企业管理项目名称：.docx

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1、项目名称称：脑血管疾疾病发生生和防治治的基础础研究首席科学学家：苏定冯 中国人人民解放放军第二二军医大大学起止年限限：20099.1至至20113.88依托部门门：总后勤部部卫生部部 上上海市科科委一、研究究内容以脑卒中中为代表表的脑血血管疾病病发生率率高、危危害性大大。脑卒卒中的发发生具有有不可预预测性，发生以以后有效效治疗的的时间窗窗很小(3-66小时)，神经经细胞一一旦死亡亡病人的的功能恢恢复非常常困难。尽管急急性期脑脑卒中的的死亡率率显著下下降，但但脑卒中中的发生生率是有有增无减减、越来来越高。因此，预防脑脑卒中的的发生是是关系国国计民生生的重大大科学问问题。本本项目要要解决的的关键科

2、科学问题题是：(1)以以脑卒中中的发生生机制为为重点研研究内容容，确立立干预脑脑卒中发发生的新新靶标。首先要要深刻认认识脑卒卒中发生生的病理理生理学学机制和和影响其其发生的的相关因因素，找找出其中中可以作作为药物物干预的的新的靶靶点，用用经典的的药物、基因治治疗、转转基因、基因敲敲除、RRNA干干扰等手手段，对对这些新新的靶点点进行验验证性治治疗，最最终确定定3-55个可用用于脑卒卒中预防防的新靶靶标；(2) 以严格格的脑卒卒中分型型诊断和和颅内动动脉影像像学诊断断为基础础，研究究易感基基因。通通过严格格的脑卒卒中分型型诊断，建立脑脑卒中病病人的分分型数据据库；通通过严格格的脑血血管影像像学检

3、查查，建立立脑血管管狭窄病病人数据据库。对对他们的的DNAA进行SSNP分分析和其其他研究究，发现现中国人人各型脑脑卒中和和高血压压伴颅内内动脉狭狭窄的易易感基因因，找出出高效率率的预测测脑卒中中发生的的新指标标。根据据这些指指标，探探讨对高高危人群群进行干干预的可可能性；(3) 以神神经血管管单元为为对象，研究如如何改善善脑卒中中的治疗疗。在脑脑卒中神神经损伤伤与保护护的研究究方面，我们不不应把恢恢复脑血血流和保保护神经经元作为为两个独独立的治治疗目标标，而是是要把神神经血管管单元作作为一个个整体进进行研究究。发现现新的调调节因素素，作为为干预靶靶点，改改善脑卒卒中的治治疗；(4) 探索新新

4、技术、新方法法和新的的活性化化合物在在脑卒中中研究和和防治中中的应用用。随着着分子生生物学技技术的发发展，一一大批新新的技术术和方法法用于或或将要用用于临床床。但在在脑卒中中的防治治中尚不不成熟。此外，脑卒中中发生发发展的深深入的分分子机制制和信号号转导通通路尚不不清楚。在本项项目研究究中，我我们将首首先完善善两个技技术平台台：转基基因技术术平台和和化学生生物学平平台(小小分子探探针技术术平台)。利用用这两个个技术平平台阐明明脑卒中中发生发发展的深深入的分分子机制制和信号号转导通通路，验验证我们们发现的的脑卒中中预防和和治疗的的新靶点点。并希希望给以以后的临临床应用用提供理理论基础础。(一)

5、脑卒中中发生新新的决定定或影响响因素研研究鉴于已知知的有关关因素不不足于解解释脑卒卒中的发发生，因因此研究究新的决决定或影影响因素素是当今今重要的的研究前前沿。以以血管为为基准，我们把把这些影影响因素素分为血血管内、血管壁壁和血管管外三个个方面来来叙述。从血管管外(或或全身性性)因素素看，关关键的科科学问题题有：(1)动动脉压力力感受性性反射(ABRR)功能能。我们们以前的的工作提提示ABBR功能能低下导导致脑卒卒中易发发。那么么，ABBR功能能低下是是如何导导致脑卒卒中易发发的？尼尼古丁aalphha7受受体是否否起重要要作用？没有高高血压存存在的情情况下，ABRR功能低低下是否否也能导导致

6、脑卒卒中易发发？(22)热量量限制。我们在在以往的的研究中中发现热热量限制制可以大大幅度地地延缓脑脑卒中的的发生。那么，热量限限制延缓缓脑卒中中发生的的主要机机制是什什么？SSirttuinn是否起起决定性性作用？有无可可能找到到热量限限制起保保护作用用的靶分分子？由由于热量量限制在在实践中中不容易易推广，有无可可能用相相应的靶靶分子作作为药物物新靶点点，用药药物替代代限食？(3)炎症反反应。全全身性的的炎症反反应与脑脑卒中的的发生有有没有确确切的关关系？抗抗炎治疗疗能否作作为脑卒卒中预防防的新策策略？在在脑卒中中的发生生中最重重要的炎炎症因子子是哪一一个？(4)脂脂肪细胞胞因子。具有调调节代

