实验二培养基的制备消毒与灭菌.ppt

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1、实验二培养基的制备消毒与灭菌 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望培养基配制实验原理v培养基是人工配制的适合微生物生长繁培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。殖或积累代谢产物的营养基质。v人工制备培养基的目的，在于给微生物人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。创造一个良好的营养条件。培养基配制要素v营养：碳源、氮源、能源、生长因子、营养：碳源、氮源、能源、生长因子、水分和无机盐；水分和无机盐；v适宜的酸碱度适宜

2、的酸碱度(pH(pH值值)和一定缓冲能力；和一定缓冲能力；v一定的氧化还原电位；一定的氧化还原电位；培养基的分类 根据微生物的种类和实验目的的不同，根据微生物的种类和实验目的的不同，培养基分类可以按以下方式：培养基分类可以按以下方式：1.按按成分成分的不同分的不同分2.按培养基的按培养基的物理状态物理状态分分3.按培养基的按培养基的用途用途分分按照培养基的成分来分v天然培养基天然培养基:主要成分是复杂的天然有机主要成分是复杂的天然有机物质：如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培物质：如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基、养基、LB等。等。v合成培养基合成培养基:用化学成分完全了解的纯化用化学成分完全了解

3、的纯化合物药品配制而成的培养基：高氏一号培合物药品配制而成的培养基：高氏一号培养基和査氏培养基等。养基和査氏培养基等。按照培养基的物理状态v固体培养基固体培养基：加入凝固剂，如：加入凝固剂，如1.5%2.0%琼脂琼脂v半固体培养基半固体培养基：加入少量凝固剂，如：加入少量凝固剂，如 0.2%0.7%琼脂琼脂v液体培养基液体培养基：不含任何凝固剂：不含任何凝固剂按照培养基的用途分v基础培养基基础培养基：如牛肉膏蛋白胨培养基。：如牛肉膏蛋白胨培养基。v营养培养基（加富培养基）营养培养基（加富培养基）：如添加血清、血液：如添加血清、血液等。等。v鉴别培养基鉴别培养基：含有特定化合物或试剂。某种微生：

4、含有特定化合物或试剂。某种微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应，根据这一特征性反应可以将某种的特征性反应，根据这一特征性反应可以将某种微生物与他种微生物区别开来。微生物与他种微生物区别开来。如酪素培养基、如酪素培养基、伊红美蓝培养基等伊红美蓝培养基等v选择培养基选择培养基：利用微生物对某种化学物质的敏感：利用微生物对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入这类物质，抑制不需要性不同，在培养基中加入这类物质，抑制不需要的微生物生长，而利用所需分离的微

5、生物生长，的微生物生长，而利用所需分离的微生物生长，从而达到分离或鉴别某种微生物的目的。从而达到分离或鉴别某种微生物的目的。如无氮如无氮培养基、马丁氏培养基等。培养基、马丁氏培养基等。加富培养基是用来增加所要分离的微加富培养基是用来增加所要分离的微生物的数量，使其形成生长优势，从生物的数量，使其形成生长优势，从而分离到该种微生物；而分离到该种微生物；选择培养基选择培养基则一般是抑制不需要的微则一般是抑制不需要的微生物的生长，使所需要的微生物增值，生物的生长，使所需要的微生物增值，从而达到分离所需微生物的目的。从而达到分离所需微生物的目的。加富培养基加富培养基与选择培养基的区别与选择培养基的区别

6、牛肉膏蛋白胨培养基的制备应用最广泛的细菌基础培养基，普通培养基应用最广泛的细菌基础培养基，普通培养基v牛肉膏：牛肉膏：3 gv蛋白胨：蛋白胨：10 gvNaCl：5 gv琼脂：琼脂：15-20 gv水：水：1000 mLvpH：7.47.6马铃薯培养基（PDA）的制备用来培养真菌用来培养真菌v马铃薯：马铃薯：200 gv蔗糖（葡萄糖）蔗糖（葡萄糖）20 gv琼脂：琼脂：15-20 gv水：水：1000 mLvpH：自然自然马铃薯去皮，切成块煮沸马铃薯去皮，切成块煮沸30分钟，然后用纱布过滤；分钟，然后用纱布过滤；滤液中加入糖和琼脂，溶化后补足水至滤液中加入糖和琼脂，溶化后补足水至1000 mL

7、。高氏号培养基的制备用来培养放线菌用来培养放线菌v可溶性淀粉：可溶性淀粉：20 gvKNO3：1 gvNaCl：0.5 gvK2HPO43H2O：0.5 g vMgSO47H2O：0.5 g vFeSO47H2O：0.01 gv琼脂：琼脂：20 gv水：水：1000 mLvpH：7.27.4无氮培养基的制备用来培养固氮菌用来培养固氮菌v葡萄糖：葡萄糖：10 gvKH2PO4：0.2 g vMgSO47H2O：0.2 g vNaCl：0.2 gvCaSO42H2O：0.2 gvCaCO3：5 gv琼脂：琼脂：20 gv水：水：1000 mLvpH：7.07.2豆芽汁培养基的制备用来培养酵母菌用来

