乳糖操纵元和色氨酸操纵元.ppt

《乳糖操纵元和色氨酸操纵元.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《乳糖操纵元和色氨酸操纵元.ppt（84页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、乳糖操纵元乳糖操纵元(lacoperon)内容提要：内容提要：乳糖操纵元的结构乳糖操纵元的结构酶的诱导酶的诱导laclac体系受调控的证据体系受调控的证据乳糖操纵元调控模型乳糖操纵元调控模型影响因子影响因子一、乳糖操纵元的结构一、乳糖操纵元的结构i基因基因PO lacZ lacY lacA阻遏阻遏基因基因C CA AP P 启启动动子子 操操纵纵基因基因结结构基因构基因代谢激活蛋代谢激活蛋白结合位点白结合位点单林娜制作乳糖操纵元的结构乳糖操纵元的结构LacZLacILacALacY1040351078082582repressor-galactosidasepermease transacet

2、ylase单林娜制作图图LacLac操纵元及各组分详图操纵元及各组分详图单林娜制作乳糖操纵元的结构乳糖操纵元的结构1)结构基因：结构基因：分解乳糖的三种酶，使乳糖分解，产分解乳糖的三种酶，使乳糖分解，产生能量。生能量。2)操纵基因操纵基因3)启动子启动子4)CAP5)i基因：上游，产生阻遏物。基因：上游，产生阻遏物。单林娜制作结构基因结构基因lacZlacZ编编码码-半半乳乳糖糖苷苷酶酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖lacYlacY编编码码-半半乳乳糖糖苷苷透透过过酶酶：使外界的-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。lacAlacA编编码码-半半乳乳糖糖苷苷乙乙酰酰基基转

3、转移移酶酶：乙酰辅酶A上的乙酰基转到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。单林娜制作Twophysiologicallyimportantreactionscatalyzedby-galactosidase2003JohnWileyandSonsPublishers异乳糖异乳糖乳糖乳糖别乳糖别乳糖IPTG结合lac阻遏物去阻遏单林娜制作一些化学合成的乳糖类似物，不受-半乳糖苷酶的催化分解，却也能与R特异性结合，使R构象变化，诱导lac操纵元的开放。例如异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside,IPTG)就是很强的诱导剂，不被细胞代谢而十分稳定。X-gal(5-溴-4-氯-3

4、-吲哚-半乳糖苷)也是一种人工化学合成的半乳糖苷，可被-半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此可以用作-半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal（分子式见图）都被广泛应用在分子生物学和基因工程的工作中。单林娜制作如果某种物质能够促使细菌产生酶而本身又不被分解，这种物质被称为义务诱导物，如IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）。义务诱导物义务诱导物(gratuitous inducer)：CH2OH CH3 HO O SCCH3H CH3OH HHHH OHIPTG单林娜制作二、酶的诱导二、酶的诱导laclac体系受调控的证据体系受调控的证据单林娜制作乳糖操纵元的双调控系统：(1)受乳糖与阻遏蛋白

5、调控的、可诱导的负调控系统;(2)受cAMP与CAP调节的、可诱导的正调控系统。葡萄糖通过调节cAMP的合成间接监控这一过程。以此保证大肠杆菌灵活、经济、有效地适应外界环境，只有在必需的时候（只有乳糖，没有葡萄糖）才启动乳糖操纵子的表达。三、乳糖操纵元调控模型三、乳糖操纵元调控模型单林娜制作（一）阻遏蛋白的负性调节：（一）阻遏蛋白的负性调节：（分解代谢）（分解代谢）可诱导调控可诱导调控（二）（二）CAPCAP的正性调节的正性调节 （三）协调调节（三）协调调节单林娜制作（一）阻遏蛋白的负性调节（一）阻遏蛋白的负性调节 （分解代谢）（分解代谢）可诱导调控可诱导调控1 1、乳糖操纵元调控模型主要内容

6、、乳糖操纵元调控模型主要内容2 2、阻遏蛋白的负性调节：、阻遏蛋白的负性调节：（分解代谢）（分解代谢）负控诱导负控诱导单林娜制作1 1、乳糖操纵元调控模型主要内容、乳糖操纵元调控模型主要内容 Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码。该mNA分子的 启动区（P）位于阻遏基因（I）与操纵区（O）之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效表达；操纵子(operater)是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点。当阻遏物与操纵基因结合时，lacmRNA的转录起始受到抑制。单林娜制作诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发lacm

