DB62∕T 4575-2022 实验用牛微生物学等级及监测(甘肃省).pdf

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1、ICS 07.100.01 CCS B 41 0062 甘肃省由巳ETA 万标准D862/T 4575-2022 实验用牛微生物学等级及监测Microbiological standards and monitoring of experimental cattle 2022一 08-16发布2022一09-16实施甘肃省市场监督管理局发布0862/T 4575-2022 目;欠前言.II I 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.2 4 微生物学等级分类.2 5 检测要求.2 6 检测程序.3 7 检测方法.4 8 检测规则.6 9 结果判定.6 10 判定结论.7 附录A(规范

2、性)牛副流感病毒3型RT-PCR诊断方法.8 附录B(规范性)牛英膜A、B型多杀性巴氏杆菌多重PCR诊断方法.10 附录C(规范性)牛呼吸道合胞体病毒套式RT-PCR检测方法.12 附录D(规范性)牛轮状病毒多重半套式RT-PCR检测方法.14 I 0862/T 4575-2022 实验用牛微生物学等级及监测1 范围本文件主要规定了实验用牛微生物学等级及监测的术语定义、等级分类、检测要求、检测程序、检测方法、检测规则和结果判定等。本文件适用于实验用牛微生物学等级及监测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条争气中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适号

3、子本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 1492646 实验动物钩螺旋体检测方法GB/T 18089 蓝舌病病毒分离、鉴定及血清中和抗体检测技术GB/T 18637 牛于毒性腹泻/粘膜病诊断技术GB/T 18645 动物结核病诊断技术GB/T 18646;动物布鲁氏菌病诊断技术GB/T 18653 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法GB/T 18935 口蹄t疫诊断技术GB 19489 实验室在物安全通用要求GB/T 22915 口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法GB/T 27528 口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法GB/T 27639 结核清病原菌

4、实时荧光PCR检测方法GB/T 27981 牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法GB/T 39602 牛结节性皮肤病诊断技术NY/T 539 副结核病诊断技术NY/T 541 兽医诊断样品采集、保主与运输技术规范NY/T 561 动物炭瘟诊断技术NY/T 562 动物衣原体病诊断技术NY/T 574 地方流行性牛白血病琼脂凝胶免疫扩散试验方法NY/T 575 牛传染性鼻气管炎诊断技术NY/T 3234 牛支原体PCR检测方法SN/T 1086 牛生殖道弯曲杆菌病检疫技术规范SN/T 1087 Q热检疫技术规范SN/T 1088 布氏杆菌检疫技术规范SN/T 1129 牛病毒性腹泻/黠膜病

5、检疫技术规范。1 0862/T 4575-2022 SN/T 1315 牛地方流行性白血病检疫技术规范SN/T 1693 牛流行性热微量血清中和试验操作规程SN/T 3392 国境口岸莱姆病螺旋体检验规程SN/T 3741.1 国境口岸鼠类携带病原体检测方法第l部分致病性钩端螺旋体PCR检测方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 实验用牛experimental cattle 经人工饲育，对其携带的病原微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，用于科学研究、教学、生产和检定以及其它科学实验的牛。3.2 普通级牛conventional cattle 不携带所规定的人兽共患

6、病病原和牛烈性传染病病原的实验用牛，简称普通牛。3.3 无特定病原体级牛specific pathogen丘eecattle 除普通牛应排除的病原外，不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原的实验用牛，简称无特定病原体牛。4微生物学等级分类按微生物学与寄生虫学等级分类，实验用牛分为普通级、无特定病原体级。5 检测要求5.1 临床观察实验用牛应外观健康，无异常。5.2 微生物检测项目参考GB14922.2的规定，确定各等级实验用牛微生物检测项目应符合表L表l实验用牛微生物检测项目等级病原愤生物普口跻疫病毒Foi-and-rnou也diseasevirus 通级布鲁氏菌Brucella

7、2 检测要求A A 0862/T 4575-2022 表l实验用牛微生物检测项目(续)等级病原微生物检测要求炭殖芽胞杆菌Bacillusanthracis O 炭殖芽胞杆菌Bacillusanthracis O 普钩端螺旋体Lep扣再pwaO 通级f自氏疏螺旋体Borrelia burgdorferi F-、王O 贝氏柯克斯体Co.iellaburntii 一-、-、O,.飞、植树牛结节性皮肤病病毒O 牛病毒性服泻i粘膜病毒Bovine viral diarrhea viru圳uc叫diseastvirus 牛轮状病毒Bovine rot肝1m的慧-，、rJ结核分枝杆菌今cobacterium

