最新影响生物转化的因素PPT课件.ppt

《最新影响生物转化的因素PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《最新影响生物转化的因素PPT课件.ppt（66页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、影响生物转化的因素影响生物转化的因素第二讲第二讲影响生物转化的重要因素影响生物转化的重要因素v最佳微生物的选择v最佳反应条件的确立。影响生物转化的重要因素影响生物转化的重要因素识别生长周期高峰酶合成的调节 诱导作用 调节诱变避免代谢物的阻遏作用渗透性辅代谢作用避免产物的抑制作用识别生长周期高峰识别生长周期高峰 如果反应是按分批反应进行的，必须确定酶含量最高的生长阶段。一般在酶含量达到最高峰后，酶会迅速地消失。酶合成的调节酶合成的调节 为了培育用于某一生物转化的优质细胞，在这种细胞内必须含有最高量的适宜的酶，因此酶合成的调节是很重要的。诱导作用诱导作用调节诱变调节诱变诱导作用诱导作用 许多编码酶

2、的结构基因在酶的作用基质不存许多编码酶的结构基因在酶的作用基质不存在时，一般是无活性的，酶的生产正常地被阻在时，一般是无活性的，酶的生产正常地被阻遏。遏。但当加入基质时，结构基因被开放，从而产但当加入基质时，结构基因被开放，从而产生了酶。生了酶。这样的过程叫做这样的过程叫做诱导作用诱导作用或或脱阻遏作用脱阻遏作用，这种，这种酶叫做可诱导酶。酶叫做可诱导酶。诱导作用示意图诱导作用示意图诱导物的种类诱导物的种类基质基质基质的类似物基质的类似物产物产物基质基质尿素酶的诱导物是尿素基质的类似物基质的类似物顺丁烯二酸 顺反异构酶 基质：顺丁烯二 酸 诱导物：丙二酸产物产物苄青霉素6-氨基青霉烷酸如：加入

3、苯醋酸 转化作用增强。这里苯醋酸是反应的产物之一，该反应是可逆的。调节诱变调节诱变诱变作用可用来消除酶形成时对加入诱导物诱变作用可用来消除酶形成时对加入诱导物的依赖性的依赖性调节诱变调节诱变突变位置与效果突变位置与效果突变位置的不同，效果也不同。突变位置突变位置：调节基因 消除活性阻遏物的合成 操纵基因 失去结合阻遏物的能力 此时，诱导物就不被需要。没有诱导物时，正常的产生诱导酶的突变体被称为组成组成突变体突变体。组成突变体的选择方法组成突变体的选择方法将经受诱变的细胞群体接种在含有非诱将经受诱变的细胞群体接种在含有非诱导物的基质作为唯一碳源的琼脂培养基导物的基质作为唯一碳源的琼脂培养基中，只

4、有组成突变体可以生长。中，只有组成突变体可以生长。在恒化器中，用含有限量浓度的基质诱在恒化器中，用含有限量浓度的基质诱导物，可选择出不再需要导物，可选择出不再需要 半乳糖苷诱半乳糖苷诱导物而且能产生高浓度导物而且能产生高浓度 半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的大肠杆菌突变体大肠杆菌突变体避免代谢物的阻遏作用避免代谢物的阻遏作用例一例一 苄青霉素转化为6-氨基青霉烷酸 该过程受葡萄糖、果糖或甘油的阻遏。例二例二 顺丁烯二酸转化为反丁烯二酸的过程草酰乙酸、苹果酸、反丁烯二酸有阻遏作用渗透性渗透性某些生物转化的进行依赖于细胞渗透性的改变，主要表现在不易渗透的基质不易渗透的基质产物被磷酸化的化合物产物被磷酸化的