7、RNA的合成。当有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。乳糖操纵元调控模型主要内容：乳糖操纵元调控模型主要内容：单林娜制作单林娜制作RNA聚合酶结合部位聚合酶结合部位阻遏物结阻遏物结合部位合部位StartpointofthelacoperonRepressorandRNApolymasebindatsitethatoverlaparoudthestartpointofthelacoperon单林娜制作GC操纵位点的回文序列操纵位点的回文序列Centerofsymmetry单林娜制作未诱导：结构基因被阻遏阻遏物四聚体LacI P O lacZ lacY

8、lacA图图当无诱导物时阻遏物结合在操纵基因上当无诱导物时阻遏物结合在操纵基因上单林娜制作诱导：基因被打开-半乳糖苷酶透性酶乙酰转移酶图诱导物和阻遏物成为调节操纵元的开关单林娜制作2 2、阻遏蛋白的负性调节：、阻遏蛋白的负性调节：（分解代谢）（分解代谢）负控诱导负控诱导1)无乳糖存在时，阻遏物可以结合在操纵基因上阻止转录过程基因关闭2)有乳糖存在时，乳糖与阻遏物结合阻遏物变构阻遏物不能结合操纵基因转录进行基因开放单林娜制作单林娜制作可诱导调控的操纵元，其基因表达产物都是利用某种营养物的酶体系（分解代谢）有营养物相应基因开放无营养物细胞就没必要产生相应的酶单林娜制作1 1调控机理：调控机理：CA

9、P：Cataboliteactivatorprotein，分解代谢活化剂蛋白，由活化剂基因(A)编码。也叫环腺苷酸受体蛋白(cAMPreceptorprotein,CRP)。（二）（二）CAPCAP的正性调节的正性调节 单林娜制作cAMP：CyclicAMPATP在腺苷酸环化酶的作用下转变成 环 腺 苷 酸(cyclicadenosinemonophosphate,cAMP)。Theadenylcyclase-catalyzedsynthesisofcyclicAMP(cAMP)fromATP2003JohnWileyandSonsPublishers单林娜制作CAP有有2种状态：种状态：无无

10、活活性性态态：CAP未与cAMP结合时是没有活性的，不能与特定的特定的DNA序列序列结合。活活性性态态：CAP与cAMP结合后，发生空间构象的变化而活化，能以二聚体的方式与特特定定的的DNA序序列列结合，从而增强RNA聚合酶的转录活性，可使转录提高50倍。单林娜制作ZYAOPDNA调控区调控区CAPCAP结合位点结合位点启动序列启动序列操纵序列操纵序列结构基因结构基因Z Z：-半乳糖苷酶半乳糖苷酶Y Y：透酶透酶A A：乙酰基转移酶：乙酰基转移酶在lac操纵元的启动子Plac上游端有一段与Plac部分重叠的序 列，能 与 CAP特 异 结 合，称 为 CAP结结 合合 位位 点点(CAPbin

11、dingsite)。单林娜制作（二）（二）CAPCAP的正性调节的正性调节 单林娜制作在什么条件下在什么条件下cAMP能够与能够与CAP结合呢？结合呢？单林娜制作当葡萄糖浓度高时，cAMP浓度降低，CAP不能被活化，lac操纵元的结构基因表达下降（如下图）。当葡萄糖浓度低时，cAMP浓度升高，CAP被活化，lac操纵元的结构基因表达上升（如下图）。单林娜制作单林娜制作2 2、CAPCAP正调控的意义正调控的意义l葡萄糖、乳糖同葡萄糖、乳糖同时时存在存在时时，葡萄糖先利用，葡萄糖先利用1）有葡萄糖存在时，cAMPcAMP-CAP，不能结合CAP位点上，正调控作用乳糖操纵元不能表达。（虽虽然有乳糖

12、存在，乳糖操然有乳糖存在，乳糖操纵纵元不开放基因元不开放基因）单林娜制作2）无葡萄糖存在时，cAMPcAMP-CAP正调控作用基因表达。CAP正调控的意义在于保证经济有效地利用碳源。正调控的意义在于保证经济有效地利用碳源。对对lac操操纵纵元元来来说说CAP是是正正性性调调节节因因素素，lac阻阻遏遏蛋蛋白白是是负负性性调调节节因因素素。两两种种调调节节机机制制之之间间是是何何种种关系呢？关系呢？单林娜制作lCAPCAP和laclac阻阻遏遏蛋蛋白白两种调节机制根据存在的碳源性质及水平协调调节lac操纵元的表达。-当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用-如无CAP存在，即使没有阻遏蛋