8、培养酵母菌v黄豆芽：黄豆芽：10 0 gv蔗糖（葡萄糖）：蔗糖（葡萄糖）：50 gv琼脂：琼脂：20 gv水：水：1000 mLvpH：自然自然称取新鲜黄豆芽称取新鲜黄豆芽100 g，放入烧杯中加水煮沸约，放入烧杯中加水煮沸约30 min，用纱布过滤。滤液中加入糖和琼脂，溶化后补足水至用纱布过滤。滤液中加入糖和琼脂，溶化后补足水至1000 mL，最后灭菌。，最后灭菌。麦氏（Meclary）培养基的制备用来培养酵母菌，利于酿酒酵母子囊孢子的形成用来培养酵母菌，利于酿酒酵母子囊孢子的形成v葡萄糖：葡萄糖：1 gvKCl：1.8 gv酵母浸膏：酵母浸膏：2.5 g v醋酸钠：醋酸钠：8.2 g v琼

9、脂：琼脂：20 gv水：水：1000 mLvpH：自然自然操作步骤操作步骤1.称量称量2.溶化溶化3.补足水分，调补足水分，调pH4.（过滤）（过滤）5.分装分装6.加塞加塞7.包扎包扎8.灭菌灭菌9.搁置斜面搁置斜面10.无菌检查无菌检查v称量药品时，严防药品混杂。称完一种称量药品时，严防药品混杂。称完一种药品后需要将牛角匙洗净、擦干，再称药品后需要将牛角匙洗净、擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。取另一药品。瓶盖也不要盖错。v药品不要弄错。如：药品不要弄错。如：K2HPO4和和KH2PO4、水合形式和无水形式的化合物要注意分水合形式和无水形式的化合物要注意分辨。辨。v培养基中多种无机盐可

10、能相互作用而产生沉淀。培养基中多种无机盐可能相互作用而产生沉淀。因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序顺序依次溶解依次溶解各成分，甚至有时还需要将二种各成分，甚至有时还需要将二种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。v对于微量成分，可先配制成高浓度的储备液，对于微量成分，可先配制成高浓度的储备液，按比例换算后再加入。按比例换算后再加入。v琼脂溶化过程中，要琼脂溶化过程中，要控制火力并不断搅拌控制火力并不断搅拌，以，以免沸腾溢出或琼脂糊底烧焦。免沸腾溢出或琼脂糊底烧焦。v不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培

11、养不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基。基。v调调pH值以前，先补足水分。值以前，先补足水分。vpH值不要调过头，以免回调影响个离值不要调过头，以免回调影响个离子浓度。子浓度。v固体分装：不超过试固体分装：不超过试管高度的管高度的1/5；不超；不超过三角烧瓶容积的一过三角烧瓶容积的一半为宜。半为宜。v分装过程中，注意不分装过程中，注意不要使培养基沾在管要使培养基沾在管（瓶）口上以免污染（瓶）口上以免污染棉塞而引起污染。棉塞而引起污染。v配好培养基后要贴上标签，写清培养基配好培养基后要贴上标签，写清培养基类型、组别、配制时间。类型、组别、配制时间。培养基灭菌 在微生物实验中，需要进行纯培养

12、，不能有任何在微生物实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。都要进行严格的消毒和灭菌。v配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物物v微生物生长繁殖：微生物生长繁殖：消耗养分消耗养分 改变培养的酸碱度改变培养的酸碱度 产生毒素或者抑制物产生毒素或者抑制物消毒与灭菌v消毒消毒是一般指采用物理、化学和生物的方法是一般指采用物理、化学和生物的方法消除物体的表面病原菌和有害微生物营养体消除物体的表面病原菌和有害微生物营养体的过程。的过程。v灭菌灭菌则是指采

13、用物理、化学和生物的方法杀则是指采用物理、化学和生物的方法杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子的过程。灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子的过程。消毒与灭菌方法v加热灭菌加热灭菌干热灭菌干热灭菌湿热灭菌湿热灭菌v过滤除菌过滤除菌v辐射灭菌辐射灭菌放射线辐照灭菌放射线辐照灭菌紫外线灭菌紫外线灭菌干热灭菌v干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的凝固变性而达到灭菌的目的.v干热灭菌有火焰灼烧灭菌和热空气灭菌两种。干热灭菌有火焰灼烧灭菌和热空气灭菌两种。v细胞内蛋白质的凝固性与其含水量有关。在菌细胞内蛋白质的凝固性与其含水量有关。在菌体受热时

14、，当环境和细胞内含水量越大，则蛋体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之凝固缓慢。白蛋凝固就越快，反之凝固缓慢。v因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（高（160160170170），时间要长（），时间要长（1 12h2h），但），但干热灭菌温度不能超过干热灭菌温度不能超过180180，否则，包器皿，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧燃烧。高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌v高高压压蒸蒸气气灭灭菌菌是是将将待待灭灭菌菌的的物物品品放放在在一一个个密密闭闭的的灭灭菌菌锅锅内内，通通过过加加热热，使使灭灭

