实验——基因组抽提.ppt

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1、实验基因组抽提 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望实验原理实验原理基因组抽提基因组抽提1.1.本实验采用小规模快速制备总本实验采用小规模快速制备总本实验采用小规模快速制备总本实验采用小规模快速制备总DNADNA，其基本原理是，其基本原理是，其基本原理是，其基本原理是：在碱性条件下，用表面活性剂在碱性条件下，用表面活性剂在碱性条件下，用表面活性剂在碱性条件下，用表面活性剂SDSSDS将细菌细胞壁破裂，将细菌细胞壁破裂，将细菌细胞壁破裂，将细菌细胞壁破裂，

2、然后用高浓度的然后用高浓度的然后用高浓度的然后用高浓度的NaClNaCl沉淀蛋白质等杂质，经过沉淀蛋白质等杂质，经过沉淀蛋白质等杂质，经过沉淀蛋白质等杂质，经过苯酚苯酚苯酚苯酚抽抽抽抽提进一步去掉蛋白质等杂质，经乙醇沉淀，得到较纯提进一步去掉蛋白质等杂质，经乙醇沉淀，得到较纯提进一步去掉蛋白质等杂质，经乙醇沉淀，得到较纯提进一步去掉蛋白质等杂质，经乙醇沉淀，得到较纯的总的总的总的总DNADNA。2.2.用无水乙醇沉淀用无水乙醇沉淀用无水乙醇沉淀用无水乙醇沉淀DNADNA，这是实验中最常用的沉淀，这是实验中最常用的沉淀，这是实验中最常用的沉淀，这是实验中最常用的沉淀DNADNA的方法。乙醇的优点

3、是可以任意比和水相混溶，乙醇的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对与核酸不会起任何化学反应，对与核酸不会起任何化学反应，对与核酸不会起任何化学反应，对DNADNA很安全，因此是很安全，因此是很安全，因此是很安全，因此是理想的沉淀剂。理想的沉淀剂。理想的沉淀剂。理想的沉淀剂。DNADNA溶液是溶液是溶液是溶液是DNADNA以水合状态稳定存在，以水合状态稳定存在，以水合状态稳定存在，以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去当加入乙醇时，乙醇会夺去当加入乙醇时，乙醇会夺

4、去当加入乙醇时，乙醇会夺去DNADNA周围的水分子，使周围的水分子，使周围的水分子，使周围的水分子，使DNADNA失水而易于聚合。一般实验中，是加失水而易于聚合。一般实验中，是加失水而易于聚合。一般实验中，是加失水而易于聚合。一般实验中，是加2 2倍体积的无倍体积的无倍体积的无倍体积的无水乙醇与水乙醇与水乙醇与水乙醇与DNADNA相混合，其乙醇的最终含量占相混合，其乙醇的最终含量占相混合，其乙醇的最终含量占相混合，其乙醇的最终含量占6767左右。左右。左右。左右。实验原理实验原理琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳l l琼脂糖是从琼脂中分离得到，由琼脂糖是从琼脂中分离得到，由琼脂糖是从琼脂中分离得到，

5、由琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1,31,3连接的吡喃型连接的吡喃型连接的吡喃型连接的吡喃型-D-D-半乳糖和半乳糖和半乳糖和半乳糖和1,41,4连接的连接的连接的连接的3,63,6脱水吡喃型脱水吡喃型脱水吡喃型脱水吡喃型 -L-L-半乳糖组成，半乳糖组成，半乳糖组成，半乳糖组成，形成相对分子量为形成相对分子量为形成相对分子量为形成相对分子量为10104 4-10-105 5的长链。琼脂糖加热溶解后的长链。琼脂糖加热溶解后的长链。琼脂糖加热溶解后的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上分子呈随机线团状分布，当温度降低时链

6、间糖分子上分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。l l对于同种对于同种对于同种对于同种DNADNA分子，胶浓度越高，电泳速率越慢。分子，胶浓度越高，电泳速率越慢。分子，胶浓度越高，电泳速率越慢。分子，胶浓度越高，电泳速率越慢。l lDNADNA为碱性物质，在电泳（缓冲液为