13、白与操纵序列结合，操纵元仍无转录活性。cAMPCAP复合物与启动子区的结合是转录起始所必需的。（三）协调调节（三）协调调节单林娜制作单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。葡葡萄萄糖糖对对lac操操纵纵元元的的阻阻遏遏作作用用称称为为分分解解代代谢阻遏谢阻遏(catabolicrepression)。单林娜制作单林娜制作单林娜制作TheLacOperon:WhenGlucoseIsPresentButNotLactoseRepressorPromoterLacYLacYLacALacZOperatorCAPBindingRNAPol.Repr

14、essorRepressorRepressor mRNAHey man,Im constitutiveCome on,let me throughNo wayJose!CAPCAP单林娜制作TheLacOperon:WhenLactoseIsPresentButNotGlucoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressor mRNAHeyman,ImconstitutiveCAPcAMPLacRepressorRepressorXThis lactose has bent me out of shapeCA

15、PcAMPCAPcAMPRNAPol.RNAPol.Yipe!Bind to mePolymerase单林娜制作TheLacOperon:WhenNeitherLactoseNorGlucoseIsPresentRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingCAPcAMPCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeraseRNAPol.RepressorRepressor mRNAHey man,Im constitutiveRepressorSTOPRight therePolymeraseAlright,Im off to t

16、he races.Come on,let me through!单林娜制作四、影响因子四、影响因子1、lac操纵元的本底水平表达操纵元的本底水平表达2、大肠杆菌对乳糖的反应、大肠杆菌对乳糖的反应3、阻遏物、阻遏物lacI基因产物及功能基因产物及功能4、葡萄糖对、葡萄糖对lac操纵元的影响操纵元的影响5、cAMP与代谢物激活蛋白与代谢物激活蛋白(P239)单林娜制作1 1、laclac操纵元的本底水平表达操纵元的本底水平表达有两个矛盾是操纵元理论所不能解释的：诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物需要透过酶，后者的合成又需要诱导物诱导。解释：一些诱导物可以在透过酶不存在时进入细胞？一

17、些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成？单林娜制作真正的诱导物是异构乳糖而非乳糖，前者是在-半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的，因此，需要有-半乳糖甘酶的预先存在。解释：本底水平的组成型合成：非诱导状态下有少量的lacmRNA合成。单林娜制作2 2、大肠杆菌对乳糖的反应、大肠杆菌对乳糖的反应培养基：甘油培养基：甘油按照lac操纵元本底水平的表达，每个细胞内有几个分子的-半乳糖苷酶和-半乳糖苷透过酶；培养基：加入乳糖：培养基：加入乳糖：透过酶透过酶进入细胞-半乳糖苷酶半乳糖苷酶异构乳糖诱导诱导lacmRNA的生物合成大量乳糖进入细胞多数被降解为葡萄糖和半乳糖（碳源和能源）异构乳糖少量乳糖透过酶透过酶单

18、林娜制作乳糖H OHHOOH HHCH2OH H O OHHO OH O CH2CH2OH H OHOH H HO O H 别乳糖别乳糖H O OH H H H OH OH H H H2OH H H O OH CH2OH CH2OHH OH CH2OH H O OH HO O OHH H OH H OHHO HH HHH OH H OH葡萄糖葡萄糖半乳糖半乳糖H 图图乳糖分解的不同产物乳糖分解的不同产物单林娜制作BasallevelBasallevelBasallevelInducedlevel诱导物的加入和诱导物的加入和去除对去除对laclac mRNA mRNA的影响的影响Inducedl

19、evelAddInducerRemoveInducer单林娜制作3 3、阻遏物、阻遏物lac I基因产物及功能基因产物及功能 Lac Lac 操操纵纵元元阻阻遏遏物物mRNA是是由由弱弱启启动动子子控控制制下下组组成成型型合合成成的的，每每个个细细胞胞中中有有5-10个个阻阻遏遏物分子。物分子。当当I基基因因由由弱弱启启动动子子突突变变成成强强启启动动子子，细细胞胞内内就就不不可可能能产产生生足足够够的的诱诱导导物物来来克克服服阻阻遏遏状状态态，整个整个lac操纵元在这些突变体中就不可诱导。操纵元在这些突变体中就不可诱导。单林娜制作强启动子区强启动子区单林娜制作4 4、葡萄糖对、葡萄糖对lac

