第3章--载体.ppt

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1、第第3 3章章-载体载体第一节第一节 克隆载体克隆载体克隆载体：克隆载体：用于携带用于携带DNA片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体克隆载体必备条件：克隆载体必备条件：具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞；具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞；能在宿主细胞中自主复制，或整合到宿主基因组中随其一起复能在宿主细胞中自主复制，或整合到宿主基因组中随其一起复 制，制，实现外源基因的增殖；实现外源基因的增殖；具有由单一限制性内切酶识别位点组成的多克隆位点，可供外源基因具有由单一限制性内切酶识别位点组成的多克隆位点，可供外源基因 插入；插

2、入；具有合适的选择标记，用于含有重组载体的宿主细胞筛选。具有合适的选择标记，用于含有重组载体的宿主细胞筛选。用于基因克隆的载体的类型：用于基因克隆的载体的类型：质粒载体（质粒载体（plasmid vector）噬菌体载体（噬菌体载体（phage vector）考斯质粒（考斯质粒（cosmid vector）人造染色体载体（人造染色体载体（artificial chromosome）一、一、质粒载体质粒载体 质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；一类核酸分子；质粒常见于原核细菌和真菌中

3、；质粒常见于原核细菌和真菌中；绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是DNA型的；型的；绝大多数的天然绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA；质粒的分子范围：质粒的分子范围：1-200kb。野生型的质粒野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物；抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物；物质合成物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱。抗生素、

4、细菌毒素、有机碱。这些标记基因对这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。重组分子的筛选具有重要意义。(一一)质粒的基本性状质粒的基本性状1.复制复制质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统自主复制；复制系统自主复制；根据寄主每个细胞内分子数（拷贝数）多少，质粒可分为两大复制根据寄主每个细胞内分子数（拷贝数）多少，质粒可分为两大复制类型：类型：严谨型：严谨型：1-9拷贝拷贝松弛型：松弛型：10个以上个以上2.质粒的不相容性质粒的不相容性定义：指两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象。定义：指两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象。通常含有相同或相似复制子的质粒具有不相容性。

5、通常含有相同或相似复制子的质粒具有不相容性。3.质粒的转移性质粒的转移性接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如（接合作用），如F质粒等；质粒等；非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。用于构建基因克隆载体的质粒一般是非接合质粒。用于构建基因克隆载体的质粒一般是非接合质粒。（二）质粒载体的构建（二）质粒载体的构建天然质粒载体不易直接作为克隆载体，需要改造：天然质粒载体不易直接作为克隆载体，需要改造：（1）选择合适的复制起始位点，）选择合适的复制

6、起始位点，松散型质粒复制起始位点；松散型质粒复制起始位点；（2）加入合适的选择标记基因，）加入合适的选择标记基因，主要有主要有LacZ基因和抗生素抗性基因；基因和抗生素抗性基因；（3）增加或减少酶切位点，）增加或减少酶切位点，组装多个单一的限制酶切位点即多克隆位点组装多个单一的限制酶切位点即多克隆位点 （MCS);（4）缩短长度，）缩短长度，通常重组通常重组DNA分子越小，转化效率越高。分子越小，转化效率越高。（三）常用的质粒载体（三）常用的质粒载体1.pBR322质粒载体质粒载体2.pUC18和和pUC19质粒载体质粒载体3.TA载体载体二、二、噬菌体载体噬菌体载体 1 噬菌体的性质噬菌体的

7、性质 外壳蛋白外壳蛋白 噬菌体噬菌体 线性，全长线性，全长48502bp DNA 5端含端含12bp的黏性末端的黏性末端（一）（一）噬菌体载体噬菌体载体2 噬菌体的构建噬菌体的构建a.噬菌体能够包装原噬菌体能够包装原DNA长度的长度的75%105%的的DNA片段片段（36.451kb）b.有有20kb的区域对的区域对噬菌体生长非必需。噬菌体生长非必需。构建构建 噬菌体的依据：噬菌体的依据：噬菌体载体的改造：噬菌体载体的改造：切除非必需区段，保证构建的切除非必需区段，保证构建的噬菌体载不小于噬菌体载不小于36.4kb，插入或替换外源基因后不大于插入或替换外源基因后不大于51kb；在在DNA分子的