7、谢谢、胰岛岛素敏感感性、血血管功能能、炎症症免疫等等多种功功能活性性的脂肪肪细胞因因子能否否作为脑脑卒中防防治新靶靶标？能能否寻找找到有效效调节脂脂肪细胞胞因子表表达/活活性的天天然活性性化合物物？其脑脑卒中的的防治疗疗效和机机制如何何？从血管因因素看，血管重重构是脑脑血管疾疾病发生生的关键键。以往往对离子子通道在在脑血管管重构中中所起作作用研究究较少。少量的的研究也也仅仅涉涉及阳离离子通道道，对于于氯离子子通道在在其中的的作用主主要由本本项目组组成员开开展研究究，刚刚刚起步。关键的的科学问问题有：平滑肌肌Cl-通道（容积调调节性/ClCC-3及及Ca22+激活活Cl-通道）与Caa2+通道道

8、（ROOC和SSOC）是怎样样参与脑脑血管重重构的？这些通通道在脑脑卒中发发生过程程中起什什么样的的作用？其作用用相关的的分子机机制是什什么？如如何为防防治脑血血管重构构、进而而预防脑脑卒中从从离子通通道角度度提出新新思路及及新靶点点？从血管内内因素看看，关键键的科学学问题有有：巨噬噬细胞吞吞噬脂质质成为泡泡沫细胞胞，与TT淋巴细细胞相互互作用，分泌大大量炎性性因子，产生活活动性炎炎症是不不稳定斑斑块的重重要特征征。Tiim分子子对巨噬噬细胞及及T淋巴巴细胞均均有重要要调控作作用，TTim在在巨噬细细胞泡沫沫化、与与T淋巴巴细胞相相互作用用并介导导内皮细细胞损伤伤中发挥挥什么作作用？哪哪些分子

9、子在此过过程中起起到关键键作用？能否针针对这些些分子进进行干预预以减轻轻或消除除斑块内内炎症？已知多多种炎症症因子可可通过增增强斑块块纤维帽帽胶原的的分解代代谢途径径而诱导导斑块破破裂，但但这些因因子在胶胶原代谢谢中的分分子调节节机制尚尚不清楚楚。能否否通过研研究炎症症因子对对各个胶胶原酶转转录的影影响以明明确炎症症在斑块块易损中中的作用用机制和和发现新新的干预预靶点？为解决决这些科科学问题题，拟进进行以下下三方面面的研究究： 1. 影影响脑卒卒中发生生的全身身性因素素。(11)建立立动物模模型：对对于脑卒卒中的动动物实验验大部分分采用大大脑中动动脉阻塞塞，观察察脑损伤伤情况。如果要要对预防防

10、脑卒中中的作用用进行评评价，必必须使用用自发性性脑卒中中动物模模型。大大鼠有遗遗传性的的SHRR-SPP，但无无法用于于小鼠，这是个个世界性性难题。因此，建立小小鼠自发发性脑卒卒中动物物模型十十分必要要，以便便能使用用基因敲敲除小鼠鼠来研究究自发性性脑卒中中的发生生；(22)针对对ABRR功能。用allpahh7基因因敲除小小鼠研究究ABRR功能低低下导致致脑卒中中易发的的alppha77机制；用我们们自己培培育的全全世界唯唯一的自自发性AABR功功能缺陷陷大鼠进进一步研研究ABBR功能能与脑卒卒中的关关系；寻寻找改善善ABRR功能的的药物，用于脑脑卒中的的预防；(3)针对热热量限制制。用SS

11、irtt1基因因敲除小小鼠和慢慢病毒RRNA干干扰，研研究限食食延缓脑脑卒中的的Sirrtuiin机制制；从天天然药材材中筛选选Sirrt1激激动剂并并用于脑脑卒中的的预防；热量限限制发挥挥脑卒中中保护作作用的其其他机制制研究，包括雌雌激素受受体机制制、ABBR功能能改善机机制等；(4)针对炎炎症因子子。用SSHR-SP与与普通的的SHRR比较，观察各各组织和和血清中中炎症因因子(或或与炎症症反应有有关的因因子)的的差异表表达。对对差异表表达明显显的因子子的相应应基因进进行测序序，观察察DNAA有无突突变位点点，进一一步研究究该突变变位点对对蛋白表表达有无无影响(意义)。用基基因敲除除小鼠，制

12、成22肾2夹夹自发性性脑卒中中模型，观察白白介6、白介110、EE选择择素等在在脑卒中中发生中中的作用用。用过过表达的的方法观观察以上上因子对对SHRR-SPP脑卒中中发生的的影响；(5)针对脂脂肪细胞胞因子。采用多多种干预预手段，如：vvisffatiin重组组蛋白、特异性性酶抑制制剂FKK8666、酶产产物NMMN、抗抗体、基基因ovvereexprresssionn、基因因knoockddownn等，确确认viisfaatinn能否作作为脑卒卒中防治治新靶标标；寻找找能上调调vissfattin表表达的天天然活性性化合物物，研究究其脑卒卒中防治治疗效和和机制；采用基基因芯片片差异筛筛选等