20、lac操纵元的影响操纵元的影响如如果果将将葡葡萄萄糖糖和和乳乳糖糖同同时时加加入入培培养养基基中中，laclac操操纵纵元元处处于于阻阻遏遏状状态态，不不能能被被诱诱导导；一一旦旦耗耗尽尽外外源源葡葡萄萄糖糖，乳乳糖糖就就会会诱诱导导laclac操纵元表达分解乳糖所需的三种酶。操纵元表达分解乳糖所需的三种酶。代谢物阻遏效应代谢物阻遏效应单林娜制作5 5、cAMPcAMP与代谢物激活蛋白与代谢物激活蛋白(P239)(P239)细菌中的cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关：当细菌利用葡萄糖分解供给能量时，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。单

21、林娜制作ATP腺甘酸环化酶腺甘酸环化酶cAMP（环腺苷酸）（环腺苷酸）大肠杆菌中：无葡萄糖，大肠杆菌中：无葡萄糖，cAMPcAMP浓度高；浓度高；有葡萄糖，有葡萄糖，cAMPcAMP浓度低浓度低单林娜制作+转录转录无葡萄糖，无葡萄糖，cAMPcAMP浓度高时浓度高时促进转录促进转录有葡萄糖，有葡萄糖，cAMPcAMP浓度低时浓度低时不促进转录不促进转录ZYAOPDNACAPCAPCAPCAPCAPCAPCAP的正调控的正调控单林娜制作9.4 9.4 色氨酸操纵元色氨酸操纵元（trp operontrp operon）内容提要：内容提要：色氨酸操纵元的结构色氨酸操纵元的结构色氨酸操纵元的色氨酸操

22、纵元的阻遏系统阻遏系统色氨酸操纵元的弱化机制色氨酸操纵元的弱化机制单林娜制作一、色氨酸操纵元的结构色氨酸是构成蛋白质的组分。一一般般的的环环境境难难以以给给细细菌菌提提供供足足够够的的色色氨氨酸酸，细细菌菌要要生生存存繁繁殖殖通通常常需需要要自自己己经经过过许许多多步步骤骤合合成成色色氨氨酸。酸。但是一旦环境能够提供色氨酸时，细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸，以减轻自己的负担。细细菌菌所所以以能能做做到到这这点点是是因因为为有有色色氨氨酸酸操操纵纵元元(trpoperon)的调控。的调控。单林娜制作调控基因调控基因 结构基因结构基因 催化分枝酸转变为色氨酸催化分枝酸转变为色氨

23、酸 的酶的酶一、色氨酸操纵元的结构一、色氨酸操纵元的结构trpRtrpRPLeaderLeader前导序列前导序列单林娜制作单林娜制作(1)trpR和trpABCDE不连锁；(2)操纵基因在启动子内(3)有衰减子(attenuator)/弱化子(4)启动子和结构基因不直接相连，二者被 前导序列(Leader)所隔开 色氨酸操纵元的特点色氨酸操纵元的特点单林娜制作二、二、trp trp 操纵元的阻遏系统操纵元的阻遏系统低Trp时：阻遏物不结合操纵基因;高Trp时：阻遏物+Trp 结合操纵基因 trpR trpP trpO trpE trpD trpC trpB trpAtrpR trpP trp

24、O trpE trpD trpC trpB trpA 蛋白蛋白 TrpR(TrpR(无活性无活性)活化的活化的 阻遏蛋白阻遏蛋白 阻遏物阻遏物 (Trp)(Trp)图图1616-27 TrpR27 TrpR被被Trp Trp 激活后可阻遏激活后可阻遏trptrp 操纵元的转录操纵元的转录 (仿仿B.Lewin:GENES，1990,Fig.13.16)trp trp 操纵元的阻遏系统操纵元的阻遏系统trpRtrptrptrpRP调控基因调控基因 结构基因结构基因 催化分枝酸转变为色氨酸催化分枝酸转变为色氨酸 的酶的酶三、三、trp trp 操纵元的弱化机制操纵元的弱化机制衰减子（衰减子（att

25、enuator）/弱化子弱化子前导序列（前导序列（leadersequence）单林娜制作现现象象：实验观察表明：当色氨酸达到一定浓度，但还没有高到能够活化R使其起阻遏作用的程度时，产生色氨酸合成酶类的量已经明显降低，而且产生的酶量与色氨酸浓度呈负相关。机机制制：仔细研究发现这种调控现象与色氨酸操纵元特殊的结构有关。单林娜制作1 1、弱化子：、弱化子：DNADNA中可导致转录过早终止中可导致转录过早终止的一段核苷酸序列（的一段核苷酸序列（123-150123-150区）。区）。123150Attenuatorsequence单林娜制作 研究引起终止的mRNA碱基序列，发现该区mRNA通过自我配