7、碱性物质，在电泳（缓冲液为碱性物质，在电泳（缓冲液为碱性物质，在电泳（缓冲液pH=8pH=8）时带负电）时带负电）时带负电）时带负电荷，在一定的电场力作用下向正极泳动。而荷，在一定的电场力作用下向正极泳动。而荷，在一定的电场力作用下向正极泳动。而荷，在一定的电场力作用下向正极泳动。而DNADNA链上链上链上链上的负电荷伴随着的负电荷伴随着的负电荷伴随着的负电荷伴随着DNADNA分子量的增加而增加，荷质比是分子量的增加而增加，荷质比是分子量的增加而增加，荷质比是分子量的增加而增加，荷质比是一常数，故电泳中一常数，故电泳中一常数，故电泳中一常数，故电泳中DNADNA的分离类似分子筛效应。的分离类似

8、分子筛效应。的分离类似分子筛效应。的分离类似分子筛效应。实验原理实验原理琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳l l在相同的电泳条件下，影响在相同的电泳条件下，影响在相同的电泳条件下，影响在相同的电泳条件下，影响DNADNA分子泳动的因素主要分子泳动的因素主要分子泳动的因素主要分子泳动的因素主要是是是是DNADNA分子特性：分子特性：分子特性：分子特性：1.1.DNADNA分子大小。分子大小。分子大小。分子大小。DNADNA分子越大，在胶中的摩擦阻力就越大，分子越大，在胶中的摩擦阻力就越大，分子越大，在胶中的摩擦阻力就越大，分子越大，在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状泳动也越慢，迁移速率

9、与线状泳动也越慢，迁移速率与线状泳动也越慢，迁移速率与线状DNADNA分子质量的对数值成反比。分子质量的对数值成反比。分子质量的对数值成反比。分子质量的对数值成反比。2.2.DNADNA分子构型。对于质粒分子构型。对于质粒分子构型。对于质粒分子构型。对于质粒DNADNA分子即使具有相同分子质量，分子即使具有相同分子质量，分子即使具有相同分子质量，分子即使具有相同分子质量，因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同。常规电

10、泳中质粒速率的不同。常规电泳中质粒速率的不同。常规电泳中质粒速率的不同。常规电泳中质粒DNADNA分子的分子的分子的分子的3 3种构型泳动速率：种构型泳动速率：种构型泳动速率：种构型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。l l溴化乙锭（溴化乙锭（溴化乙锭（溴化乙锭（Ethidium BromideEthidium Bromide），简称），简称），简称），简称EBEB，是电泳中，是电泳中，是电泳中，是电泳中的常用的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到的常用的染色剂，具有

11、扁平结构，能嵌入到的常用的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到的常用的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到DNADNA碱基碱基碱基碱基对之间而与对之间而与对之间而与对之间而与DNADNA结合。由于结合。由于结合。由于结合。由于EBEB分子的插入，在紫外光分子的插入，在紫外光分子的插入，在紫外光分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的的照射下，凝胶电泳中的的照射下，凝胶电泳中的的照射下，凝胶电泳中的DNADNA条带呈现出红色荧光，条带呈现出红色荧光，条带呈现出红色荧光，条带呈现出红色荧光，易于检测。易于检测。易于检测。易于检测。实验原理实验原理琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳l l电泳中，电泳中，电泳中，电泳

12、中，DNADNA点样前必须加入一定量的上样缓冲液，点样前必须加入一定量的上样缓冲液，点样前必须加入一定量的上样缓冲液，点样前必须加入一定量的上样缓冲液，其主要作用如下：其主要作用如下：其主要作用如下：其主要作用如下：1.1.一般上样缓冲液中含一般上样缓冲液中含一般上样缓冲液中含一般上样缓冲液中含10 mmol/L10 mmol/L的的的的EDTAEDTA以螯合以螯合以螯合以螯合MgMg2+2+，防止电，防止电，防止电，防止电泳过程中泳过程中泳过程中泳过程中DNADNA被被被被DNaseDNase降解。降解。降解。降解。2.2.一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，和样品混合一般上样缓冲液中