13、策策略，发发现新的的脂肪细细胞因子子，研究究其对血血管、脑脑细胞的的作用，确认其其能否成成为脑卒卒中防治治新靶标标。(66)针对对其他因因素。通通过蛋白白质组学学、基因因芯片、代谢组组学和mmiRNNA芯片片等手段段，用SSHR-SP和和普通的的SHRR进行比比较(以以利于去去除高血血压引起起的差别别)，找找出差异异，进行行深入的的研究。比如我我们发现现SHRR-SPP大脑中中的醛脱脱氢酶显显著低于于SHRR，该酶酶的产物物之一ddopaac降低低。我们们将研究究：首先先醛脱氢氢酶是怎怎样降低低的，对对相应的的基因DDNA测测序，发发现有无无突变位位点，如如有特别别，确定定该突变变是否足足以引

14、起起表达差差异。或或者调节节醛脱氢氢酶的基基因发生生了改变变，等等等。其次次，研究究醛脱氢氢酶降低低的后果果(底物物doppal是是一种醛醛，有细细胞毒性性)，是是否与脑脑卒中的的发生有有关。2. 影影响脑卒卒中发生生的血管管壁因素素。用SSHRSSP及22肾2夹夹肾血管管性高血血压大鼠鼠研究氯氯离子通通道和钙钙离子通通道在脑脑血管重重构中的的作用：(1)Ca22+激活活Cl-通道。探讨在在高血压压脑血管管重构过过程中及及脑卒中中发生的的脑血管管平滑肌肌细胞CCa2+激活CCl-通道活活性与调调节的变变化，以以及与CCa2+调控之之间的关关系；(2)容容积调节节/CllC-33 Cll-通道。

15、研究高高血压脑脑血管重重构/脑脑卒中脑脑血管平平滑肌细细胞该通通道的功功能及调调节通路路变异；建立靶靶向敲除除血管平平滑肌CClC-3动物物模型，在此基基础上建建立相应应野生型型动物高高血压模模型，在在基因水水平比较较ClCC-3对对脑血管管重构的的影响；研究CClC-3对脑脑血管平平滑肌细细胞增殖殖/凋亡亡调节机机理；确确定CllC-33功能型型酪氨酸酸磷酸化化位点；研究CClC-3-RROS在在脑卒中中发生所所扮演的的角色；(3) Caa2+通道道。研究究在脑血血管重构构及脑卒卒中发生生过程脑脑血管平平滑肌细细胞ROOC/SSOC功功能变化化；研究究ROCC/SOOC对脑脑血管平平滑肌细细

16、胞增殖殖/凋亡亡及ROOS生成成作用与与机理；观察特特异性阻阻断ROOC/ SOCC的人参参皂甙单单体Rdd干预后后对脑血血管重构构脑卒中中的作用用及相关关作用机机理。3. 影影响脑卒卒中发生生的血管管内因素素。(11) 不不稳定斑斑块活动动性炎症症机制的的研究。巨噬细细胞泡沫沫化及其其与T细细胞的相相互作用用在不稳稳定斑块块活动性性炎症形形成中具具有重要要作用。拟研究究Timm分子在在不稳定定斑块形形成中各各类免疫疫细胞上上的表达达及其表表达调控控模式；Timm在ASS特异性性抗原oox-LLDL活活化巨噬噬细胞中中的作用用及其分分子机制制；Tiim对巨巨噬细胞胞-T淋淋巴细胞胞相互作作用的

17、影影响；TTim通通路在斑斑块破裂裂过程中中主要炎炎症细胞胞功能发发挥中的的作用，寻找关关键分子子，应用用siRRNA等等手段干干扰关键键分子或或其胞内内信号传传导通路路以观察察对不稳稳定斑块块破裂的的影响；(2) 炎症症介导血血管胶原原代谢的的分子机机制研究究。我们们首次阐阐明了TTNFa导导致斑块块纤维帽帽胶原降降解和斑斑块易损损的ASSK1JNKKNonnO 的的信号转转导通路路。拟继继续做如如下研究究：观察察血管炎炎症中主主要的炎炎性因子子对脑血血管壁中中富含的的I型、IIII型和VVI型胶胶原代谢谢的影响响；应用用siRRNA及及PGLL-3荧荧光报告告载体等等技术,发现启启动子反反

18、应序列列及相应应的转录录因子，并应用用通路抑抑制剂和和过表达达载体等等观察炎炎症因子子干预胶胶原代谢谢的信号号转导通通路；研研究TNNFa对PP4Ha11干预调调节的机机制，观观察NoonO和和DJ-1蛋白白的变化化。观察察ROSS通路在在TNFFa导致的的DJ-1过氧氧化形成成OX-DJ-1的过过程中所所起的作作用；(3)其其他研究究。包括括高血压压导致血血管壁细细胞凋亡亡机制的的研究，非瓣膜膜病心房房颤动时时血栓形形成机制制的研究究，脑卒卒中早期期生物标标志物的的研究和和血管内内皮细胞胞eNOOS表达达分子机机制的研研究等。(二) 脑卒中中的易感感基因研研究脑卒中有有许多亚亚型，各各种亚型