8、avium Sub乓p.paratuberlosis 立凸飞 胎儿弯曲吁菌C础Pylobacter如JS飞v、无牛rJ流感l病毒3型Bovine parainfluenza virus type 3 1古J 特J 01 定牛呼吸道合胞体病毒Bovine respiratorsyncytial viru凶 病牛传染性鼻气管炎病毒Infect:ious bovine rhinotracheit:is virus l1 原牛臼血病病毒Bovine leukemia virus 体级牛英膜A、B型$:杀性巴氏杆菌Bovinepasteu陀llamultocida capsulat秒peA and ty

9、pe 牛支原体Mycopl旧mabovis 衣原体Chlamydia,牛流行性出血热病毒Bovine epherneral fever virus t吨，O 蓝舌病病毒Bluetol)gue virus O 注1，.应检测项目，普通法可免疫，无特定抗原抗体实验用牛和无特定病原体级不可免度。注2，.应检测项目。注3，0必要时检测项目。、?/r、万V5.3 检测项目分类是与,5.3.1 必须检测项目在进行实验用牛质量评价时;-&须检测的项目。普通级可免疫接种疫苗，无特定病原体级不能免疫接种疫苗。5.3.2 必要时检测项目:申请生产许可证、从国内外引进实验用牛、疑有该病原体感染和实验特殊需要时应检测

10、的项目。普通牛规定的必须检测和必要时检测项目，在无特定病原体牛中为必须检测项目。6 检测l程序检测程序见图L3 0862/T 4575-2022 采集耳后、背部毛发或皮屑采集鼻拭子、咽喉拭子、脏拭子(或新鲜粪便)图l检测程序7 检测方法检测方法应符合表20表2实验用牛微生物检测方法检测方法横生物检测标准适用范围GB厅18935抗体检测a、抗原检测(食道喉部分泌物)b、核酸检测(组织)口跻疫病毒GB厅22915核酸检测(血样、咽喉拭子)GB厅27528核酸检测(水泡液)GBrr 18646 抗体检测(血清或奶样)布鲁氏菌SN厅1088核酸检测(阴道拭子、奶样、组织)GBrr 18645 皮内变态

11、反应试验、抗原检测(血样、奶样、粪便或病料)牛分枝杆菌GB厅27639核酸检测(血样、奶样、粪便或病料)炭殖芽胞杆菌NY厅561抗原检测(血液、病变部位的水肿液或渗出液)核酸检测(血液、病变部位的水月中液或渗出液)4 0862/T 4575-2022 表2实验用牛微生物检测l方法(续)检测方法横生物检测标准适用范围GBrr 14926.46 抗体检测钩端螺旋体SNrr 3741.1 抗原检测(血液、尿液、组织)伯氏正在螺旋体SNrr 3392 抗体检测、抗原检测(血样或蝉c)、核酸检测(血样或蝉)抗体检测贝氏柯克斯体SNrr 1087/抗原检FJ!rCJfJ!升川、奶样、粪便、动物组织或流产胎

12、儿)抗体检测(血清)牛结节性皮肤病病毒GB厅39602核酸、检测(皮肤组织、抗凝血、口鼻分泌物、精液、奶祥、细胞培养液等)牛病毒性腹泻粘膜病GB厅18637抗体检测、抗原检测(血样、鼻拭子、精液或动物组织)病毒SNrr 1129 核酸检测(血祥、鼻拭子、精液或动、物组织。GB厅27637核酸、检测(血祥、奶样、粪便或病料)iirJ结核分枝杆菌抗体检测(血清或奶样)、抗原检测(粪便主知料)、皮内变态反应Nyrr 539 GB厅18653胎儿弯曲杆菌抗原检测阴道粘液、包皮液、精液)SNrr 1086 核酸、检测(阴道粘液、包皮液、精液、ifrt产胎儿或胎盘)牛rJ:lm感病毒3型附录A核酸、检测(

