯脲参考物质浓度为1.0 g/g或1.0 g/mL，根据5.2和5.3步骤与试样同法操作。 6 结果判定 通过对比限制线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。目视判定示意图见图1。结果判定也可依据产品说明书进行。 6.1 无效 限制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条无效。 6.2 阴性结果 限制线（C线）显色，检测线（T线）颜色比限制线（C线）颜色深或检测线（T线）颜色与限制线（C线）颜色相当，均表示样品中不含待测组分或含量低于方法检测限，判为阴性。 6.3 阳性结果 限制线（C线）显色，检测线（T线）颜色比限制线（C线）颜色明显浅或检测线（T线）不显色，均表示样

10、品中待测组分含量高于方法检测限，判为阳性。 6.4 质控试验要求 空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。 图1 目视判定示意图 7 结论 当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。 8 性能指标 8.1 检出限 固体样品1.0 g/g，液体样品1.0 g/mL。 8.2 灵敏度 灵敏度95%。 8.3 特异性 特异性90%。 8.4 假阴性率 假阴性率5%。 8.5 假阳性率 假阳性率10%。 注：性能指标计算方法见附录A。 9 其他 本方法分析步骤和结果判定可以依据厂家试剂盒的说明书进行，但应符合或优于本方法规定的性能指标。 本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法运用者

11、供应便利，在运用本方法时不做限定。但方法运用者应运用经过验证的满意本方法规定的各项性能指标的试剂、试剂盒。 本方法参比标准为食品补充检验方法BJS201710保健食品中75种非法添加化学药物的检测、药品检验补充检验方法2009029降糖类中成药中非法添加化学药品补充检验方法。 本方法运用罗格列酮试剂盒可能与吡格列酮存在交叉反应；格列苯脲试剂盒可能与格列美脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮、甲苯磺丁脲存在交叉反应；当结果判定为阳性应对结果进行确证。 附录A 定性方法性能指标计算表 表A.1性能指标计算方法 样品状况a 检测结果b 总数 阳性 阴性 阳性 N11 N12 N1.=N11+N12 阴性

12、 N21 N22 N2.=N21+N22 总数 N.1=N11+N12 N.2=N21+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 显著性差异（c2） c2=（N12-N21-1）2/（N12+N21）， 自由度（df）=1 灵敏度（p+，%） p+=N11/N1. 特异性（p-，%） p-=N22/N2. 假阴性率（pf-，%） pf-=N12/N1.=100-灵敏度 假阳性率（pf+，%） pf+=N21/N2.=100-特异性 相对精确度，%c （N11+N22）/(N1.+N2.) 注： a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果； b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算运用确认后的结果。 N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，其次个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示全部的第一行，N.2表示全部的其次列；N12表示第一行，其次列。 C为方法的检测结果相对精确性的结果，与一样性分析和浓度检测趋势状况综合评价。 本方法负责起草单位：广东省食品检验所。 验证单位：江苏省南通市食品药品监督检测中心、南京工业高校。 主要起草人：汪廷彩、蔡若纯、刘海虹、雷毅。