第十六章 药品质量控制中的现代分析方法与技术.doc

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1、第十六章 药品质量控制中的现代分析方法与技术第一节 从毛细管电泳到微流控芯片实验室林炳承 研究员，博士生导师，1944年11月生于浙江宁波。1968年毕业于南京工学院，1986年在中国科学院大连化物所获博士学位。20世纪80年代从事色谱研究。90年代从事毛细管电泳研究，1999年起开始芯片实验室研究。中国化学会毛细管电泳专业小组组长。德国洪堡基金、日本学术振兴会研究员，比利时布鲁塞尔自由大学访问学者，香港大学、德国Tbingen大学、美国Truman州立大学、意大利科学院访问教授。1987年初，林炳承由洪堡研究基金资助，到德国吐宾根大学深造。一次在接待美国波士顿大学的B. Karger教授时他

2、得知，美国Anak. Chem.(分析化学)杂志刚刚引入了一个有生物学背景的博士作为编辑，以加强分析化学和生命科学结合的力度。这一消息引起他很深的共鸣。他一直认为，当代化学需要关注两大对象，一是生命科学，二是材料科学，分析化学更多的是前者，这是20世纪后期科学发展进程决定的，不以个人的意志为转移。在众多的分析化学分支中，电泳技术已经在生物大分子的研究中显示出了独到的优势，80年代以来，人们开始注意把支撑电泳过程的载体从平板转移到50-100微米内径的毛细管上，从而有可能使电泳技术兼有高效、快速等特点，从那时起他萌生了以毛细管电泳研究为切入点进入生命科学领域的想法。回国以后，林炳承带领几名同事开

3、始着手筹建一个全新的毛细管电泳实验室。他们利用洪堡基金会赠送的价值4万马克的仪器和张存浩所长拨给的3万元基金，迅速开展了第一轮研究工作。此后他们又和美国伯乐公司合作，充分利用对方提供的价值8万美元的仪器和试剂、备件，有力地把研究工作推进到一个新的高度。当然，一个新学科的建立和发展，不会是一帆风顺的。90年代中前期，曾经有人对毛细管电泳的应用和市场前景产生质疑，并因此对其研究价值提出疑问。有一段时期，林炳承直面压力，反复思考，他以其丰富的学术积累和渊博的知识断定，这是一个应当坚持的方向，不能动摇。他抓住毛细管电泳在基因诊断中可能产生的作用，创造实验条件，促成与北京协和医科大学合作，根据基因诊断中

4、所涉及的问题，对毛细管电泳柱、筛分介质及理论等诸方面进行了深入的研究，并成功地在苯丙酮尿症等疾病的诊断上，取得了重大突破。与此同时，又和德国吐宾根大学合作，在毛细管电泳手性药物拆分研究方面取得了一系列重要的进展。其中粘度和水处于同一数量级、分辨率达到180万理论塔板数/米的筛分介质的研制，手性拆分中“侧位键合”模型的提出及其指导下的140种手性药物的拆分，尿中痕量喋啶类肿瘤标记物的测定等工作都取得了处于国际前沿的成果。1992年以来，林炳承领导课题组共发表论文146篇，出版毛细管电泳导论、高效液相色谱在生命科学中的应用等专著3部、文集6本，申请专利31项，其中授权12项，2002年获辽宁省自然

5、科学奖一等奖，先后主持第一、二、三、四、五届全国毛细管电泳会，第一、二、三、四届亚太国际毛细管电泳会。并被聘为国际“电泳”(Ekectrophoresis)杂志和“生物化学与生物物理方法”杂志(Jounak of Biochemicak and Biophysicak Methods， JBBM)惟一的中国编委。他的学术观点和研究水平得到了国内外学术界同行的公认，他为中国跻身于国际毛细管电泳领域的先进行列做出了重要贡献。十年磨一剑，林炳承为推进我国的毛细管电泳研究作出了不懈努力，倾注了大量的心血。他认为，正在研究的理论、技术和方法就其基本面来说总是不成熟、不完整的，一旦成熟和完善就将被写入教科

6、书，或被做成产品。一个资历较深的科学家的责任在于，当他的研究对象还不成熟、甚至是非常不成熟时，要看到它潜在的、本质的一面，并且牢牢地把它抓住。就在毛细管电泳达到它的技术顶峰，作为主流平台完成了人类基因组测序这一伟大工程的同时，一个以芯片为基础，有可能集实验室各种单元技术于一体，一度在业内被称之为芯片毛细管电泳的技术悄然出现，这就是当前被誉为21世纪重要科学前沿之一的微流控芯片实验室技术。林炳承凭着他敏锐的科研直觉，迅速果断地以芯片电泳为切入点，在非常短的时间内，把整个课题组的研究重点转向以医学诊断和药物筛选为最终目的的微流控芯片实验室研究。曾经有一些人不解地提出，林老师的毛细管电泳搞得这么好，