13、鼻拭子、肺组织)牛英膜A、B型$:杀性附录B巴氏杆菌核酸检测飞鼻拭子、肺组织)101 牛呼吸道合胞体痛毒附录C核酸、检测(鼻拭子、肺组织)，牛轮状病毒附录D核酸、检测(胚拭子、新鲜粪便)牛传染性鼻气管炎病GB厅27981核酸、检测(血祥、结膜/黠膜拭子、精液及动物组织)毒Nyrr 575 抗体检测、抗原检测(鼻拭子、阴道拭子、精液及组织)Nyrr 574 抗体检测牛臼血病病毒SNrr 1315 抗原检测(血样丁t SNr.r 1315 核酸、检测(血样、动物组织)F 牛支原体Nyrr 3234 核酸检测飞肺组织)衣原体Nyrr 562 抗体检测、抗原检测、核酸、检测(lJ产胎儿或病料)NT厅5

14、43抗体检测牛流行性出血热病毒SNrr 1693 抗体检测蓝舌病病毒抗体检测、抗原检测(血样、精液、动物组织或库燎d)GB厅18089核酸、检测(血祥、精液、动物组织或库燎)a如无注明，用于抗体检测的样本均为血清。b抗原检测、核酸检测后()中注明的是可用于检测的样本来源。c牌是伯氏正在螺旋体的传播媒介。d库蝶是蓝舌病病毒的传播媒介。5 0862/T 4575-2022 8 检测规则8.1 检测频率普通牛群每六个月至少检测一次，无特定病原体牛群每三个月至少检测一次。8.2 抽牛羊8.2.1 方式宜选择36月龄实验用牛(也可根据需求)，随机抽样。8.2.2 数量抽样数量见表30表3抽样数量群体大小

15、小于20头21 100头101 500头大于500头8.2.3 方法8.2.3.1 可按病毒、细菌、真菌检测要求联合采样。8.2.3.2 样品采集的方法按照NY/T541 进行。8.3 样本要求8.3.1 样本采集、保存与运输应按照NY/T541 进行。抽样数量不少于5头不少于10头不少于20头不少于30头8.3.2 样本要有明显标识，写明检品名称、品系、等级、数量及检测项目等内容。8.3.3 涉及疑似人畜共患病和重大动物疫病的病料，按照中华人民共和国动物防疫法和GB19489 生物安全规定执行。9 结果判定9.1 抗体检查免疫项目，群体免疫合格率二三70%，判为合格。非免疫项目，lIl 青样

16、品全部阴性判为合格。9.2 病原和核酸检现IJ未见阳性结果为合格。9.3 检测结果存疑需要进一步确诊时，应结合l自床症状和前期检测结果，采集动物组织或特定样本，按照表2规定的方法进一步检测。6 0862/T 4575-2022 10 判定结论所有项目的检测结果均合格，判定为符合相应的动物等级标准。否则，判定为不符合相应的动物等级标准。7 0862/T 4575-2022 A.1 检测原理附录A(规范性)牛副流感病毒3型RT-PCR诊断方法流行病学调查显示我国牛副流感病毒3型lIl青阳性率达77.96%(2960/3797)，我国对牛副流感病毒3型未进行免疫接种，高血清阳性率说明我国牛群中感染非

17、常普遍。运输、气候变化、混群等应激因素可导致牛副流感病毒3型的感染，作为实验用牛经历运输等应激因素是必然的。牛感染牛副流感病毒3型后不但引起牛呼吸道疾病，还可引起免疫抑制，感染后不宜作为实验用牛。本方法采用RT-PCR扩增牛副流感病毒3型高度保守性M基因，实现牛副流感病毒3型的检测，达到筛选牛副流感病毒3型阴性实验用牛的目的。A.2 检测l样本牛鼻腔深部拭子。A.3 检测l引物BPIV3 MF 5 CCG CAA TAT ACA CAT TTC CAG 3 BPIV3 h任主5 GTAATATCTGAACTCACCGGG3 A.4 检测l方法鼻拭子加入定量的PBS，游涡震荡后，3000叩m离心

18、5min，取上清液。按照AXYGEN病毒RNA小量提取试剂盒说明书方法提取基因组RNAo以提取的基因组RNA为模板，将其反转录为cDNAo取7.5l基因组RNA，加入l1BPIV3 MF(4mollL)、以及61dNTP(2.5 mmol止),65C保温5min后迅速在冰浴上冷却2min以上。离心数秒使混合物集子管底。在上述混合物中加入如下物质，415xM-MLV Buff町、l1M-ML VRTase(200 UI1)、0.51RNase inhit、itor(40 UI1)_ 56C作用60min，75C保温15 min，然后冰浴冷却后作为PCR反应模板备用。PCR反应体系为1.01Ex