19、型的发生生机制不不一样，其相应应的易感感基因也也可能不不一样。以往对对脑卒中中易感基基因的研研究成效效不大的的原因可可能与此此有关。能否通通过建立立中国人人的脑卒卒中分型型资料库库，发现现不同发发病机制制分型的的脑卒中中患者的的易感基基因，提提高脑卒卒中预测测、预防防的有效效性，是是一个重重要的问问题。此此外，颅颅内动脉脉狭窄是是国人缺缺血性脑脑卒中的的理想中中间表型型。能否否通过研研究与颅颅内动脉脉狭窄相相关易感感基因，识别国国人缺血血性脑卒卒中易感感基因，进而找找出可用用作预测测、预防防脑卒中中的基因因变异？为解决决这些问问题，本本项目拟拟进行以以下研究究工作： 1. 研究各各亚型脑脑卒中

20、的的易感基基因。通通过进行行包括脑脑卒中临临床、实实验室检检查、辅辅助检查查、治疗疗及预后后等信息息的大样样本登记记研究，建立以以发病机机制为基基础的脑脑卒中分分型数据据库，研研究不同同发病机机制分型型脑卒中中患者的的生化标标记物和和易感基基因，对对不同的的发病机机制分型型与患者者的临床床表现与与预后等等进行相相关性研研究。 2. 研究颅颅内动脉脉狭窄病病人的易易感基因因。通过过对高血血压患者者中无症症状性颅颅内动脉脉狭窄的的筛查及及其危险险因素分分析，为为全基因因组关联联研究提提供样本本，并阐阐明高血血压患者者发生颅颅内动脉脉狭窄的的危险因因素；开开展颅内内动脉狭狭窄的全全基因组组关联研研究

21、，识识别国人人高血压压患者中中与颅内内动脉狭狭窄相关关的SNNP位点点；通过过为期33年的随随访研究究，进一一步验证证上述研研究发现现的基因因位点及及心血管管危险因因素在颅颅内动脉脉狭窄发发生、发发展中的的作用。 3. 脑卒中中的家系系研究。大部分分脑卒中中的遗传传属于多多基因遗遗传，但但是也存存在一些些以脑卒卒中为主主要表现现的单基基因遗传传病。对对脑卒中中的特殊殊家系研研究，有有可能发发现新的的单基因因遗传性性疾病。如果是是多基因因遗传，家系研研究也有有助于发发现易感感基因。我们最最近收集集到2个个大的脑脑卒中家家系。(三) 针对脑脑卒中神神经损伤伤和神经经保护的的研究针对缺血血性脑卒卒中

22、神经经损伤与与神经保保护的研研究，长长期以来来主要聚聚焦于神神经元而而忽略了了占脑体体积900以上上的神经经胶质细细胞(包包括星形形胶质细细胞、小小胶质细细胞等）。近年年来的研研究表明明保护胶胶质细胞胞的正常常生理功功能已经经成为脑脑卒中神神经保护护的重要要策略。进而，应该重重视神经经血管单单元(nneurrovaascuularr unnit)的集成成研究。神经血血管单元元包括：神经元元、星形形胶质细细胞、小小胶质细细胞、血血管内皮皮细胞及及胞外基基质等。但是对对该单元元中各组组分的相相互调节节作用尚尚缺乏研研究，在在脑卒中中发生时时的相互互依赖关关系尚不不清楚。在脑卒卒中发生生时起保保护作

23、用用的内源源性物质质有哪些些？能否否作为药药物作用用的新靶靶点？脑脑卒中损损伤进程程中神经经再生障障碍的细细胞与分分子机制制是什么么？为回回答这些些问题，拟进行行如下研研究：1. 系系统研究究神经-血管单单元在脑脑卒中神神经损伤伤中的作作用及其其相互调调节，阐阐明脑卒卒中神经经损伤的的关键病病理机制制，为临临床治疗疗学的突突破提供供有益的的思路与与策略； 2. 发发现与脑脑卒中神神经损伤伤高度相相关的基基因、受受体、离离子通道道、酶、信号转转导的关关键分子子等，为为研发理理想的神神经保护护剂提供供新的靶靶点；3. 应应用基因因组学、蛋白组组学知识识与技术术，探索索增强已已知的内内源性神神经保护

24、护的途径径，发现现新的内内源性神神经保护护通路及及其调节节规律；4. 研研究、阐阐明脑卒卒中损伤伤进程中中神经再再生障碍碍的细胞胞与分子子机制，探索促促神经再再生和干干细胞移移植在脑脑卒中神神经损伤伤治疗中中的应用用及其学学术基础础；5. 根根据学术术研究发发现的新新靶点，设计、合成及及从天然然产物中中获得靶靶向性先先导化合合物，为为发展自自主创新新的神经经保护剂剂积累基基础。(四) 新技术术、新方方法和新新化合物物在脑卒卒中研究究和防治治中的应应用随着分子子生物学学的发展展，一些些新技术术和新方方法应用用于基础础研究。转基因因技术在在研究疾疾病发生生的分子子机制和和发现新新治疗靶靶点的过过程