8、合适区域插入可供筛选的标记基因：分子的合适区域插入可供筛选的标记基因：cI基因失活、基因失活、Spi筛选、筛选、Lac蓝白斑筛选蓝白斑筛选建立重组建立重组 DNA分子的体外包装系统。分子的体外包装系统。体外合成噬菌体外壳蛋白体外合成噬菌体外壳蛋白D和和E。5.5kb2.6kb4.9kb该该 噬菌体载体的最大装载容量为噬菌体载体的最大装载容量为:4.9+5.5+2.6+(51-48.5)=15.5kb3 代表性代表性 噬菌体噬菌体(1)插入型载体插入型载体装载容量为：装载容量为：0-10.18kb(2)置换型置换型噬菌体载体噬菌体载体载体载体克隆外源克隆外源DNA片段范围为：片段范围为：9-23

9、kb（二）（二）M13 M13 噬菌体载体噬菌体载体1.M13噬菌体的增值噬菌体的增值M13噬菌体是单链丝状噬菌体；噬菌体是单链丝状噬菌体；长长6407bp，507bp基因间隔区，含复制起始位点，同时可用于改造；基因间隔区，含复制起始位点，同时可用于改造；M13 DNA在宿主细胞中以双链或单链形式存在，但释放到细胞外的在宿主细胞中以双链或单链形式存在，但释放到细胞外的M13 噬菌体颗粒以单链形式存在。噬菌体颗粒以单链形式存在。2.M13噬菌体载体噬菌体载体1)插入选择标记基因；插入选择标记基因；2)组装合适的多克隆位点。组装合适的多克隆位点。三、三、噬菌体噬菌体-质粒杂合载体质粒杂合载体（一）

10、（一）黏粒载体黏粒载体噬菌体载体：承载容量大，但本身不能包装和增殖噬菌体载体：承载容量大，但本身不能包装和增殖质粒载体：易转化易复制，但承载外源质粒载体：易转化易复制，但承载外源DNA片段的容量小片段的容量小 cosmid可以进行有效包装和转导受体细胞，但由于不含可以进行有效包装和转导受体细胞，但由于不含有有噬菌体溶菌和溶原生噬菌体溶菌和溶原生长长途径，故不会途径，故不会产产生子代噬菌体。生子代噬菌体。DNA两端两端约约280bp序列包装相关序列序列包装相关序列Cosmid载体载体 包装范围为包装范围为36.451kb 质粒质粒DNA(E.Coli-ori，MCS，筛选标记等），筛选标记等）c

11、osmid（6.5kb）载体的装载容量：）载体的装载容量：29.944.5kb（二）（二）噬菌粒载体噬菌粒载体噬菌体噬菌体DNA间隔区（含间隔区（含M13 ori，颗粒形态发生所需的全部序列）；，颗粒形态发生所需的全部序列）；质粒所含的质粒所含的ori，筛选标记，多克隆位点，筛选标记，多克隆位点四、四、人工染色体及其应用人工染色体及其应用 定义定义：利用染色体的复制元件来驱动外源：利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体片段复制的载体 称为人工染色体。称为人工染色体。优点：优点：装载容量大。装载容量大。缺点：缺点：拷贝数少，制备困难拷贝数少，制备困难酵母人工染色体（酵母人工染色体（y

12、east artifical chromosome，YAC)细菌人工染色体（细菌人工染色体（bacterial artifical chromosome，BAC）常用的人工染色体：常用的人工染色体：（一）（一）酵母人工染色体酵母人工染色体1 酵母人工染色体的复制元件和标记基因酵母人工染色体的复制元件和标记基因酵母染色体酵母染色体DNA端粒端粒DNA复制起始点复制起始点着丝粒着丝粒选择标记选择标记2 YAC载体的应用载体的应用主要用于基因组文库的构建，容量为：主要用于基因组文库的构建，容量为：250-400kb连接产物转化酵母菌，在尿嘧啶和色氨酸缺乏的培养基上筛选红色菌落连接产物转化酵母菌，在尿