19、Taq(5 UI1)、5110 xExTaq Buff町、51dNTP(2.5 mmollL)、2l反转录产物、上下游引物(10mol/1)各l1，加水至5010反应条件为95C3min;94C 45s,60SC 45s,nc lmin,30个循环nc10 mino预计产物大小为998bpo同时设牛副流感病毒3型作为阳性对照和水作为阴性对照。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。A.5 结果判定阴阳性对照成立的条件下，样本能扩增出特异性大小约998bp的目的条带判为阳性，否则判为阴性。A.6 检测l序列CCGCAATATACACATTTCCAGAATCTTCATTTTCTGAAAGTGGCA

20、ATATAGAGCCACTACCA CTAAAGGTCAACGAACAAAGGAAGGCAATTCCTCATATCAGAGTTGTTAAAATAGGTGACCCAC CCAAACATGGTTCAAGATATCTGATGTATTTCTACTGGGTTTTTTGAGATGGAGCGGTCAAAG GACAGATATGGGAGTGTCAGTGATCTGGATGATGATCCAAGTATAAAGTCTGTGGTCTGGATC TCTACCACTTGGGCTAGCAAAATACACTGGGAATGATCAGGAACTCCTACAAGCCGCAATTAAGT TAGATATAGAAGTGAGAAGAACT

21、GTCAAAGCCACGGAGATGATAGTCTACACCGTGCAGAACAT TAAACCTGAACTGTACCCATGGTCAAGCAGATTAAGAAAAGGGATGTTATTTGACGCCAACAAA GTTGCGCTTGCACCCCAGTGTCTTCCACTCGATAGAGGGATAAAATTCAGAGTAATATTTGTGAA 8 0862/T 4575-2022 TTGTACAGCAATTGGATCAATAACACTCTTTAAAATTCCCAAATCTATGGCTTGCTATCATTGCC AAACACCATATCAATAAACTTACAGGTACACATAAAAACAGG

22、AATCCAAACTGACTCTAAGGGG GTTGTCCAGATCTTAGATGAGAAAGGTGAGAAATCGTTAAACTTTATGGTCCATCTTGGATTAAT TAAACGGAAGGTAGGTCGAATGTATTCAGTAGAGTATTGCAAACAAAAGATTGAGAAGATGAGA CTACTATTTTCATTGGGATTAGTTGGAGGAATTAGCTTTCATGTCAATGCAACTGGGTCTATTTCG AAGACGTTGGCGAGTCAACTAGCGTTCAAAAGGGAAATCTGTTATCCTCTCATGGATTTAAACCC ACACCTAAATCTG

23、GTTATATGGGCATCATCAGTGAAATCACAAGAGTGGATGCAATCCTTCAAC CTTCATTGCCCGGTGAGTTCAGATATTAC_ o 9 0862/T 4575-2022 附录B(规范性)牛英膜A、B型多杀性巴氏杆菌多重PCR诊断方法8.1 检测原理牛多杀性巴氏杆菌为典型的条件致病菌，自然条件下常寄生子牛上呼吸道，在受到应激刺激后可引起牛体发病。实验用牛不可避免地受到运输等应急因素的刺激而增加发病风险，从而对其它实验造成不利影响，所以实验用牛排除该病很有必要。我国主要流行英膜A、B两种血清型的多杀性巴氏杆菌。本方法通过对采集的牛鼻腔拭子进行多重PCR的检测，

24、采用特异性引物分别扩增多杀性巴氏杆菌种特异性基因kmtl，以及A、B英膜lU清型特异性基因hyaD-hyaC与bcbD，实现多杀性巴氏杆菌检测并分型，达到J筛选牛英膜A、B型多杀性巴氏杆菌阴性实验用牛的目的。8.2 检测l样本牛鼻腔深部拭子，置于脑心浸液培养基中(含万古霉素10g!mL)培养后，分离、鉴别收获细菌。8.3 检测l引物检测引物包括:a)多杀性巴氏杆菌种特异性基因kmtl(460bp)上下游引物序列1)kmtl-U,5 ATC CGC TAT TTA CCC AGT GG 3 2)kmtl-L,5 GCTGTAAACGAACTCGCCAC3 b)英膜血清A型特异性基因hyaD-hy