5、化合物渗透性改变渗透性改变渗透性可借助诱变作用或改变环境而增强或渗透性可借助诱变作用或改变环境而增强或削弱，主要包括限制性生物素的加入或削弱，主要包括限制性生物素的加入或Mn2+产物被磷酸化的化合物产物被磷酸化的化合物v例如 嘧啶（或嘌呤）合成相应的核苷酸，在此过程中，很难用正常的细胞来完成。v 以Mn2+的一种限速生长浓度生长时，则细胞膜的组分发生变化，结果所需的酶及从属的基质（磷酸核糖焦磷酸），从细胞内漏出，因此，对催化生物转化过程有效。用这样的细胞可进行下列转化作用渗透性改变转化实例渗透性改变转化实例次黄嘌呤次黄苷次黄嘌呤次黄苷5单磷酸单磷酸烟酸烟酸单核苷酸烟酸烟酸单核苷酸腺嘌呤腺苷腺嘌

6、呤腺苷5单磷酸单磷酸鸟嘌呤鸟苷鸟嘌呤鸟苷5单磷酸单磷酸当然这种方法也可用来生产核苷当然这种方法也可用来生产核苷5二磷酸、核苷二磷酸、核苷5三磷酸三磷酸不易渗透的基质的转化不易渗透的基质的转化某些基质的不溶性，显然在生物转化中带某些基质的不溶性，显然在生物转化中带来困难。来困难。改变基质的不溶性方法改变基质的不溶性方法将不溶性基质变成可利用基质的常用方法一将不溶性基质变成可利用基质的常用方法一般有：般有：加入精细分散的悬浮液加入精细分散的悬浮液加入加入Tween80加入可溶性的络合物与酯类等。加入可溶性的络合物与酯类等。例如：例如：在转化甾体化合物时，加入环硼酸盐在转化甾体化合物时，加入环硼酸盐

7、络合物，可使甾类化合物溶解度增加络合物，可使甾类化合物溶解度增加20,000倍。倍。辅代谢作用辅代谢作用在许多生物转化中常常存在两种基质在许多生物转化中常常存在两种基质1.用于微生物生长基质用于微生物生长基质12.被转化为所需产物基质被转化为所需产物基质2例如例如pseudomonas在含有正十六烷的培养基中，能将在含有正十六烷的培养基中，能将正戊基苯转化为苯丙烯酸。其中正十六烷能促进正戊基苯转化为苯丙烯酸。其中正十六烷能促进pseudomonas生长。生长。辅代谢技术在生物转化用昂贵的基质时，是很经济的。辅代谢技术在生物转化用昂贵的基质时，是很经济的。而且还能转化不能支持微生物生长的物质。而

8、且还能转化不能支持微生物生长的物质。避免产物的抑制作用避免产物的抑制作用有时生物转化受产物的抑制是一个重要的问题。末端产物的阻遏末端产物的阻遏作用亦称之为反馈阻遏。细胞内物质代谢反应链中，某些中间代细胞内物质代谢反应链中，某些中间代谢物或末端产物过量累积，阻遏了代谢谢物或末端产物过量累积，阻遏了代谢途径中某些酶合成的现象。途径中某些酶合成的现象。产物的抑制作用实例产物的抑制作用实例细菌合成色氨酸 当菌体内有少量色氨酸时，调节蛋白为非活性，不能与操纵基因结合，当环境中有大量色氨酸时，无活性的阻遏蛋白与色氨酸结合，形成活性阻遏蛋白，使转录进行不能，从而抑制色氨酸合成。AEBCDE色氨酸色氨酸第三章

9、第三章介绍生物转化的常见反应类型介绍生物转化的常见反应类型以甾体化合物的生物转化为例进行阐述以甾体化合物的生物转化为例进行阐述甾体化合物和甾体药物简介 甾体化合物结构 甾类化合物常见种类甾体化合物和甾体药物简介甾体化合物和甾体药物简介1952年，美国普强药厂的年，美国普强药厂的Morray和和Pereroon首次利用黑根霉将黄体同转化为首次利用黑根霉将黄体同转化为11 黄体酮，人们开始认识到甾体微生物黄体酮，人们开始认识到甾体微生物转化在甾体药物生产中的重要性。转化在甾体药物生产中的重要性。微生物几乎对甾体的每个位置都能进行转微生物几乎对甾体的每个位置都能进行转化。化。几种重要的甾体微生物转化

