实验六小鼠骨髓细胞染色体标本的制备.ppt

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1、实验六小鼠骨髓细胞染色体标本的制备 Still waters run deep.流静流静水水深深,人静人静心心深深 Where there is life,there is hope。有生。有生命命必有必有希望希望一、实验目的一、实验目的1.通过小白鼠骨髓细胞染色体的制备，初 步掌握低渗法制备动物骨髓细胞染色体 的方法2.熟悉染色体的形态、种类及小白鼠等动 物染色体的数目及特点二、实验原理二、实验原理 骨髓细胞是具有旺盛分裂能力的细胞，从这些分裂细胞中，可观察到处于分裂中期的染色体，能对一种动物染色体的形态特征、数目进行准确的观察和分析。由于小鼠四肢骨内骨髓细胞中的造血干细胞是生成各种血细胞的

2、原始细胞，具有高度的分裂能力，本实验采用这一材料，通过前处理，低渗，固定，制片，染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。首先,为了获得较多的中期分裂相骨髓细胞,必须给动物注射一定剂量的秋水仙素。秋水仙素对分裂期纺锤丝的形成具有破坏作用，当动物被注射适量的秋水仙素后,处于分裂增殖中的骨髓细胞由于纺锤丝不能形成,中期染色体不能正常趋向两极,因而大量的细胞处于观察染色体形态最佳的分裂中期。其次,为了能够清楚的观察染色体的形态，取出的骨髓细胞要经过低渗(KCl溶液)处理使细胞膨胀、染色体适当的分散。固定(甲醇:冰醋酸)使染色体保持完好的形态。染色(Giems

3、a液)使染色体易分辨、观察。二、实验原理二、实验原理(continued)1.材料材料：小白鼠2.试剂：试剂：0.01秋水仙素,0.4%氯化钾 (KCl),Carnoy固定液(甲醇:冰醋酸=3:1),Giemsa染 液，0.01M磷酸缓冲液(pH 6.8)，2%柠檬酸钠。3.器材：器材：离心机、显微镜、剪刀、解剖刀、小镊 子、注射器及针头、刻度离心管、吸管、载玻 片和盖玻片、染色缸、玻片盒 三、三、实验用品实验用品四、实验步骤四、实验步骤1.1.1.1.预处理：预处理：预处理：预处理：实验前实验前2.5-32.5-3小时，按每克体重注射小时，按每克体重注射0.02ml0.02ml，给小白鼠腹腔

4、注射秋水仙素。给小白鼠腹腔注射秋水仙素。2.2.2.2.断颈处死断颈处死断颈处死断颈处死动物动物.3.3.3.3.剥取剥取剥取剥取股骨股骨和胫骨和胫骨，剔去肌肉组织，剪去两端的股，剔去肌肉组织，剪去两端的股 骨头骨头4.4.4.4.冲洗冲洗冲洗冲洗骨髓：吸取骨髓：吸取2%2%柠檬酸钠柠檬酸钠,注射器针头插入骨注射器针头插入骨 一端一端,反复冲洗骨髓反复冲洗骨髓,取取8 8mlml至至离心管中离心管中.1200rpm1200rpm 离心离心5min,5min,弃上清弃上清.5.5.5.5.低渗低渗低渗低渗：加入：加入8mL 0.4%KCl8mL 0.4%KCl溶液溶液,37,37o oC C低渗

5、低渗2 20 0分钟，分钟，中间（约中间（约1 10 0分钟）分钟）用吸管吹打二次用吸管吹打二次，使细胞分，使细胞分 散，悬浮于溶液中。散，悬浮于溶液中。6.6.6.6.离心：离心：离心：离心：1 12 200rpm00rpm离心离心5 5分钟后弃去上清液，分钟后弃去上清液，7.7.7.7.固定：固定：固定：固定：加加8 8mlml固定液并用吸管轻轻吹匀，固定液并用吸管轻轻吹匀，室温下静室温下静 置置2 20 0分钟，分钟，每每1 10 0分钟时吹打一次。分钟时吹打一次。8.8.8.8.离心：离心：离心：离心：1 12 200rpm00rpm离心离心6 6分钟，弃上清液。分钟，弃上清液。9 9