25、aCcl 044bp)上下游引物序列:1)CAPA-U5 TGCCAAAATCGCAGTCAGTATTTTTTATCC3 2)CAPA-L 5 TGC CAT CAT TGT CAG TGA TTT ATT TTG TAA G 3 c)英膜血清B型特异性基因bcbD(7bp)上下游引物序列:1)CAPB-U 5 GCGATA TCAATCTGC TTAAGA TAA T3 2)CAPB-L 5 GAG GAT TCT ATC TTG ACT GAA GTA 3 8.4 检测l方法按照AXYGEN病毒DNA小量提取试剂盒说明书方法提取培养物DNAo配制下列PCR反应体系，DNA模板-;GATTT

26、CTAGTTTTACCAAATAAAGTTCAACTGTGTTTGAGAAOACTTTTTTAAAATGAGTAGTAT TTCCTCTGGTGGAGCTTGGAAAATGAGGAGGGGGCAAAATAA:GCTACATTAACATTAAAAGTC AGATCTCTAGGCTCAAACTTCATCATTTT、v，TCCTTCCAGCTACCCCACGGTAAACCAGC卫武气GAGTC士GTTATAACGAGTAACGCTAATCAAATCACTACGTTGAAACTGTTCAAGTAACGCATCCACACTCAGTTGCTTCTCTGCAATGAGTTTTTCAATATTTG TTTGT

27、GAGAAAATAATTTATGCATTATTTACGCCTTTACTATTATATTTTGTGTCAACAGAGAG TTAACAGCCTCCAAAATCTCATCTAACTGGTGCATATCTGCTTTGAGTAAACGATCGTTTTCAATG TGACTCATCGGACTGTCTTGCTCGGTCAGTGCTAAAATTAAAGAAGCGGATCCTAAGTAATCGCT CAATTTGATGGTAAGTAAGGATTATTCATTTTAGTTCTTTGGTTTGCGTGTCCATCACAATCAG ACCATCAAATTGATCCGCTAATGCTAGAAAATCAAAGTAAGC

28、TACATATTTTTGGATAACAATCT GTGCTCTAATTTCCTCCGGTACTTCAGTCAAGATAGAATCCTCo 11 0862/1 4575-2022 c.1 检测原理附录C(规范性)牛呼吸道合胞体病毒套式RT-PCR检测方法自28年以来，我国牛群爆发严重的呼吸道疾病，表现为牛呼吸道疾病综合征，抗生素治疗效果不明显，发病率高，死亡率高，给养牛业带来极大的经济损失。病原流行病学调查显示存在多病原感染，其中主要原发病因为病毒性病原，包括牛呼吸道合胞体病毒等。本方法采用RT-PCR方法，扩增呼吸道合胞体病毒高度保守区域核酸，实现牛呼吸道合胞体病毒的检测，达到筛选牛呼吸道合胞

29、体病毒病阴性实验用牛的目的。c.2 检测样本牛鼻腔深部拭子c.3 检现IJ引物检)j!1日l物见表C10表c.1检测引物引物名称引物序列1U25 5 ACGCGAAAAAATGCGTATAACAAAC 3 8749U25 5 AAl寸CGTAGAGCTATAGAAATAAGT 3 10262L25 5 TCCTACCTACACTAAGTTCTCTTTC 3 8785U23 5 ATATGCTATATTGAACAAATTGG 3 10215L23 5 GTTTGGATTATTAAGATATTCCT 3 C.4 检测l方法扩增产物片段(bp)1538 1453 牛鼻腔深部拭子或肺组织研磨后加入定量

30、的PBS，说涡震荡后，3000叩m离心5min，取上清液。按照AXYGEN病毒RNA小量提取试剂盒说明书方法提取基因组RNAo用1U25引物进行反转录，反应条件为25-CIOmin,42-C 60min;在用8749U25和10262L25引物进行第一轮PCR扩增，然后再以第一轮PCR产物为模板，用8785U23和10215L23引物进行第二轮PCR扩增。同时设牛呼吸道合胞体病毒作为阳性对照和水作为阴性对照，反应条件为94-C预变性4min，然后94-C45s、55-C45 s、n-c1.5 min共30个循环，最后n-c延伸10min_ PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。C.5 结果判