13、加入一定浓度的甘油或蔗糖，和样品混合一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，和样品混合一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，和样品混合后用于增加样品密度以保证后用于增加样品密度以保证后用于增加样品密度以保证后用于增加样品密度以保证DNADNA沉入加样孔内。沉入加样孔内。沉入加样孔内。沉入加样孔内。3.3.一般上样缓冲液中加入溴酚蓝，使样品呈色，使加样操作更一般上样缓冲液中加入溴酚蓝，使样品呈色，使加样操作更一般上样缓冲液中加入溴酚蓝，使样品呈色，使加样操作更一般上样缓冲液中加入溴酚蓝，使样品呈色，使加样操作更方便，同时溴酚蓝的泳动速率较快（约与方便，同时溴酚蓝的泳动速率较快（约与方便，同

14、时溴酚蓝的泳动速率较快（约与方便，同时溴酚蓝的泳动速率较快（约与300 bp300 bp的线状双链的线状双链的线状双链的线状双链DNADNA相同），可用于监测电泳的行进过程。相同），可用于监测电泳的行进过程。相同），可用于监测电泳的行进过程。相同），可用于监测电泳的行进过程。实验原理实验原理琼琼脂糖凝胶电泳脂糖凝胶电泳l l目前各厂商开发了各种类型目前各厂商开发了各种类型目前各厂商开发了各种类型目前各厂商开发了各种类型的标准分子量。电泳时样品的标准分子量。电泳时样品的标准分子量。电泳时样品的标准分子量。电泳时样品和和和和MarkerMarker在平行的加样孔内在平行的加样孔内在平行的加样孔内在

15、平行的加样孔内加入，同时进行电泳，可以加入，同时进行电泳，可以加入，同时进行电泳，可以加入，同时进行电泳，可以根据电泳结果看出样品中根据电泳结果看出样品中根据电泳结果看出样品中根据电泳结果看出样品中DNADNA的大小。的大小。的大小。的大小。操作步骤操作步骤细菌总细菌总DNA的提取的提取1.1.菌体培养：接种大肠杆菌菌体培养：接种大肠杆菌菌体培养：接种大肠杆菌菌体培养：接种大肠杆菌K12sK12s于于于于LBLB液体培养基，于液体培养基，于液体培养基，于液体培养基，于3737振荡培养振荡培养振荡培养振荡培养161618 h18 h，获得足够的菌体。，获得足够的菌体。，获得足够的菌体。，获得足够

16、的菌体。2.2.菌体收集：取菌体收集：取菌体收集：取菌体收集：取1.5 mL1.5 mL培养液于培养液于培养液于培养液于1.5 mL1.5 mL离心管中，离心管中，离心管中，离心管中，12000 rpm12000 rpm离心离心离心离心30 30 s s，弃上清，收集菌体（注意吸干多余的水分）。，弃上清，收集菌体（注意吸干多余的水分）。，弃上清，收集菌体（注意吸干多余的水分）。，弃上清，收集菌体（注意吸干多余的水分）。3.3.裂解菌体：向每管加入裂解菌体：向每管加入裂解菌体：向每管加入裂解菌体：向每管加入200 L200 L裂解缓冲液，用微量移液器吸头强裂解缓冲液，用微量移液器吸头强裂解缓冲液

17、，用微量移液器吸头强裂解缓冲液，用微量移液器吸头强烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞。烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞。烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞。烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞。4.4.向每管加入向每管加入向每管加入向每管加入66 L 5mol/L NaCl66 L 5mol/L NaCl，充分混匀后，充分混匀后，充分混匀后，充分混匀后，12000 rpm12000 rpm离心离心离心离心10 10 minmin，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。5.5.将上清转移到新离心管中，加入等体积的苯酚将上清转移到新离