15、菌菌锅锅隔隔套套间间的的水水沸沸腾腾而而产产生生蒸蒸汽汽。待待水水蒸蒸气气急急剧剧将将锅锅内内冷冷空空气气从从排排气气阀阀中中趋趋尽尽，关关闭闭排排气气阀阀，继继续续加加热热。由由于于水水蒸蒸气气无无法法排排出出，增增加加了了灭灭菌菌锅锅内内的的压压力力，从从而而使使沸沸点点增增高高，得得到到高高于于100的的温温度度。导导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。v一一般般培培养养基基在在0.1 MPa下下，121维维持持1530 min可可达达到到彻彻底底灭灭菌菌的的目目的的。灭灭菌菌的的温温度度及及维维持持的的时时间间随随灭灭菌菌物物品品的性质和容量等具体情

16、况而有所改变。的性质和容量等具体情况而有所改变。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：其原因有三：一一是是湿湿热热中中细细菌菌菌菌体体吸吸收收水水分分，蛋蛋白白质质较较易易凝凝固固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；二是湿热的穿透力比干热大；二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸气有潜热存在。三是湿热的蒸气有潜热存在。1 g水在水在100时，由气态变为液态时可放出时，由气态变为液态时可放出2.26 kJ(千焦千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌

17、效力。物体的温度，从而增加灭菌效力。在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。低于饱和蒸气的温度。当含盐类的液体和含盐的琼脂中大量的盐类泼当含盐类的液体和含盐的琼脂中大量的盐类泼洒在工作腔体，要立即换水，冲洗腔体，仔细洒在工作腔体，要立即换水，冲洗腔体，仔细擦干锅盖垫圈上的水滴。否则它们会带来腐蚀擦干

18、锅盖垫圈上的水滴。否则它们会带来腐蚀和变质。和变质。要检查压力表上的指数为要检查压力表上的指数为“0 Mpa”“0 Mpa”后才能打后才能打开锅盖。开锅盖。外来物质（金属、液体）不能堵塞通风孔，否外来物质（金属、液体）不能堵塞通风孔，否则会引起装置故障、起火、短路。则会引起装置故障、起火、短路。过滤除菌过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同中细菌的方法。根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。的滤器和滤板材料。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，各种物质

19、的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。滤除菌。紫外线灭菌l紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200300 nm的紫外线都有杀菌能力，其中以的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力的杀菌力最强。最强。l在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。时间的乘积成正比。l紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和体的形成和DNA链的交联，从而抑制了链的交联，从而抑制了DNA

20、的复的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成O，再使，再使O2氧化生成臭氧（氧化生成臭氧（O3）或使水（）或使水（H2O）氧）氧化生成过氧化氢（化生成过氧化氢（H2O2）。）。O3和和H2O2均有杀菌作用。均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室，紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。为宜。为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯前，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯前，可在无菌室内可在无菌室内

21、(或接种箱内或接种箱内)喷洒喷洒3%5%石炭石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面、凳子可用无菌室内的桌面、凳子可用2%3%的来苏尔的来苏尔擦洗，然后再开紫外灯照射，即可增强杀菌效擦洗，然后再开紫外灯照射，即可增强杀菌效果，达到果，达到灭菌灭菌目的。目的。v灭菌的试管培养基冷至灭菌的试管培养基冷至50 左右再搁置，左右再搁置，以防斜面上冷凝水太多。以防斜面上冷凝水太多。v斜面长度不超过试管总长的一半。斜面长度不超过试管总长的一半。v将灭菌的培养基放入将灭菌的培养基

22、放入37的温室中培的温室中培养养2448小时，以检查灭菌是否彻底。小时，以检查灭菌是否彻底。实验任务 v每组配制每组配制1400 mLPDA培养基（培养基（P242）v趁趁热热将将培培养养基基分分装装至至12把把试试管管（127支支，不不超超过过管管高高1/5）；剩剩余余的的培培养养基基装装入入锥锥形形瓶瓶中中（每每瓶约瓶约100 mL）v对对试试管管、锥锥形形瓶瓶进进行行包包装装，贴贴上上标标签签（培培养养基基名称、配制时间、组别）名称、配制时间、组别）v高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌v取出，搁置斜面，无菌检查取出，搁置斜面，无菌检查作业 v实验报告实验报告v思考题思考题1：培养基配置好后，为什么必须立即：培养基配置好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是否为无菌灭菌？如何检查灭菌后的培养基是否为无菌的？的？v思考题思考题2：如果需要配制一种含有某抗生素的：如果需要配制一种含有某抗生素的固体培养基，其中抗生素的终质量浓度（或固体培养基，其中抗生素的终质量浓度（或工作浓度）为工作浓度）为50ug/mL，你将如何操作？（提，你将如何操作？（提示：抗生素在高温下易失效）示：抗生素在高温下易失效）v下一次实验：细菌的简单染色下一次实验：细菌的简单染色