31、定在阴阳对照成立的条件下，第一轮或第二轮PCR扩增出现1500bp左右的特异性目的条带，则判为牛呼吸道合胞体病毒阳性。C.6 检现IJ序列AATTCGTAGAGCTATAGAAATAAGTGATGTCAAAGTATATGCTATATTGAACAAATTGGGTT TAAAAGAAAAGGGAAAAGTTGATAGATGTGATGACACTAACACAACGCTATCTAACATAGTAAG AGATAATATACTCTCAGTCATAAGTGACAATACTCCCAGTACTAAAAAACCAAATAATTCATCGT GTAAACCAGATCAGCCAATTAAAACAACAATTTTATG

32、CAAGCTTTAAGTTCGATGAGTCATCCC 12 0862/T 4575-2022 CCTACATGGTTAATACATTGGTTTAATTATACACAAAATTAAATGACATCTTGACCCAATACAG AACAAATGAAGCAAGAAATCATGGTTACATACTTATAGATACTAGAACCTTGGGTGAATTCCAAT TTATATTAAATCAATATGGTTGCATTGTATATCATAAGAAATTAAAGAAAATTACAATCACCACA TATAATCAATTTCTAACATGGAAAGACATTAGCCTCAGTAGATTAAATGTTTGTA

33、TGATCACCTG GATAAGCAATTGTTTAAATACCTTGAATAAAAGCCTTGGATTGAGATGTGAGTTTAACAATGTCA CTCTATCTCAATTATTCCTTCATGGGGATTGTATATTGAAATTATTTCATAATGAAGGTTACTATA TTATAAAAGAAGTTGAAGGTTTATAATGTCATAATTTTGAACCTAACGGAAGAAGATCAATTC AGAAAAAGATTCTTCAACAGTATGCTAAATAATATTACAGATGCTGCAGCAAGAGCTCAACAAG ATTTATTATCAAGAGCCCGCCATACTA

34、TATTAGACAAAACAATATCAGATAACATATTAAATGGT:AAATGGTTAATTTTATTAGGTAAGTTTG-TTAAATTGATTAAATTAGCTGGTGCTAATAATCTTAAT 鸣、AACCTAAGTGAACTCTACTTCTCTTTAGAATATGGACATCSArGTAGATGAACGGCAAGC AATGGATGCTGTGAGATTAAACTGTAATGAAACTAAATTTTA0TTATTGAGTAGCCTTAGCATGT TAAGAGGTGCATCATTATAGAATTATAAAGGGATTTGTAAACACATATAATAGGTGGCCTACC

35、TTAAGGAATGCTATAGTTTTACCCTTAAGATGGATAAATTACTACAAAGrCAATACTTACCCATC ATTATTAGAA甘AACAGAAGCTGA工GATTATATTTCTGGACTGAG哥TTTATAGAGAATTCCATCTACCGAAAAAAGTAGA甘TAGAAGTCATAATAAATGATAAAGCATTCACCTCCCAAAAACCTTATCTGGACCAGTTTTCCCAAAAACTATATGCCATCACACATACAGATTTACATAGAACATG AAAGACTAAAGT牛CTGAGAGTGATAGATCTAGAAGGGTTCTGGAATA

36、TTAuTTAAGGAATAATAGATTCAGTGAGAGTGACCTATATAACTGTATAGTAAACCAGGAATATCTTAATAATCCAAACCA TGTAATATCATTAACAGGAAAAGAAAGAGAACTTAGTGTAGGTAGGAo 13 0862/T 4575-2022 o.1 检测原理附录D(规范性)牛轮状病毒多重半套式RT-PCR检现IJ方法牛轮状病毒是引起棋牛腹泻的最主要病原，发病率可高达50%-100%，7日龄以内粮牛最为易感，典型症状为严重腹泻，粪便呈水样，色呈淡黄色，有时混有钻液和血液，候牛脱水，眼凹陷，四肢无力，消瘦，卧地，感染后不适合作为实验用牛。