13、嘧啶和色氨酸缺乏的培养基上筛选红色菌落（二）（二）细菌人工染色体细菌人工染色体1 F质粒质粒特点：特点：F因子是一个约因子是一个约100kb的性质粒的性质粒双链闭环双链闭环DNA1-2拷贝拷贝/细胞细胞在大肠杆菌染色体中含在大肠杆菌染色体中含30个以上随机整合位点个以上随机整合位点2 细菌人工染色体细菌人工染色体(BAC)第二节第二节 表达载体表达载体表达载体：表达载体：是指可携带是指可携带DNA片段进入宿主细胞进行复制并进行转录、片段进入宿主细胞进行复制并进行转录、翻译的载体翻译的载体用于基因表达的载体的类型：用于基因表达的载体的类型：质粒表达载体质粒表达载体病毒表达载体病毒表达载体人工染色

14、体表达载体人工染色体表达载体一、一、质粒表达载体质粒表达载体质粒表达载体：质粒表达载体：质粒克隆载体启动子转录终止子核糖体结合位点质粒克隆载体启动子转录终止子核糖体结合位点（一）（一）原核表达载体原核表达载体1.原核表达载体的表达元件原核表达载体的表达元件（1）表达元件主要包括启动子、转录终止子和核糖体结合位点。）表达元件主要包括启动子、转录终止子和核糖体结合位点。启动子：启动子：位于转录起始点上游，并且为转录起始所必需的序列元件。位于转录起始点上游，并且为转录起始所必需的序列元件。原核表达载体启动子种类：原核表达载体启动子种类：Lac、trp、Tac、T7和和IPL启动子启动子转录终止子：转

15、录终止子：基因编码区下游一段使转录终止的核苷酸序列。基因编码区下游一段使转录终止的核苷酸序列。SD序列序列：原核生物结构基因起始密码子上游与核糖体原核生物结构基因起始密码子上游与核糖体30S亚基识别和亚基识别和 结合的位点，称为核糖体结合序列即结合的位点，称为核糖体结合序列即SD序列。序列。（2）表达方式包括组成型表达、诱导型表达、融合型表达、分泌型表达。）表达方式包括组成型表达、诱导型表达、融合型表达、分泌型表达。组成型表达：持续不断地表达目的蛋白。组成型表达：持续不断地表达目的蛋白。诱导型表达：在诱导物存在的情况下表达目的蛋白。诱导型表达：在诱导物存在的情况下表达目的蛋白。融合型表达：表达

16、载体的多克隆位点上有一个融合表达表达标签，融合型表达：表达载体的多克隆位点上有一个融合表达表达标签，表达的蛋白为融合蛋白。表达的蛋白为融合蛋白。分泌型表达：在起始密码和目的基因之间加入一个信号肽，可以引导目的分泌型表达：在起始密码和目的基因之间加入一个信号肽，可以引导目的 蛋白穿越细胞膜，分泌到细胞外。蛋白穿越细胞膜，分泌到细胞外。（二）（二）酵母表达载体酵母表达载体（三）（三）TiTi质粒表达载体质粒表达载体1.天然天然Ti质粒的结构及其致瘤功能质粒的结构及其致瘤功能Ti（tumor inducing plasmid）质粒是根癌农杆菌中可引发植物产生冠质粒是根癌农杆菌中可引发植物产生冠瘿瘤的

17、致瘤；瘿瘤的致瘤；大小为大小为200-250kb；Ti 质粒可分为质粒可分为4个功能区：个功能区：T-DNA、Vir、Con、OriT-DNA区区：Ti质粒中能够转移到植物细胞内的区域，称为质粒中能够转移到植物细胞内的区域，称为T-DNA 即即 transfer DNA2.Ti质粒表达载体质粒表达载体一元载体：一元载体：指含目的基因的中间表达载体和改造后的受体（指含目的基因的中间表达载体和改造后的受体（Ti质粒）通过质粒）通过同源重组所产生的一种复合型载体，也称为共整合载体。同源重组所产生的一种复合型载体，也称为共整合载体。双元载体：双元载体：指由两个分别含有指由两个分别含有T-DNA和和Vi

18、r区的相容性突变区的相容性突变Ti质粒构成的系质粒构成的系统。统。双元载体的特点：双元载体的特点：a.大肠杆菌和农杆菌穿梭载体；大肠杆菌和农杆菌穿梭载体；b.可用基因枪或农杆菌介导进行遗传转化；可用基因枪或农杆菌介导进行遗传转化；c.转化效率高于一元转化载体。转化效率高于一元转化载体。（四）（四）动物质粒表达载体动物质粒表达载体特点：特点：a.质粒载体质粒载体b.原核复制区和选择标记基因；原核复制区和选择标记基因；c.动物细胞的选择标记基因。动物细胞的选择标记基因。二、二、病毒表达载体病毒表达载体病毒表达载体元件：病毒表达载体元件：a.源于病毒的启动子和增强子；源于病毒的启动子和增强子；b.病