25、中具具有不可可替代的的作用，通过融融入RNNA干扰扰等其它它新技术术，人为为调高或或者调低低特定蛋蛋白质的的表达，可以验验证和确确定我们们前期发发现的和和本项目目新发现现的脑卒卒中发病病原理，获得具具有潜在在应用价价值的新新治疗靶靶点。此此外，把把小分子子化合物物作为小小分子探探针，探探索与某某些疾病病有关的的靶分子子的信号号转导通通路越来来越受到到人们的的重视。我们现现有两个个技术平平台：转转基因技技术平台台和化学学生物学学技术平平台。如如何利用用这两个个技术平平台为脑脑卒中发发生、防防治的基基础研究究服务，是本项项目要解解决的关关键问题题。1.在其其它课题题组发现现对脑卒卒中边缘缘区细胞胞

26、转归有有益和有有害因子子，提出出脑卒中中边缘区区细胞转转归机制制新理论论的基础础上，协协助其它它课题组组制备携携带这些些基因的的载体或或携带能能产生这这些基因因siRRNA的的载体，通过边边缘区转转基因，观察其其对脑卒卒中转归归的影响响，以明明确我们们新发现现的边缘缘区细胞胞转归的的分子机机制，找找出新的的治疗靶靶点。2. 经经尾静脉脉给SHHR-SSP注射射带类固固醇激素素合成急急性调节节蛋白(StAAR)的的I 型型腺相关关病毒载载体（AAAV11-SttAR），人为为提高肝肝脏内清清除血脂脂的次要要途径，观察脑脑动脉粥粥样硬化化的形成成、脑动动脉张力力、脑卒卒中发生生率和严严重程度度。为

27、我我们提出出的通过过肝脏转转基因，提高原原本次要要的将血血脂清除除出体外外或者动动脉壁的的途径，达到稳稳定甚至至消除动动脉粥样样硬化斑斑块、降降低脑卒卒中发生生率的目目的的新新策略提提供实验验依据。 3. 给给SHRR-SPP的脑动动脉转染染AAVV1-SStARR，提高高血管内内皮细胞胞清除和和逆向转转运胆固固醇的能能力，观观察其对对脑卒中中发生率率和严重重程度的的影响，探讨通通过调控控脑动脉脉内皮细细胞脂质质代谢预预防再卒卒中的假假设。4. 给给SHRR-SPP的脑动动脉转染染AAVV1-IIL-110（白白介素-10），提高高血管内内皮细胞胞生存力力，抑制制血管内内膜炎症症，观察察其对脑

28、脑卒中发发生率和和严重程程度的影影响，验验证通过过持续抑抑制脑动动脉内膜膜炎症预预防再卒卒中的假假设。5. 用用实时PPCR列列阵、多因子子酶标检检测法从从病灶组组织中筛筛选出表表达增加加最明显显的5种种对炎症症有调节节作用的的细胞因因子或化化学因子子，制备备相应的的AAVV1基因因载体，转染MMSC并并用于脑脑卒中实实验性治治疗，比比较它们们对脑缺缺血后再再灌注的的损伤与与炎症、边缘区区细胞和和转基因因细胞本本身的转转归、血血管重构构、血管管新生以以及大鼠鼠神经功功能与行行为障碍碍的影响响，明确确脑卒中中病症微微环境中中最重要要的影响响边缘区区细胞转转归的因因子，并并获得11-2个个新的治治

29、疗靶点点基因。6. 我我们建立立化学生生物学技技术平台台包含了了从5000种常常用中药药里分离离出4000000个中药药小分子子组分(平均每每个组分分含111个单体体化合物物)。我我们已经经找到了了一个水水通道蛋蛋白4(AQPP4)的的阻断剂剂和一个个氯离子子通道阻阻断剂。此外，目前正正在筛选选的新化化合物主主要针对对本项目目组其他他人提出出的新的的靶分子子，如SSirtt1的激激动剂、a7受体体激动剂剂、白介介素6的的拮抗剂剂等。提提供各个个课题组组进行深深入的研研究。二、预期期目标总体目标标：本项目以以脑卒中中发生的的决定因因素或影影响因素素为研究究重点，以SHHR-SSP大鼠鼠和2肾肾2

30、夹自自发性脑脑卒中小小鼠为基基本动物物模型，以整体体动物脑脑卒中发发生实验验、蛋白白质组学学技术、基因敲敲除、RRNA干干扰等为为基本手手段，通通过深入入的病理理生理学学研究，阐明脑脑卒中发发生的新新的决定定或影响响因素。并用基基因转移移和新的的来源于于植物的的活性化化合物针针对新靶靶点进行行试验性性治疗，以验证证可能的的预防脑脑卒中的的新靶点点。同时时，以现现有的脑脑卒中分分型数据据库和颅颅内动脉脉狭窄病病人的数数据库为为基础，充分利利用我国国的临床床病人的的资源，扩大数数据库规规模，采采用各种种先进的的手段，研究各各型脑卒卒中和研研究颅内内动脉狭狭窄的易易感基因因和遗传传标志物物。阐明明脑