37、本方法以牛轮状病毒的核酸为检测靶标，采用RT-PCR方法对样品中的核酸进行数量级扩增，最终在琼脂糖凝胶上形成肉眼可见核酸条带，从而实现对待检样品中目标病毒的检测。再在不同基因型高度变异区设计一条特异性引物，该引物仅对一个基因型反应，而不与其他基因型反应，结合条适合该病毒检测的通用引物，采用多重半套式RT-PCR，实现基因型的鉴定，达到筛选牛轮状病毒阴性实验用牛的目的。o.2 检测样本新鲜粪便或脏拭子o.3 检现IJ引物检)j!U5 物见表DL引物名称VP7-F 5 VP7-R 5 G5-2 5 G6-2 5 GIO-2 5 G8-2 5 G9-2 5 0.4 检测l方法表o.1检测引物引物序列

38、扩增产物片段(bp)GGCTTTAAAAGCGAGAATTTCC 3 1062 GGTCACATCATACAACTCTAAT 3 CATGTACTCGTTGTTACGTC3 780 CTAGTTCTTGTGTAGAATC 3 500 TTGAGCCGTTGCGACTTC3 715 CGGTTCCGGATTAGACAC3 273 TTATAAAGTCCATTGCAC 3 148 新鲜粪便或直肠拭子加入定量的PBS，游涡震荡后，3000叩m离心5min，取上清液。按照AXYGEN病毒RNA小量提取试剂盒说明书方法提取基因组RNAo用VP7-R引物进行反转录，反转录条件为25-C10 min,42-

39、C 60 min;再用VP7-F和VP7-R引物进行第一轮PCR_然后再以第一轮PCR产物为模板，用VP7-F与G5-R、G6-R、G8-R、G9-R和GIO-R多条引物进行多重半套式PCR，均设置牛轮状病毒作为阳性对照和水作为阴性对照，反应条件为94-C预变性4min，然后94-C45 s、55C45 s、n-c，1 min共30个循环，最后n-c延伸10mino PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。o.5 结果判定在阴阳对照成立的条件下。第一轮PCR扩增出1062bp的特异性目的条带，则判定牛轮状病毒阳性，但不能确定那个基因型。多重半套式PCR扩增出780bp特异性条带，则判定牛轮状病

40、毒G5型阳性5bp为G6型，715 bp为GIO型，273 bp为G8型，148 bp为G9型阳性。o.6 检现IJ序列14 0862/T 4575-2022 GGCTTTAAAAGCGAGAATTTCCGTTTGGCTAGCGGTTAGCTCCTTTTAATGTATGGTATGAA TATACCACAATTCTAATCTTCTTGACATCGATTACATTATTGAATTATATCTTAAAATCAATAACG AGAATGATGGACTATATAATTTACAGATTTCTGCTTATAGTAGTGATCTTGGCCACCATAATAAA TGCGCAAAACTATGGAGTAAATTT

41、GCCAATTACAGGTTCAATGGATACTGCGTATGCAGACTCTA CACAAAGTGAGCCATTTTTGACATCAACCCTTTGTTTGTATTATCCTGTTGAGGCATCAAACGAA ATAGCTGATACCGAATGGAAAGATACCTTATCACAATTGTTCTTGACAAAAGGATGGCCAACAG GATCAGTGTACCTTAAAGAATATGCTGATATAGCGGCCTTTTCAGTGGAACCACAGTTATACTGC GATTATAATTTAGTTTTAATGAAATATGAl丁rCTACACAAGAACTAGATATGTCTGAATTG

42、GCCGATCTTATATTGAACGAATGGCTGTGCAATCCAATGGACATAACGCTATATTATTATCAGCAGACTG ATGAAGCAAATAAATGGATATCAACGGGCTCTTCTTGCACGGTTAAAGTGTGTCCATTAAATACA 4、CAAACACTTGGTATTGGATGTCTAATAACTAATCCAGACACGT卫GAAACAGTTGCGACAATGGAGAAGTTAGTGATTACAGATGTTGTAGATGGTGTCAATCACAAATTACGTCACAACGGCAACGT GCACCATACGCAACLGTAAAAAGTTAGGACCAAGGGAGAACGTAZAGTCATACAGGTAGGCGG CGCAAATGTTTTAGACATCACAGCTGATCCAACAACTACACCACAGACAGAGAGAATGATGCGA ATAAATTGGAAAAAATGGTGGCAAGIG士LTIACACGGTAGTGGATTACGTOAATCAGATAATTCAGACAATGTCCAAAAGATCTAGATCGC甘AA甘CGTCGGCG甘CTACTATAGTGTAGGTGCATGTTAGATTAGAGTTGTATGATGTGACCo。1 15