18、心管中，加入等体积的苯酚将上清转移到新离心管中，加入等体积的苯酚将上清转移到新离心管中，加入等体积的苯酚/氯仿氯仿氯仿氯仿/异戊醇异戊醇异戊醇异戊醇（25/24/1 v/v/v25/24/1 v/v/v），充分混匀后，），充分混匀后，），充分混匀后，），充分混匀后，12000 rpm12000 rpm离心离心离心离心3 min3 min。6.6.小心取出上清，用小心取出上清，用小心取出上清，用小心取出上清，用0 0的两倍体积的无水乙醇沉淀，的两倍体积的无水乙醇沉淀，的两倍体积的无水乙醇沉淀，的两倍体积的无水乙醇沉淀，12000 rpm12000 rpm离离离离心心心心5 min5 min，弃上

19、清液。，弃上清液。，弃上清液。，弃上清液。7.7.沉淀用沉淀用沉淀用沉淀用400 L 70400 L 70的乙醇洗涤两次。的乙醇洗涤两次。的乙醇洗涤两次。的乙醇洗涤两次。每次每次每次每次12000 rpm12000 rpm离心离心离心离心2 min2 min。8.8.用电吹风小心吹干，用用电吹风小心吹干，用用电吹风小心吹干，用用电吹风小心吹干，用50 L50 L无菌双蒸水溶解无菌双蒸水溶解无菌双蒸水溶解无菌双蒸水溶解DNADNA。操作步骤操作步骤琼脂糖电泳琼脂糖电泳1.1.制胶（演示）：称取适量琼脂糖粉末，加入制胶（演示）：称取适量琼脂糖粉末，加入制胶（演示）：称取适量琼脂糖粉末，加入制胶（演

20、示）：称取适量琼脂糖粉末，加入TAETAE缓冲液配成缓冲液配成缓冲液配成缓冲液配成1.4%1.4%的浓度，加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中，加入少许的浓度，加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中，加入少许的浓度，加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中，加入少许的浓度，加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中，加入少许EBEB染液混染液混染液混染液混合，待溶液温度降至合，待溶液温度降至合，待溶液温度降至合，待溶液温度降至6565时，立即倒入制胶槽中，插入样品梳。时，立即倒入制胶槽中，插入样品梳。时，立即倒入制胶槽中，插入样品梳。时，立即倒入制胶槽中，插入样品梳。在室温放置一段时间，待凝胶全部凝结后，轻轻拔出样品梳，在在室温

21、放置一段时间，待凝胶全部凝结后，轻轻拔出样品梳，在在室温放置一段时间，待凝胶全部凝结后，轻轻拔出样品梳，在在室温放置一段时间，待凝胶全部凝结后，轻轻拔出样品梳，在凝胶板上即形成相互隔开的加样孔。把凝胶板从制胶槽中取出放凝胶板上即形成相互隔开的加样孔。把凝胶板从制胶槽中取出放凝胶板上即形成相互隔开的加样孔。把凝胶板从制胶槽中取出放凝胶板上即形成相互隔开的加样孔。把凝胶板从制胶槽中取出放入电泳槽，再往电泳槽中加入入电泳槽，再往电泳槽中加入入电泳槽，再往电泳槽中加入入电泳槽，再往电泳槽中加入1 1 TAE TAE直到液面没过凝胶并超过凝直到液面没过凝胶并超过凝直到液面没过凝胶并超过凝直到液面没过凝胶

22、并超过凝胶胶胶胶1 12 mm2 mm为止。为止。为止。为止。2.2.加样：用微量移液器取加样：用微量移液器取加样：用微量移液器取加样：用微量移液器取5 5 L DNA MarkerL DNA Marker，小心地加到最靠边上，小心地加到最靠边上，小心地加到最靠边上，小心地加到最靠边上的加样孔内。另取的加样孔内。另取的加样孔内。另取的加样孔内。另取1010 L L样品，和少量的上样缓冲液混匀后小心样品，和少量的上样缓冲液混匀后小心样品，和少量的上样缓冲液混匀后小心样品，和少量的上样缓冲液混匀后小心地加到同一凝胶板上相邻的加样孔中。每加完一个样品，换一个地加到同一凝胶板上相邻的加样孔中。每加完一