10、发应如羟化，几种重要的甾体微生物转化发应如羟化，脱氢成为工业上生产甾体激素及其类似物脱氢成为工业上生产甾体激素及其类似物的重要手段的重要手段甾体化合物甾体化合物一类含有环戊烷多菲核的化合物在甾核的第10，13位常常含有角甲基；在3，11,17位，可能有羟基、酮基；A，B环有部分双键；17位有不同的测链。目前甾体微生物转化中受到人们广泛关注的领域目前甾体微生物转化中受到人们广泛关注的领域将微生物基因工程的新技术应用于甾体微将微生物基因工程的新技术应用于甾体微生物转化生物转化提高水不容性底物的溶解度提高水不容性底物的溶解度细胞和酶的固定化以利于酶的重复经济利细胞和酶的固定化以利于酶的重复经济利用用

11、发展经济有效的产物连续回收方式发展经济有效的产物连续回收方式将环糊精等应用于培养基以提高产量将环糊精等应用于培养基以提高产量甾体化合物结构甾体化合物结构甾体化合物编号甾体化合物编号甾类化合物常见种类甾类化合物常见种类 动物组织中：动物组织中：胆固醇、胆酸、皮脂素、胆固醇、胆酸、皮脂素、皮脂醇（氢化可的松）、皮脂酮等皮脂醇（氢化可的松）、皮脂酮等睾酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激睾酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激素。素。植物中：植物中：薯芋皂豆甾醇薯芋皂豆甾醇酵母细胞：酵母细胞：麦角固醇麦角固醇甾体类激素药甾体类激素药肾上腺皮脂激素类肾上腺皮脂激素类可的松、强的松、氢化可的松可的松、强的松、氢化

12、可的松功能：功能：抗炎、抗毒、抗过敏抗炎、抗毒、抗过敏对风湿、类风湿性关节炎、红斑狼疮等有治疗对风湿、类风湿性关节炎、红斑狼疮等有治疗作用。作用。生殖腺激素生殖腺激素孕酮、雌酮孕酮、雌酮功能：功能：调节内分泌调节内分泌人工合成避孕药人工合成避孕药长效孕酮等长效孕酮等微生物在甾体药物生产中的应用微生物在甾体药物生产中的应用 主要分为两大类主要分为两大类将天然原料转化为生产甾体化合物的普通中间体。将天然原料转化为生产甾体化合物的普通中间体。如植物皂角苷羟化生成皂角苷配基如植物皂角苷羟化生成皂角苷配基降解甾醇边链生成有用的甾体化合物中间体，降解甾醇边链生成有用的甾体化合物中间体，雄甾雄甾4烯烯3，1

13、7二酮；二酮；雄甾雄甾1，4二烯二烯3，17二酮。二酮。转化成特殊的甾体化合物的中间体，以生产我们所转化成特殊的甾体化合物的中间体，以生产我们所需要的产物。需要的产物。如：甾体如：甾体11，11 及及16 羟化，羟化，1脱氢脱氢甾体边链降解甾体边链降解微生物对甾体化合物的转化微生物对甾体化合物的转化微生物对甾体化合物的转化多种多样微生物对甾体化合物的转化多种多样它们对甾体的每一位置上的原子或基团都有可能它们对甾体的每一位置上的原子或基团都有可能进行生物转化。进行生物转化。其反应类型主要有氧化、还原、水解、酯化等等。其反应类型主要有氧化、还原、水解、酯化等等。包括甾体母核上和测链上的某个位置的羟

14、基化、包括甾体母核上和测链上的某个位置的羟基化、酮基化、环氧化、脱氢形成双链、芳香化、开环、酮基化、环氧化、脱氢形成双链、芳香化、开环、形成内酯、侧链断裂、降解。形成内酯、侧链断裂、降解。羟基化反应羟基化反应是甾体微生物转化中最重要的反应。化学法除了较容易在C17引入羟基外，在其他位置都很难引入羟基。微生物对甾体的羟基化作用微生物对甾体的羟基化作用微生物能在甾体的任何位置进行羟基化发应，微生物能在甾体的任何位置进行羟基化发应，也可在非甾类有机分子上羟基化。也可在非甾类有机分子上羟基化。简单的羟基化作用是在甾体的某个位置上引入简单的羟基化作用是在甾体的某个位置上引入O原子。原子。在甾核上至少有在