7、为什么又要去搞芯片？对此，林炳承有他自己的理解。他说：“搞科学研究，就得敢于去面对新的变化，我们的目的是探索、发现，一旦这一目标实现，还得敢于转移，再去寻找新的生长点。这一点和搞地质找矿有点相似，都不那么容易。在原来的那个领域你可能已经很有地位，也可能已得到国内外同行的公认，但是到一个新的领域，昔日的光环不复存在。这需要判断，需要勇气，需要重新学习，有时甚至需要从零开始。这样的做法，对自己会很累，但客观上往往很重要，因为你所寻求的可能关系到未来一段时期国家在世界上的竞争力，你还可能为国家培养出一大批急需的这一领域的高层次人才。”为了促成芯片研究工作在全国范围内的开展，林炳承随中国分析化学家代表

8、团陪同国家基金委部门领导到美国、加拿大考察，应邀到基金委作关于微流控芯片实验室的专题报告，在大年初三接到基金委化学部领导电话后，立即就组织芯片研究重大专项基金一事起草报告给基金委领导，在访问德国时多次用E-maik向所领导陈述意见在基金委、中国科学院和大连化物所的支持下，他领导课题组在很短时间内研制出激光诱导荧光芯片分析仪、电化学芯片分析仪和芯片聚合酶链反应(PCR)仪，研制出不同类型的玻璃芯片、PDMS芯片、可规模生产的注塑PMMA塑料芯片，并成功地实现了芯片上核酸、糖蛋白、多肽、氨基酸和手性分子的分离分析，开展了芯片平台上的单细胞、单分子检测研究。在抗击“非典”时期，课题组临危受命，迅速启

9、动“发热型病毒性呼吸道疾病早期检测系统的研究”攻关项目，最大限度地运用已有积累，在非常短的时间内，在自制的芯片仪和芯片上用自己设计的聚合酶链反应试剂盒进行“非典”病毒的阳性和阴性对照测定，在未见同类报道的情况下，取得了重要的阶段性成果。从毛细管电泳研究到微流控芯片实验室的建立，十几年来，林炳承牢牢把握住学科的研究方向，带领课题组始终活跃在学术研究的前沿。林炳承所抓的研究方向，得到了国家自然科学基金委员会的高度重视和认同。1992年以来，他连续主持承担了国家自然科学基金8个项目，其中包括5个面上项目、2个重点项目和1个重大项目子课题。而正是在这个过程中，这个课题组形成了自己核心的和极具特色的积累

10、。“把握方向、长期坚持、强化积累、推动发展”，林炳承力图将这样一种理念贯穿于他长期的科学实践之中。撰稿人：邹淑英点评：1987年，林炳承先生由美国分析化学杂志将加强分析化学与生命科学结合的力度，萌生了以毛细管电泳研究为切入点进入生命科学领域的想法。20世纪90年代中前期，直面质疑，与国内外有关单位合作，不仅使毛细管电泳技术在苯丙酮尿症的诊断上取得重大突破，而且在毛细管电泳手性药物拆分研究方面取得一系列重要进展。在毛细管电泳技术达到顶峰时，林先生又凭借敏锐的科学直觉，适时把研究重点转到以医学诊断和药物筛选为目的的微流控芯片技术上，经过近几年努力，已取得重要的阶段性成果高效毛细管电泳技术及其在中药

11、分析中的应用中药有效成分的分析有其特殊复杂性，首先是中药品种繁多，不同品种间活性成分的含量相差悬殊；其次中药中有效成分还受产地、栽培、生长环境和采收季节等多种因素的影响。对于由多种中药组成的复方制剂，情况就更复杂了。目前用于中药成分分析的方法有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)等，其中HPLC最常用。但用HPLC进行中药成分分析常遇到一些问题，一是分析时间长、分离效率低，即使采用梯度洗脱技术也难以使某些成分完全分离；二是色谱柱容易被污染，而且污染后难于清洗，使柱的使用寿命缩短。近十几年来发展很快的高效毛细管电泳(HighPerformanceCapillary

12、Electrophoresis,HPCE)是一种高效分离分析技术，它具有高效(每米理论塔板数在105以上)、快速(分析时间一般为十几分钟至几十分钟)、进样体积小(一般为nL级)、溶剂消耗少和抗污染能力强等特点，不仅广泛用于生物大分子如核酸、多肽和蛋白质等的分析，在中药有效成分的分析方面也显示出一定的优势。本文对HPCE的原理及其在中药分析中的应用情况进行了综述。1HPCE的原理HPCE是从传统电泳发展而来的，它以高压(可达30kV)下产生的强电场为驱动力，以小内径的石英毛细管(常用2070m，有效长度5075cm)为分离通道，依据各组分之间电泳淌度或分配系数的差异实现分离。在实际工作中，结合传

13、统电泳的工作方式与色谱技术的特点形成以下几种分离模式：毛细管区带电泳(CapillaryZoneElectrophoresis,CZE)、胶束动电毛细管色谱(MicellarElectrokineticCapillaryChromatography,MECC)、毛细管等速电泳(CapillaryIsotachophoresis,CITP)、毛细管凝胶电泳(CapillaryGelElectrophoresis,CGE)、毛细管等电聚焦电泳(CapillaryIsoelectricFocusing,CIEF)及近年刚刚兴起的毛细管电色谱(CapillaryElectrochromatograph