26、对可以形成茎茎-环环结构，有典型的终止子终止子特点。图图trp弱化子弱化子mRNA的终止区的终止区单林娜制作2 2、前导序列、前导序列：在：在trp mRNA5trp mRNA5端端trpEtrpE基因的基因的起始密码前一个长起始密码前一个长162bp162bp的的mRNAmRNA片段。片段。单林娜制作单林娜制作3 3、弱化机制、弱化机制（P244P244）单林娜制作单林娜制作a)如果当其他氨基酸短缺(注意：短开放读框编码的14肽中多数氨基酸能由环境充分供应的机会是不多的)或所有的氨基酸都不足时，核糖体翻译移动的速度就更慢，甚至不能占据1的序列，结果有利于1和2、3和4发夹结构的形成，于是RN

27、A聚合酶停止转录，等于告诉细菌：“整个氨基酸都不足，即使合成色氨酸也不能合成蛋白质，不如不合成以节省能量”。单林娜制作b)Low tryptophan levels当当色色氨氨酸酸浓浓度度低低时时，生生成成的的tRNAtRNAtrptrp就就少少，核核糖糖体体在在序序列列1 1的的trptrp密密码码子子处处暂暂停停，序序列列2 2和和3 3之之间间形形成成配配对对结结构构，阻阻止止了了衰衰减减，因因为为序序列列3 3不不再再与与序序列列4 4之之间间形形成成衰衰减减结结构构，RNARNA聚聚合合酶酶得得以以沿沿DNADNA前前进进，继继续续去去转转录录其其后后trpEtrpE等等基基因，因，

28、trptrp操纵元就处于开放状态。操纵元就处于开放状态。单林娜制作当当色色氨氨酸酸浓浓度度增增高高时时，tRNAtRNAtrptrp浓浓度度随随之之升升高高，核核糖糖体体快快速速翻翻译译序序列列1(1(前前导导肽肽阅阅读读框框)，占占据据到到2 2的的机机会会增增加加，1 1和和2 2生生成成发发夹夹结结构构的的机机会会减减少少，3 3和和4 4形形成成类类似似终终止止子子的的衰衰减子结构的机会增多，导致减子结构的机会增多，导致RNARNA聚合酶终止转录。聚合酶终止转录。c)High tryptophan levels单林娜制作前导肽前导肽转录终止结构转录终止结构单林娜制作l细菌通过弱化作用弥

29、补阻遏作用的不足，因为阻遏细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，对于已经起始的转录，只作用只能使转录不起始，对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停下来。能通过弱化作用使之中途停下来。l阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少；弱化作用阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少；弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA的多少，它的多少，它通过前导肽的翻译来控制转录的进行。通过前导肽的翻译来控制转录的进行。l在细菌细胞内这两种作用相辅相成，体现着生物体在细菌细胞内这两种作用相辅相成，体现着生物体内周密的调控作用。内周密的调控作用。单林娜制作在t

30、rp操纵元中，对结构基因的转录，阻阻遏遏蛋蛋白白的负调控起到粗粗调调的作用，而衰衰减减子子起到细调细调的作用。细菌其他氨基酸合成系统的许多操纵元(如组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等操纵元)中也有类似的衰减子存在。单林娜制作其他操纵元其他操纵元一、半乳糖操纵元一、半乳糖操纵元二、阿拉伯糖操纵元二、阿拉伯糖操纵元单林娜制作一、半乳糖操纵元一、半乳糖操纵元(galactose operon)(galactose operon)异构酶异构酶(galE)乳糖乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galT)半乳糖激酶半乳糖激酶(galk)。单林娜制作galgal操纵元的结构操纵元的结

31、构单林娜制作gal操纵元的特点：操纵元的特点：它它有有两两个个启启动动子子，其其mRNA可可从从两两个个不不同同的起始点开始转录；的起始点开始转录；它它有有两两个个O区区，一一个个在在P区区上上游游，另另一一个个在结构基因在结构基因galE内部。内部。单林娜制作二、阿拉伯糖操纵元二、阿拉伯糖操纵元 （arabinose operon)arabinose operon)araB基因、araA基因和araD,形成一个基因簇，简写为araBAD 三个基因的表达受到ara操纵元中araC基因产物AraC蛋白的调控。单林娜制作ara操纵元的调控有两个特点：第一，araC表达受到AraC的自身调控。第二，AraC既是ara操纵元的正调节蛋白（需cAMP-CRP的共同参与，起始转录），又是其负调节蛋白。这种双重功能是通过AraC蛋白的两种异构体来实现的（Pi和Pr)。单林娜制作单林娜制作单林娜制作单林娜制作