15、甾核上至少有21个位置可以发生。个位置可以发生。11位羟基化作用最重要，位羟基化作用最重要，11位位C的氧化对可的的氧化对可的松药物疗效是不可缺少的，松药物疗效是不可缺少的，11，11。除除11位位C进行羟基化反应外，进行羟基化反应外，9，14，16 的羟基化，在制备甾体药物时，生产皮质的羟基化，在制备甾体药物时，生产皮质甾类化合物及其类似物。甾类化合物及其类似物。进行甾体羟基化作用的微生物进行甾体羟基化作用的微生物转化物质转化物质作用位置作用位置微生物代表微生物代表孕酮孕酮11 11 黑根霉、黑曲霉、腊状杆菌等黑根霉、黑曲霉、腊状杆菌等弯曲孢霉弯曲孢霉化合物化合物S11 11 黑根霉、黑曲霉

16、、焦曲霉构巢曲黑根霉、黑曲霉、焦曲霉构巢曲霉霉假单孢杆菌、弗氏链霉菌、梨头假单孢杆菌、弗氏链霉菌、梨头霉霉11脱氧皮脂酮脱氧皮脂酮11 弯月弯孢霉弯月弯孢霉雌二醇雌二醇16 巨大芽孢杆菌巨大芽孢杆菌羟基化反应机理羟基化反应机理羟基化反应羟基化反应由于这些酶能将一摩尔分子氧引入底物，因由于这些酶能将一摩尔分子氧引入底物，因此被定义位单氧化酶。此被定义位单氧化酶。这种细胞色素这种细胞色素p450依赖的单氧化酶存在于几依赖的单氧化酶存在于几乎所有形式的生命体中，以游离或膜结合的乎所有形式的生命体中，以游离或膜结合的形式存在。形式存在。同位素实验证明同位素实验证明甾体羟基化中存在的问题甾体羟基化中存在

17、的问题其他重要的羟基化反应其他重要的羟基化反应n地索高诺酮（地索高诺酮（destogestrel）新型避孕药（荷兰新型避孕药（荷兰Organon公司推出）公司推出）n作用：月经周期控制好，副作用少，避孕可靠作用：月经周期控制好，副作用少，避孕可靠n我国研究：上海医科大学史纪平我国研究：上海医科大学史纪平n19去甲基去甲基13乙基雄甾乙基雄甾4烯烯3，17双双酮酮11 羟基化（金龟子绿僵菌）形成关键羟基化（金龟子绿僵菌）形成关键中间体中间体n简化合成路线，降低副反应。简化合成路线，降低副反应。n底物：底物：0.2%转化率：转化率：36甾体的边链降解甾体的边链降解n甾体边链降解甾体边链降解n甾体母

18、核降解甾体母核降解n3 羟基羟基5甾醇甾醇 9 羟基化，羟基化，1，2脱氢脱氢3酮酮4化合物化合物微生物种类不同微生物种类不同1，2脱氢，脱氢，9 羟基化羟基化 甾体边链降解甾体边链降解n采用类似脂肪酸采用类似脂肪酸 氧化的氧化过程，最后形氧化的氧化过程，最后形成成C17酮甾体。酮甾体。选择性甾体边链降解措施选择性甾体边链降解措施1n对甾醇进行结构改造，从而阻止酶对母核的降对甾醇进行结构改造，从而阻止酶对母核的降解解例如：例如：1965Sih等等将胆固醇先行改造为将胆固醇先行改造为19羟基羟基衍生物衍生物再经一步微生物转化为再经一步微生物转化为A环芳香化的雌酚酮。环芳香化的雌酚酮。选择性甾体边