19、毒复制子序列以及所需的反式作用因子编码基因；病毒复制子序列以及所需的反式作用因子编码基因；c.polyA加尾信号。加尾信号。病毒表达载体作用：病毒表达载体作用：a.外源蛋白的真核表达；外源蛋白的真核表达；b.基因治疗；基因治疗；c.多价、多联活载体疫苗的研制；多价、多联活载体疫苗的研制；d.基因功能鉴定。基因功能鉴定。（一）（一）杆状病毒表达载体杆状病毒表达载体无脊椎动物病毒，其遗传物质为双链闭合环状无脊椎动物病毒，其遗传物质为双链闭合环状DNA（二）（二）腺病毒表达载体腺病毒表达载体（三）（三）反转录病毒载体反转录病毒载体单链单链RNA病毒病毒 RNA反转录为双链反转录为双链DNA 整合到宿

20、主基因组构成原病毒整合到宿主基因组构成原病毒 原病毒转录成病毒原病毒转录成病毒RNA，实现复制，实现复制（四）（四）SV40 SV40型病毒转化载体型病毒转化载体SV40是猿猴空泡病毒是猿猴空泡病毒40，哺乳动物病毒。，哺乳动物病毒。SV40为双链闭环为双链闭环DNA病毒，可用于构建哺乳动物表达载体。病毒，可用于构建哺乳动物表达载体。三、三、大片段表达载体大片段表达载体（一）（一）TAC-TAC-可转移人工染色体可转移人工染色体（二）（二）MAC MAC 哺乳动物人工染色体哺乳动物人工染色体哺乳动物染色体复哺乳动物染色体复制起始位点序列、制起始位点序列、端粒、着丝粒端粒、着丝粒载体元件载体元件

21、MACMAC优点：优点：1)装载外源装载外源DNA片段的容量大；片段的容量大；2)不整合到宿主染色体上；不整合到宿主染色体上；3)较少发生基因沉默现象。较少发生基因沉默现象。第三节第三节 特殊用途的载体特殊用途的载体一、一、插入或定点整合突变载体插入或定点整合突变载体（一）基因定点插入（一）基因定点插入/基因敲除载体基因敲除载体外源基因与靶基因组外源基因与靶基因组DNA具有同源序列具有同源序列同源重组同源重组外源基因定点整合到基因组的特定位点外源基因定点整合到基因组的特定位点（二）随机插入突变载体（二）随机插入突变载体1.T-DNA插入突变载体插入突变载体T-DNA插入破坏插入破坏插入位点的基

22、因插入位点的基因2.转座子插入突变载体转座子插入突变载体来源于苏云金芽孢杆菌的转座子来源于苏云金芽孢杆菌的转座子Tn5401构建构建用于微生物的插入突变载体用于微生物的插入突变载体pEG922二、二、启动子探针型表达载体启动子探针型表达载体三、三、RNAi载体载体RNAi：双链双链RNA对基因表达的阻断作用被称为对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰（干扰（RNA interference，RNAi），属于基因转录后沉默。），属于基因转录后沉默。1.RNAi的作用机制的作用机制2.RNAi载体载体1)转基因转基因RNAi载体载体单链单链RNA自我配对形成发卡结构自我配对形成发卡结构RNA，发，发

23、卡结构卡结构RNA具有引发具有引发RNAi的双链的双链DNA2)VIGS载体载体VIGS：病毒诱导的基因沉默（：病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS)原理：原理：利用植物体内天然的免疫系统机制，将目的基因片段构建到病毒载体中并用利用植物体内天然的免疫系统机制，将目的基因片段构建到病毒载体中并用病毒浸染寄主植物，目的基因片段作物病毒的一部分同病毒一起复制并扩散到整株病毒浸染寄主植物，目的基因片段作物病毒的一部分同病毒一起复制并扩散到整株植物，植物体的防御机制并病毒激活后，在识别病毒和目的基因的同时，将内源的植物，植物体的防御机制并病毒激活后，在识别病毒和目的基因的同时，将内源的目的基因的目的基因的mRNA降解降解结束结束