23、个样品，换一个地加到同一凝胶板上相邻的加样孔中。每加完一个样品，换一个地加到同一凝胶板上相邻的加样孔中。每加完一个样品，换一个吸头。吸头。吸头。吸头。3.3.电泳：接通电源，电泳：接通电源，电泳：接通电源，电泳：接通电源，DNADNA样品由负极往正极泳动，应使靠近加样孔样品由负极往正极泳动，应使靠近加样孔样品由负极往正极泳动，应使靠近加样孔样品由负极往正极泳动，应使靠近加样孔的一端为负。维持恒压的一端为负。维持恒压的一端为负。维持恒压的一端为负。维持恒压80 V80 V，电泳，电泳，电泳，电泳0.50.51 h1 h，直到溴酚兰指示剂移，直到溴酚兰指示剂移，直到溴酚兰指示剂移，直到溴酚兰指示剂

24、移动到凝胶底部，停止电泳。动到凝胶底部，停止电泳。动到凝胶底部，停止电泳。动到凝胶底部，停止电泳。4.4.观察：将凝胶板置于观察：将凝胶板置于观察：将凝胶板置于观察：将凝胶板置于254 nm254 nm波长紫外灯下进行观察。波长紫外灯下进行观察。波长紫外灯下进行观察。波长紫外灯下进行观察。DNADNA存在的存在的存在的存在的位置呈现橙黄色荧光。位置呈现橙黄色荧光。位置呈现橙黄色荧光。位置呈现橙黄色荧光。注意事项注意事项l l半无菌操作。半无菌操作。半无菌操作。半无菌操作。l l微量移液器的正确使用。微量移液器的正确使用。微量移液器的正确使用。微量移液器的正确使用。l l离心机的正确使用。离心机

25、的正确使用。离心机的正确使用。离心机的正确使用。l l基因组的提取过程中，基因组的提取过程中，基因组的提取过程中，基因组的提取过程中，DNADNA会发生机械断裂产生大小会发生机械断裂产生大小会发生机械断裂产生大小会发生机械断裂产生大小不同的片段，应注意温和操作，以保证得到较长的不同的片段，应注意温和操作，以保证得到较长的不同的片段，应注意温和操作，以保证得到较长的不同的片段，应注意温和操作，以保证得到较长的DNADNA。l l用电吹风吹干用电吹风吹干用电吹风吹干用电吹风吹干DNADNA时要小心，注意不要把时要小心，注意不要把时要小心，注意不要把时要小心，注意不要把DNADNA吹出离吹出离吹出离

26、吹出离心管。心管。心管。心管。l l EB EB有毒，勿将溶液滴洒在台面或地面上，切勿用裸露有毒，勿将溶液滴洒在台面或地面上，切勿用裸露有毒，勿将溶液滴洒在台面或地面上，切勿用裸露有毒，勿将溶液滴洒在台面或地面上，切勿用裸露皮肤接触皮肤接触皮肤接触皮肤接触EBEB及含有及含有及含有及含有EBEB的溶液和试剂。的溶液和试剂。的溶液和试剂。的溶液和试剂。思考题思考题l l为什么用冷的为什么用冷的为什么用冷的为什么用冷的7070乙醇清洗乙醇清洗乙醇清洗乙醇清洗DNADNA？l lDNADNA的分子大小与迁移速率的关系如何？的分子大小与迁移速率的关系如何？的分子大小与迁移速率的关系如何？的分子大小与迁移速率的关系如何？l l琼脂糖凝胶浓度对琼脂糖凝胶浓度对琼脂糖凝胶浓度对琼脂糖凝胶浓度对DNADNA电泳有什么影响？电泳有什么影响？电泳有什么影响？电泳有什么影响？下次实验下次实验l质粒质粒质粒质粒DNADNA的的的的提取提取提取提取