提RNA+逆转录+qRT-PCR步骤模板.doc

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1、|【一、提 RNA】一、实验准备：1、试剂：75%乙醇、Trizol、1.5mL 进口 EP 管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA 专用)、2、配 75%乙醇(DEPC 水+无水乙醇)，放-20冰箱预冷；3、预冷离心机(1.5mL EP 管用的)；4、清洁桌面，酒精喷过之后擦干，新手套、两层口罩；二、操作步骤：01、弃上清（不回收，直接倒去）；02、1mL/孔 PBS 洗两遍（不回收，直接倒去，随后用 200L 枪吸尽 PBS）；03、每孔加 500L Trizol，轻晃，随后室温放置 2min 左右；04、枪头吹打，吸出放入 1.5mL 进口 EP 管；05、加入 100L 氯仿(即 1/5

2、体积的 trizol)；06、4离心机，12000g，15min；07、吸 200L(可减少)上清放入新的 1.5mL 进口 EP 管中（注意：只能吸到上清）；08、加入等体积异丙醇，充分混匀，常温放置 10-30min(15min)；09、4离心机，12000g，10min；10、倒掉液体，加入 1mL 预冷的 75%乙醇剧烈混匀；11、4离心机，7500g，5min；12、倒掉上清，加入 1mL 预冷的 75%乙醇，混匀；13、4离心机，7500g，5min；14、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上，5-10min，用针头或者 200 微升枪头去掉管壁上的水珠；15、每管中加入 40L(40-60L

3、)的 DEPC 水，吹打溶解；16、测浓度（先知楼 21 楼测 RNA 浓度，带 DEPC 水、灭菌的 dd 水、10 微升枪和枪头）；三、注意事项01、如果当时不测 RNA 浓度，可暂时把 RNA 放在-20冰箱。但长时间(24h)保存，需要放在-80冰箱；02、异丙醇作用是沉淀 RNA，作用比乙醇好；03、04、05、06、07、08、09、|【二、测 RNA 浓度】一、实验准备：01、先知楼 21 楼-2109 教室，一个冰盒+DEPC 水+10 微升枪、灭菌 dd H2O、10L 枪头(RNA 专用)、本子+笔；二、操作步骤：01、登记；02、打开电脑=打开“N”软件=点击“Nucle

4、ic acid”=选择“OK”=选择“RNA”；03、灭菌 dd H2O 清洗 2-3 遍，擦干；04、DEPC 水 校零：即加 DEPC 水一滴，点击“Blank”，擦干；05、测 RNA：加样品一滴，点击“measure”，擦干，随后加下一个样品；06、记录数据，包括 RNA 浓度（0.1。（请注意，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于 0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值加 1 号试剂（2L）=加 3 号试剂(0.5L)=加 4 号试剂(0.5L)=加 2 号试剂(0.5L)=加 RNA=离心=上机；02、上机：OPEN=点击“Us

5、er”菜单下的“clx”，点击“Accept”=选择“run”下面的到“exp001 rt”=修改体系“10L”(默认为 25 微升)=点击“Start”，进入界面；03、37.0 15min=85.0 5s=4.0 60min；04、4冰箱保存；三、注意事项01、加液尽量无气泡，枪不要打到底；02、严格冰上操作，防止 RNA 降解；|【qRT-PCR】一、实验准备：01、试剂：Roche 的 SyBr Green(rox)02、1.5mL EP 管、0.2mL EP 管、96 孔板/八连冠；10L、20L、100L、200L、2.5L、1000L 枪；03、冰盒一个、Rox 化冻(避光)、引

6、物化冻（GAPDH）、cDNA、DEPC 水；二、操作步骤：01、 Rox 10L；+ dd H2O 6L；+ P1(F) 1+ P2(R) 1+ cDNA 2-20L 体系02、计算：每个样，X 个抗体(至少包括 GAPDH-内参,还有目的)，三个副孔。即如果六个样，2 个抗体(GAPDH,PLK1)，三个副孔。6*1*3=1820(PLK1)，6*1*3=1820(GAPDH)；1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 126/PLK1 6/PLK1 6/PLK1 5/PLK1 5/PLK1 5/PLK16/GAP 6/GAP 6/GAP 5/GAP 5/GAP 5/GAP4/PLK

7、1 4/PLK1 4/PLK1 3/PLK1 3/PLK1 3/PLK1 2/PLK1 2/PLK1 2/PLK1 1/PLK1 1/PLK1 1/PLK14/GAP 4/GAP 4/GAP 3/GAP 3/GAP 3/GAP 2/GAP 2/GAP 2/GAP 1/GAP 1/GAP 1/GAPPLK1Rox：10*20=200LDEPC 水：6*20=120LF：1*20=20LR：1*20=20LGAPDHRox：10*20=200LDEPC 水：6*20=120LF：1*20=20LR：1*20=20L03、稀释 cDNA 10 倍(18L DEPC 水+2L)=配置 Mix(Rox+

8、 DEPC 水+F+R)=加样(一横排先加 18L mix(GAPDH)，随后加入 18L mix(PLK1)。随后六个孔加同一个 cDNA；06、去除气泡：加好样后，观察有无气泡。如果有气泡，弹开，随后2000rpm 离心，时间不定(5s 即可)；07、上机+设置程序：A、双击打开程序“ StepOne Software v2.1 ”=点击“ OK ”=点击“Ignore 1.5;3;6;9;12) ，则点击“Add New Sample ”，出现 “Sample 1、Sample 2、Sample 3、Sample 4、Sample 5、Sample 6”六个=将其重命名；Plate Se

9、tup 界面-Assign Targets and Samples 界面：GAP/1 GAP/1 GAP/1 GAP/2 GAP/2 GAP/2 GAP/3 GAP/3 GAP/3 GAP/4 GAP/4 GAP/4Plk1/1 Plk1/1 Plk1/1 Plk1/2 Plk1/2 Plk1/2 Plk1/3 Plk1/3 Plk1/3 Plk1/4 Plk1/4 Plk1/4Akt/1 Akt/1 Akt/1 Akt/2 Akt/2 Akt/2 Akt/3 Akt/3 Akt/3 Akt/4 Akt/4 Akt/4PI3K/1 PI3K/1 PI3K/1 PI3K/2 PI3K/2 PI3

10、K/2 PI3K/3 PI3K/3 PI3K/3 PI3K/4 PI3K/4 PI3K/4GAP/5 GAP/5 GAP/5 GAP/6 GAP/6 GAP/6Plk1/5 Plk1/5 Plk1/5 Plk1/6 Plk1/6 Plk1/6Akt/5 Akt/5 Akt/5 Akt/6 Akt/6 Akt/6PI3K/5 PI3K/5 PI3K/5 PI3K/6 PI3K/6 PI3K/6D、Run Method 界面：设置温度；随后修改“Reaction Volume Per Well”，将其改为“20L 体系”；|E、点击“Start Run”三、注意事项01、注意一定要禁止气泡。吸液体时，观察枪头中有没有气泡和液体；打加入液体时，延管壁加入，枪头只能打到第一档，随后观察枪头有没有打尽；02、加入引物时，一定要涡旋混匀；03、Rox 加入后，一定要避光；04、加入的液体一定要等量；