大肠菌群测定方法.docx

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1、大肠菌群及检验一、 大肠菌群介绍大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它 不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪 便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致， 其定义为：需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸产气的革兰 氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、 柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分 布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究说明，大 肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有 粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自 然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，

2、而外界环 境中那么以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染 指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否 粪便污染。大肠菌群数的高低，说明了粪便污染的程度，也反映 了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健 康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正 常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺 氏菌等），因而食品中有粪便污染，那么可以推测该食品中存在着 肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必 须看作对人体健康具有潜在的危险性。 大肠菌群是评价食品 卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生 工 作中。

3、二、大肠菌群检验方法： 由于大肠菌群指的是具有某些特 性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37 能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的 检测一般都是按照它的定义进行。 目前国内采用的进出口食 品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业 标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。（一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、 别离培养和证实试验。 乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三 个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。361培养 482h,观察是否产气。 别离培养：将产气发酵管培养物转 种于伊红美蓝琼脂平板上，361培养18-24h,观

4、察菌落形态。 证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时 接种乳糖发酵管361培养242h,观察产气情况。 报告： 根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100nli （g） 大肠菌群的MPN值。具体操作参见GB4789. 3-94中华人民共和国国家标准 食品 卫生微生物学检验大肠菌群测定（二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准 方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法： 推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度 接种三管LST肉汤。361培养482h,观察是否产气。 证 实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤

5、管中， 361培养482h,观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN 表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN值。 具体操作参见 SN01 69-92中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食 品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法三、说明：1. MPN 检 索表： MPN 为最大 可能数(Most Probab 1 e Number) 的简称。这种方法，对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基 进行培养，从规定的反响呈阳性管数的出现率，用概率论来推算 样品中菌数最近似的数值。 MPN检索表只给了三个稀释度， 如改用不同的稀释度，那么表内数字应相应降低或增加10倍。注意 国家标准和行

6、业标准中所附MPN表所用稀释度是不同的，而且结 果报告单位也 不相同。2.初发酵和证实试验： 无论是国家标准的三步法还是行业 标准的两步法，都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，培养 基的配制略有不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的 定义，即“在37c分解乳糖产酸产气”。 初发酵阳性管， 不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴 性。有数据说明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与 证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需 的。 3.产气量与倒管： 在乳糖发酵试验工作中，经常可 以看到在发酵倒管内极微少的气泡(有时比小米粒还小)，有时 可以遇到在初发

7、酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表 明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少 者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发 酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮， 即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。4 .挑选菌落： 国家标准中，需要对初发酵阳性培养物接种 伊红美蓝平板别离，对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。由 于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、形 态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密 切相关。国家标准方法规定伊红美蓝平板为别离培养基，在该平 板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率

8、最高； 红色、粉红色菌落检出率较低。 另外，挑取菌落数与大肠菌 群的检出率有密切关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其 当菌落不典型时，很难防止假阴性的出现。所以挑菌落一定要挑 取典型菌落，如无典型菌落那么应多挑几个，以免出现假阴性。5 .抑菌剂： 大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷 基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作 用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。 国家标准 中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中LST肉汤利 用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑 菌剂。 抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌 群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一 些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑 菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法进行。