分子克隆常用载体.ppt

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1、分子克隆常用载体 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体柯斯载体柯斯载体酵母细胞的克隆载体酵母细胞的克隆载体一、质粒载体理想的质粒载体必须具备的基本条件理想的质粒载体必须具备的基本条件1、具有复制起点、具有复制起点2、具有抗菌素抗性基因、具有抗菌素抗性基因3、具有若干限制酶单一识别位点、具有若干限制酶单一识别位点4、具有较小的分子量和较多的拷贝数、具有较小的分子量和较多的拷贝数重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体

2、pSC101质粒载体；质粒载体；ColE 1质粒载体；质粒载体；pBR322质粒载体；质粒载体；pUC质粒载体；质粒载体；T载体载体pUCm-T质粒图谱pUCm-T载体序列二、噬菌体载体二、噬菌体载体噬菌体的生命周期（1 1）溶菌生长周期噬菌体（烈性）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体）噬菌体）（2 2）溶源生长周期噬菌体（温和）溶源生长周期噬菌体（温和噬菌体）噬菌体）（1）烈性噬菌体的生活周期（2）温和噬菌体的生活周期裂解循环裂解循环溶源态溶源态重要的噬菌体载体一、一、噬菌体载体噬菌体载体（1）插入型载体：有单一酶切点,便于外源DNA插入 （2）替换型载体，具有成对的克隆位点，在这两个位点之间

3、DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代 噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。注意：注意：噬菌载体作为载体，其重组噬菌体噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNADNA大小只能：大小只能：36kb 51kb 36kb 51kb。体外包装：噬菌体载体+尾部蛋白+头部蛋白头部基因（琥珀突变型）尾部基因（琥珀突变型）转录复制蛋白质合成组装尾部所需要的组分“无头部”的提取物组装头部所需要的组分“无尾部”的提取物温育转录复制蛋白质合成体外包装的重组DNA比裸露的DNA导入受体细胞的效率高100-10000倍sup-细菌完整的噬菌体二、二、M13M13噬菌体载体噬菌体载体M1

4、3是丝状噬菌体，有长约6500个核苷酸的闭环DNA基因组。M13附着在大肠杆菌的F性菌毛上，所以它们只能感染雄性细菌。不过M13噬菌体DNA亦可通过转染作用导入雌性大肠杆菌细胞。1.M13噬菌体作为载体优越性（1）单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式的DNA简称RFDNA。（2）不论是RF DNA还是ss DNA，它们都能转染感受态的大肠杆菌寄主细胞。（3）单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的大小制约的，因此不存在包装限制问题。（4）可产生大量纯化的含外源片断的单链DNA分子。2.2.M13M13载体筛选方法载体筛选方法 插入插入-多肽多肽互补于受体细胞互补

5、于受体细胞半乳糖苷酶半乳糖苷酶 未插入未插入-多肽多肽互补于受体细胞互补于受体细胞半乳糖苷酶半乳糖苷酶 无色噬菌斑无色噬菌斑不分解不分解X-gal(IPTG)X-gal(IPTG)蓝色色噬菌斑蓝色色噬菌斑分解分解X-gal(IPTG)X-gal(IPTG)3.M13噬菌体载体的优点与其它载体相比，M13载体具有两个十分有用的优点：这类载体的基因组中有一条饰变的-半乳糖苷酶基因片段，其中插入了一段具有密集的多克隆位点的序列。M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的，可以有效地克隆双链DNA分子的每一条链。三、柯斯质粒载体三、柯斯质粒载体1.柯斯载体的组成柯斯载体的组成 由质粒和粘性末端“尾巴

6、”两部分组成。2 2、CosmidCosmid载体特点：载体特点：（1）具有噬菌体的特性（但因不含噬菌体的全部必需基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒）；（2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因）；（3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb,克隆极限可达45kb左右）；（4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。四、酵母细胞的克隆载体四、酵母细胞的克隆载体1 1、整合型载体（、整合型载体（YIPYIP）YIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构成的。这类载体在细菌中复制、扩增，进入酵母后可整合表达。YIP型载体的特点是转化率低(只有1-10转化子/微克DNA)，但转化子遗传性稳定，多用于遗传分析工作。2 2、复制型载体（、复制型载体（YRPYRP）YRP型载体是带有选择标记和复制子的酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。因为它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，所以能在两种细胞中存在和复制可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体称为穿梭载体，穿梭载体在基因工程中广泛使用。