31、卒中中发生新新的决定定因素或或影响因因素，阐阐明我国国脑卒中中的易感感基因和和遗传标标志物，为制定定适合我我国国情情的针对对脑卒中中的早期期预警和和干预策策略及防防治方案案提供科科学依据据，使脑脑血管疾疾病的发发生率显显著降低低。五年预期期目标：1. 确立1-2个有有关脑卒卒中发生生的新理理论，用用于指导导脑血管管疾病的的防治；2. 找出3-5个新新的与脑脑卒中发发生有关关的靶分分子，明明确其功功能及临临床意义义；3. 找出脑卒卒中各种种亚型和和颅内动动脉狭窄窄相应的的易感基基因和遗遗传标志志物，力力争将它它们连同同上述新新的靶分分子一起起用作脑脑卒中的的预警指指标； 4. 本项目实实施中取取

32、得的基基础性研研究成果果将在国国际刊物物上发表表IF5.00的SCCI收录录文章550篇以以上，其其中IFF100的8篇篇，顶级级杂志11-3篇篇；5. 本项目实实施中将将培养博士生生2000名，争争取有44-8篇篇论文评评上全国国优秀博博士论文文；培养养年轻教教师500名，争争取评上上国家杰杰青4-8名；6. 提升现有有的脑血血管病研研究基地地的学术术地位，形成33-5个个新的临临床与基基础研究究相结合合的脑血血管病研研究基地地。三、研究究方案总体研究究方案本课题项项目分为为四个部部分，以以影响或或决定脑脑卒中发发生的因因素为研研究核心心，将脑脑卒中有有关的易易感基因因、神经损损伤机制制、新

33、技技术和新新方法以以及新的的活性化化合物四四方面的的研究结结合在一一起。第一部部分从血血管外(全身性性)因素素(包括括调节紊紊乱、代代谢紊乱乱、炎症症反应等等)、血血管因素素(血管管重构)和血管管内因素素(斑块块的稳定定性、血血栓形成成)，研研究脑卒卒中发生生的影响响或决定定因素；第二部部分以脑脑卒中的的临床分分型为基基础，以以颅内动动脉狭窄窄为重点点，研究究各型脑脑卒中和和脑卒中中的中间间表型颅颅内动脉脉狭窄的的易感基基因和遗遗传标志志物；第第三部分分为神经经损伤机机制的研研究，重重点研究究神经血血管单元元；第四四部分通通过新方方法、新新技术和和新的化化合物，验证防防治脑卒卒中新的的靶点，并

34、为最最终用于于脑卒中中的防治治打下基基础。这这四个部部分又可可分成88小块，相对应应于8个个课题组组的主要要研究内内容，各各部分之之间紧密密地联系系，并相相互促进进，图示示如下：易感基因验证新靶点新技术新方法新化合物神经血管单元研究管壁因素:血管重构管内因素:斑块不稳定 验证新靶点预测预防治疗全身因素:脂肪细胞因子全身因素: 神经调节、能量代谢第一部分分 脑卒卒中发生生的决定定或影响响因素研研究影响脑卒卒中发生生的全身身性因素素拟采用两两种策略略：撒网网法和垂垂钓法。前者采采用基因因芯片、miRRNA芯芯片、蛋蛋白质组组学和代代谢组学学等手段段，发现现与脑卒卒中发生生有关的的靶分子子(如下下图

35、左侧侧)。采采用SHHR-SSP与SSHR比比较，旨旨在排除除高血压压因素，使差异异更多地地代表脑脑卒中。对找到到的靶分分子进行行深入的的研究，利用RRNA干干扰、转转基因治治疗、基基因敲除除等方法法进行中中间表型型验证和和终点指指标验证证。垂钓钓法根据据我们以以前的发发现和某某些文献献的启示示，选定定一些可可能的靶靶点或靶靶分子进进行深入入的研究究。最终终验证该该靶点或或靶分子子能否作作为预防防脑卒中中的新靶靶点(如如下图右侧侧)。SHR-SP vs SHR基因敲除小鼠2K2CSHR-SP终点指标功能验证(脑卒中的发生)中间表型功能验证(炎症，凋亡等)我们发现或文献报道可能的靶点蛋白组学代谢

36、组学RNA干扰基因治疗RNA干扰基因敲除基因芯片miRNA芯片差异表达的靶分子基因治疗基因转移研究的创创新性：(1)国外有有用基因因敲除小小鼠研究究该基因因对大脑脑中动脉脉阻塞后神神经损伤伤(梗死死面积)的影响响。由于于缺乏合合适的模模型，无无法观察察某种基基因是否否影响自自发性脑脑卒中的的发生。而要预预防脑卒卒中，必必须观察察对自发发性脑卒卒中的影影响。本本项目建建立了适适合这种种研究的的动物模模型，在在该领域域领先了了一步；(2)我们在在前期工工作中发发现ABBR功能能、长寿寿基因SSirttuinn、脂肪肪细胞因因子Viisfaatinn、IL6等等有可能能成为脑脑卒中预预防的新新靶点，