6、 9 9.离心：离心：离心：离心：加加1.5mL1.5mL固定液，吸管吹打成细胞悬液。固定液，吸管吹打成细胞悬液。1 1 1 10 0 0 0.滴片：滴片：滴片：滴片：用吸管吸取细胞悬液，滴在预冷的载玻用吸管吸取细胞悬液，滴在预冷的载玻 片上，室温晾干片上，室温晾干1 1 1 11 1 1 1.染色染色染色染色：10%Giemsa10%Giemsa染液染色染液染色3030分钟分钟四、实验步骤四、实验步骤(continued)在显微镜下观察在显微镜下观察GiemsaGiemsa染色之后的染色体染色之后的染色体片片(染色体呈紫红色染色体呈紫红色)，找出分散适度的中期染色，找出分散适度的中期染色体图

7、象体图象,观察观察小白鼠小白鼠的染色体形态，统计的染色体形态，统计其其染色染色体数目。体数目。制得好的标本应是细胞多、颜色为紫红色。制得好的标本应是细胞多、颜色为紫红色。此时间期细胞由于低渗和固定处理，细胞膜和质此时间期细胞由于低渗和固定处理，细胞膜和质已被去掉，镜下看到的仅为膨胀后呈圆形的细胞已被去掉，镜下看到的仅为膨胀后呈圆形的细胞核。分裂期细胞染色体集中在一起，其外也无细核。分裂期细胞染色体集中在一起，其外也无细胞膜包裹，染色体之间无重叠，易分辨，臂的长胞膜包裹，染色体之间无重叠，易分辨，臂的长度适中。但最重要的是分裂相要多。度适中。但最重要的是分裂相要多。五、实验结果五、实验结果 几种

8、动物染色体形态特征几种动物染色体形态特征动物名称动物名称染色体数染色体数染色体类型染色体类型x x染色体形态染色体形态y y染色体形态染色体形态青蛙青蛙2626中央、亚中央着丝粒染色中央、亚中央着丝粒染色体体中央着丝粒染色体，中央着丝粒染色体，介于介于6 67 7号号中央着丝粒染色体，中央着丝粒染色体，介于介于8 89 9号号小白鼠小白鼠4040全部为近端着丝粒染色体全部为近端着丝粒染色体大小介于大小介于5 56 6号号大小介于大小介于19192020号号大白鼠大白鼠4242中央、亚中央近端着丝粒中央、亚中央近端着丝粒染色体染色体近端着丝粒染色体，近端着丝粒染色体，介于介于4 45 5号号近端

9、着丝粒染色体，近端着丝粒染色体，介于介于18181919号号家兔家兔4444中央、亚中央近端着丝粒中央、亚中央近端着丝粒染色体染色体亚中央着丝粒染色亚中央着丝粒染色体，介于体，介于5 56 6号号近端着丝粒染色体，近端着丝粒染色体，介于介于19192020号号六六、注意事项、注意事项 低渗与离心等步骤的操作要轻。低渗与离心等步骤的操作要轻。观察细胞的标准为：观察细胞的标准为：1.1.细胞完整，轮廓清晰，染色体分布在同一水平面上细胞完整，轮廓清晰，染色体分布在同一水平面上2.2.染色体形态和分布良好。染色体形态和分布良好。3.3.最好无重叠，即使有个别重叠，也要能明确辩认，最好无重叠，即使有个别

10、重叠，也要能明确辩认，以免差错。以免差错。4.4.所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段，即染色体螺所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段，即染色体螺 旋化程度或染色体长短大致一样。在所观察的细胞旋化程度或染色体长短大致一样。在所观察的细胞 周围，没有离散的单个或多个染色体存在，以免影周围，没有离散的单个或多个染色体存在，以免影 响计数。响计数。七、七、实验报告与思考题实验报告与思考题实验报告实验报告1.1.记录所观察小白鼠骨髓细胞染色体的数目和形态。记录所观察小白鼠骨髓细胞染色体的数目和形态。2.2.绘制一个你所观察到的小白鼠骨髓细胞染色体分裂相图。绘制一个你所观察到的小白鼠骨髓细胞染色体分裂相图。思考题思考题1.1.简述小白鼠骨髓细胞染色体的制备过程。简述小白鼠骨髓细胞染色体的制备过程。2.2.制片过程中为什么要进行低渗处理？制片过程中为什么要进行低渗处理？3.3.在取骨髓前为什么要给动物注射秋水仙素在取骨髓前为什么要给动物注射秋水仙素?