19、链降解措施选择性甾体边链降解措施2n加入酶抑制剂，抑制母核降解关键酶如：加入酶抑制剂，抑制母核降解关键酶如：C1，2脱氢酶和脱氢酶和9 羟化酶。羟化酶。如：如：NiCoPbSe8羟基喹啉应用于多种分枝杆菌对胆固醇的选羟基喹啉应用于多种分枝杆菌对胆固醇的选性边链降解性边链降解金属鳌合剂金属鳌合剂2，2双联吡啶双联吡啶抑制母核降解抑制母核降解选择性甾体边链降解措施选择性甾体边链降解措施3n（3）对菌株进行诱变，产生仅降解甾醇侧链的突）对菌株进行诱变，产生仅降解甾醇侧链的突变株变株例如：例如：n原始菌株经诱变为原始菌株经诱变为诱变菌株诱变菌株Mycobacteriumsp，NRRL-B3683不加抑

20、制剂，便产生雄甾不加抑制剂，便产生雄甾1，4二烯二烯3，17二酮（二酮（ADD）n再诱变得再诱变得Mycobacteriumsp，NRRL-B3805，无无C1，2脱氢酶脱氢酶能产生雄甾能产生雄甾4烯烯3，17二酮（二酮（AD）基因工程新技术的应用基因工程新技术的应用专利：专利：nPseudomonas菌株无降解甾体的能力菌株无降解甾体的能力n将将MycobacteriumspNRRL-3683的的DNA导入导入Pseudomonas菌株中获得重组菌。菌株中获得重组菌。n重组菌可在水相，一种或几种有机相中进重组菌可在水相，一种或几种有机相中进行转化反应。行转化反应。nPseudomonas菌株

21、比菌株比MycobacteriumspNRRL-3683的生长输率快的生长输率快n结果加快转化进程，降低成本结果加快转化进程，降低成本。方法方法n分离纯化分离纯化MycobacteriumspNRRL-3683的的DNAn整合到特定质粒载体中整合到特定质粒载体中n导入导入 噬菌体中噬菌体中n用入用入 噬菌体感染噬菌体感染E。coliHB101，得，得E。coli重组子重组子n三亲杂交实现三亲杂交实现MycobacteriumspNRRL-3683的的DNA到到Pseudomonas菌株得转移。菌株得转移。如何提高甾体边链降解的产率如何提高甾体边链降解的产率接触接触引入氧形成酮基甾体氧化途径之二

22、引入氧形成酮基甾体氧化途径之二羟基氧化为酮基羟基氧化为酮基脱氢作用使甾体核形成双键脱氢作用使甾体核形成双键强的松（去氢可的松）是可的松经脱氢而强的松（去氢可的松）是可的松经脱氢而形成的，其抗炎功效比可的松高几倍。形成的，其抗炎功效比可的松高几倍。一般制备该种药物时，常常是将可的松一般制备该种药物时，常常是将可的松或氢化可的松脱氢变为去氢可的松或去或氢化可的松脱氢变为去氢可的松或去氢氢化可的松。氢氢化可的松。A环芳香化环芳香化所谓所谓A环芳香化是指甾体环芳香化是指甾体A环核上的每个环核上的每个C原子都脱氢形成双键，而变为芳香化结原子都脱氢形成双键，而变为芳香化结构。雌性激素的生产（雌二醇），可通

23、构。雌性激素的生产（雌二醇），可通过此方法获得过此方法获得脱氢反应的常见微生物为：简单节杆菌、脱氢反应的常见微生物为：简单节杆菌、各种芽孢杆菌（蜡状芽孢杆菌、巨大芽各种芽孢杆菌（蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌）、镰刀霉、长蠕孢菌属。孢杆菌）、镰刀霉、长蠕孢菌属。侧链降解侧链降解n微生物对甾体侧链的降解，解决了天然甾体微生物对甾体侧链的降解，解决了天然甾体化合物作原料合成甾体激素的问题，为利用化合物作原料合成甾体激素的问题，为利用原价的原料开辟了新的途径。原价的原料开辟了新的途径。n常见微生物有：常见微生物有：n简单节杆菌简单节杆菌n球形芽孢杆菌球形芽孢杆菌n玫瑰芽孢杆菌玫瑰芽孢杆菌n淡紫青霉淡紫青霉n藤黄诺卡氏菌藤黄诺卡氏菌结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！66