37、经过本本项目的的进一步步深入研研究，有有可能确确立其中中几个新新靶点。影响脑卒卒中发生生的血管管因素研究方案案见下图图。在与与人类高高血压相相近的遗遗传性易易卒中自自发性高高血压大大鼠（SSHR-SP）及非遗遗传性易易卒中双双肾双夹夹高血压压大鼠（RHRR-SP）模型上上，采用用斑片钳钳单离子子通道记记录, 荧光影影象动态态测定单单细胞胞胞浆Cll- 及及分子生生物学 等技术术,探讨讨Cl-通道（容积调调节性/ClCC-3及及Ca22+激活活Cl-通道）与Caa2+通道道（ROOC和SSOC）在高血血压发展展过程中中血管平平滑肌细细胞Cll- 调调控失平平衡，脑脑血管重重构及其其过程中中细胞增

38、增殖，凋凋亡及相相关信号号转导通通路的内内在关系系， 以以及在脑脑卒中发发生过程程中所起起的作用用及相关关的分子子机制, 并探探讨通过过他汀类类等药物物干预后后的影响响。阐明明Cl-通道与与Ca22+通道道脑血管管重构，脑卒中中发生过过程的作作用；为为寻找作作用新靶靶点用来来防治高高血压血血管重构构及其他他并发症症的新药药予以佐佐证。研究的创创新性：高血压发发病机理理包含遗遗传因素素及非遗遗传因素素；本研研究是在在遗传性性易卒中中自发性性高血压压大鼠及及非遗传传性易卒卒中肾性性高血压压大鼠模模型上同同步进行行，研究究工作是是在高血血压脑卒卒中发展展过程中中的不同同阶段动动态进行行, 更更能切实

39、实地反映映出高血血压易卒卒中发展展过程中中的规律律；本研研究是通通过易卒卒中高血血压大鼠鼠整体实实验与离离子/通通道水平平及基因因表达实实验结合合起来动动态监测测高血压压发展过过程中CCa2+ 与CCl- 通道的的功能与与调节的的变化以以及与血血管重构构，脑卒卒中的关关系，故故能更系系统确切切地揭示示二者的的内在关关系。WKY大鼠SHR-SP（遗传性）假手术组大鼠RHR-SP（非遗传性）新鲜分离大脑中动脉，基底动脉容积依赖性Cl-通道特性和信号调控：RhoA-Rho激酶调节通路、酪氨酸磷酸化通路PKC调节新鲜分离脑血管平滑肌细胞+他汀类+Rd-他汀类-Rd脑血管重构的形态学改变（光镜，电镜）血

40、管重构标志物表达检测（免疫荧光）培养的脑血管平滑肌细胞对细胞增殖及相关信号转导通路的影响：u ERKu RhoA-Rho激酶调节通路u 细胞周期相关蛋白Ca2+激活Cl-通道特性和细胞Ca2+调控：不同类型Ca2+通道调节、CaMKII,calcineurin调节、通道分子基础ROC 和SOC特性以及与：u ROS生成的关系u Cl-通道调控的关系u 细胞增殖信号通路的关系对细胞凋亡及相关信号转导通路的影响：细胞色素C、Bcl-2 Bax Caspase-3 Lamin A 及fodrin 等凋亡相关蛋白u 细胞周期相关蛋白+他汀类-他汀类ClC-3转染和siRNA干扰高血压不同阶段影响脑卒卒

41、中发生生的血管管内机制制研究方案案如下图所示示。建立立小鼠颈颈总动脉脉斑块动动物模型型，大鼠鼠房颤动动物模型型。针对对易损斑斑块破裂裂脱落导导致远端端动脉闭闭塞，引引起缺血血性脑卒卒中。拟拟四方面面研究影影响脑卒卒中发生生的血管管内机制制：(1)阐明227bpp miiRNAA 对一一氧化氮氮合成酶酶（eNNOS）调节的的分子机机制以及及血管内内皮细胞胞存活和和凋亡的的关键因因子及细细胞内信信号转导导通路，了解它它们在不不稳定斑斑块的形形成和发发展中所所起的作作用。通通过控制制血管内内皮细胞胞的凋亡亡，纠正正内皮细细胞的功功能异常常，以达达到稳定定斑块的的目的；(2)从炎症症因子调调节胶原原合

42、成代代谢的有有关途径径入手，探讨炎炎症因子子介导胶胶原合成成代谢的的传导通通路及它它们和血血管已损损斑块的的关系，以期通通过控制制炎症因因子来达达到稳定定斑块的的目的。(3)探讨TTim 分子参参与巨噬噬细胞活活化的过过程、巨巨噬细胞胞-T细细胞相互互作用的的分子机机制，明明确Tiim 分分子在血血管不稳稳定斑块块炎症网网络调节节机制中中的地位位，为抑抑制斑块块炎症反反应而达达到稳定定斑块提提供新的的靶点和和治疗途途径。(4)了解非非瓣膜性性房颤患患者血小小板功能能、凝血血及纤溶溶状态的的变化及及其在止止血和血血栓形成成过程中中的作用用，探讨讨非瓣膜膜性房颤颤患者高高发缺血血性脑卒卒中的分分子

43、机理理，为非非瓣膜性性房颤脑脑卒中的的防治提提供新思思路。研究的创创新性利用AppoE基基因敲除除、高脂脂喂养、内皮损损伤、脂脂多糖刺刺激和应应激状态态等多重重因素，建立了了最大程程度模拟拟人不稳稳定斑块块病变的的动物模模型；227bpp miiRNAA 是我我们首次次报道的的对eNNOS 表达有有抑制作作用的小小RNAA；构建建27 sirr-RNNA 表表达载体体(HueeNOSS-siir-RRNA）和含有有eNOOS基因因cDNNA全长长的表达达载体（HueeNOSS-cDDNA/nx227ntt）载体体，转入入eNOOS-/-老鼠鼠的胚胎胎干细胞胞，产生生出两种种基因型型转基因因鼠，

44、来来研究mmiRNNA在活活体内对对eNOOS基因因表达的的影响，属于原原创性工工作；从从血管内内皮细胞胞存活和和凋亡这这两个方方面的关关键因子子和胞内内信号转转导通路路入手，研究它它们在不不稳定斑斑块形成成和破裂裂中的作作用及其其交互对对话，在在国内外外尚未见见报道；首次提提出血管管炎症中中主要的的炎性因因子通过过调节NNonOO ,DDJ-11的变化化,来介介导血管管胶原合合成代谢谢途径, 并影影响斑块块稳定性性。提出出非瓣膜膜性房颤颤患者体体内存在在的高水水平氧化化应激产产物，使使血小板板表面CCD366表达增增加，并并以CDD36为为受体，激活血血小板，使患者者形成高高凝状态态或血栓栓

45、前状态态，并最最终引起起缺血性性脑卒中中，是新的研研究思路路。第二部分分 脑卒卒中各亚亚型和颅颅内动脉脉狭窄的的易感基基因研究究脑卒中各各亚型的的易感基基因研究究脑卒中分分缺血型型和出血血型脑卒卒中。缺缺血性脑脑卒中又又可分成成以下几几类：动动脉粥样样硬化性性大血管管闭塞(流域性性脑梗死死)；动动脉源性性脑栓塞塞；低灌灌注性脑脑梗死；心源性性脑栓塞塞；腔隙隙性脑梗梗死；其其他机制制；混合合性；发发病机制制不明。一级评评价(所所有病人人都必须须有的检检查)包包括：脑脑影像：头颅CCT和MMRI；脑供血血动脉：TCDD、颈动动脉彩超超、MRRA；其其他血管管床：肾肾动脉彩彩超、AABI；相关血血液

46、化验验：血糖糖、LDDL、HHDL、HCYY、CRRP和一一般资料料的收集集和登记记；二级级评价包包括：主主动脉弓弓斑块检检查；PPFO筛筛查(TTCD发发泡试验验，经食食道超声声)；TTCD微微栓子监监测；脑脑血流动动力学检检查和头头PWII/CTT灌注；三级评评价包括括：心脏脏MRAA；双肾肾及双下下肢MRRA；超超声颈动动脉弹性性检查；磁共振振颈动脉脉血流分分析；头头SWII(微出出血)；DTII/T22(小血血管病定定量分析析)。具具体流程程如下图图。到220088年5月月，我们们已经建建立了由由200000例例病人组组成的数数据库。本项目目拟选择择出血型型脑卒中中、动脉脉源性脑脑栓塞

47、、低灌注注性脑梗梗死、心源性性脑栓塞塞、腔隙性性脑梗死死等5种种主要类类型的脑脑卒中，每种2200例例，进行行全基因因组关联联研究。患者就诊病因发病机制对症治疗初步评价发病机制明确预后评估故一级评价全基因组关联研究以发病机制为基础的脑卒中分型数据库预后评估故发病机制不明二级评价发病机制明确病因发病机制对症治疗初步评价预后评估故三级评价发病机制明确病因发病机制对症治疗初步评价预后评估故发病机制不明发病机制不明再次评价高血压患患者中无无症状性性颅内动动脉狭窄窄的筛查查及其危危险因素素研究原发性高高血压，无脑卒卒中史及及临床症症状和体体征，男男女不限限。完成成颅内动动脉CTTA检查查10000-115000例。血血管狭窄窄程度50%判定为为颅内动动脉狭窄窄。心血血管危险险因素的的检查和和纪录：包括基基本信息息；高血压压病程；血压水水平和服服用降压压药物史史；个人人史；家家