14、y,CEC)。其中应用较多的是CZE和MECC，也有CITP应用的报道。此外，以有机溶剂代替水配制缓冲溶液的非水毛细管电泳(NonaqueousCapillaryElectrophoresis,NACE)也有初步的应用报道。本文重点介绍CZE和MECC模式。1.1CZE当缓冲溶液的pH大于4时，毛细管内壁带上负电荷，相应地缓冲溶液带上正电荷，形成双电层。在高电场的作用下，溶液相对于毛细管壁向负极方向移动，这就是电渗流(EOF)，EOF在HPCE中有重要意义。溶液中带正电荷的粒子，它的运动方向与EOF相同，所以首先洗脱；中性粒子随EOF一起移动；带负电荷的粒子运动方向与EOF相反，在EOF的作用

15、下最后流出毛细管柱。CZE中，离子的迁移顺序与所带电荷的类型(正、负)、荷电量的多少及离子半径的大小有关。需特别指出的是CZE不能分离中性粒子。CZE模式主要用于中药中一些能解离的成分的含量测定。1.2MECC在缓冲溶液中加入表面活性剂，可以将色谱技术和电泳技术结合起来，这结束了HPCE不能分离中性粒子的历史。以十二烷基硫酸钠(SDS)为例，它是一种阴离子表面活性剂，当其浓度高于临界胶束浓度(CMC)时形成带负电荷的胶束，胶束在电场的作用下向正极泳动。在中性和碱性情况下，EOF的速度比胶束迁移速度快，因此胶束的实际移动方向与EOF一致(指向负极)。待测粒子依据疏水性的不同在水相和胶束相之间进行

16、多次分配，其中疏水性强的中性粒子与胶束结合比较牢固，洗脱时间较长，就会与水溶性较好的中性粒子分离。在MECC中，中性粒子的分离机理只是它与胶束间的相互作用，而对于带电离子则同时有电泳迁移、静电作用、两相分配等多种分离机理。2HPCE在中药分析中的应用中药的有效成分种类繁多，HPCE首先应用于生物碱、黄酮苷类成分的分析，继而推广到香豆素类、强心苷、皂苷类、有机酚酸类等非挥发性成分的分析。本文从中药材有效成分分析和中药制剂成分分析两方面来进行归纳总结。2.1中药材有效成分的分析中药材的有效成分多为生物碱类、黄酮类、有机酸类、香豆素类及各种苷类，这些成分都可以用HPCE法进行分析。已经研究过的中药材

17、有麻黄、黄连、黄柏、黄芩、芍药、大黄、甘草、柴胡、厚朴、当归、马钱子、丹参、吴茱萸、淫羊藿等。2.1.1生物碱类生物碱类成分能解离带上正电荷，一般用CZE模式分析。Liu等和朱萱萱等建立了测定麻黄中6种生物碱：麻黄碱、伪麻黄碱、去甲麻黄碱、去甲伪麻黄碱、甲基麻黄碱、甲基伪麻黄碱的CZE方法。对不同品种麻黄中生物碱的含量和麻黄炮制方法进行研究，结果表明草麻黄中总生物碱含量较高，经闷润法炮制后总生物碱的得率最高。Liu等还分析了黄连中的黄连碱、小檗碱、表小檗碱、巴马汀、非洲防己胺、药根碱、5-羟基小檗碱、木兰花碱等，13min内可将上述8种生物碱完全分离。张国华等用均匀设计法优化小檗碱、巴马汀、药

18、根碱的分离条件，最优分析条件是：60mmol.L-1磷酸氢二钠(pH7.0)-35%甲醇，14kV电压，30，分析时间6min。以0.5mol.L-1醋酸钠(pH4.6)-50%乙腈为电解液，9min内可分离黄柏中的6种生物碱：小檗碱、巴马汀、药根碱、木兰花碱、黄柏碱和小檗红碱。用此法分析市售的31种黄柏药材，发现威氏黄柏和日本黄柏中小檗碱含量约占总生物碱量的80%，而在关黄柏和川黄柏中仅为40%。为联用质谱(MS)以提高方法的灵敏度，Henion等以可挥发的醋酸铵(60mmol.L-1)与40%的甲醇组成电解液测定黄柏中的9种生物碱，当信噪比为3时检测限达910-61.310-15mol。A

19、kada等建立的CZE方法也能分离黄连和黄柏中的黄连碱、小檗碱和巴马汀。林梅等分离了4种莨菪类生物碱，即阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱和樟柳碱，并考察了在磷酸盐缓冲液中加入不同有机溶剂(甲醇、乙腈、四氢呋喃)对分离选择性的影响。生马钱子有剧毒，必须炮制后才能药用，Zong等以CZE测定了炮制前后马钱子中士的宁和马钱子碱的含量，结果表明炮制后2种生物碱的含量下降约90%，所以药性变得温和。长春花叶子中的长春新碱和长春碱的结构和pKa值都十分接近，需要较高浓度(0.2mol.L-1)的醋酸铵缓冲液才能分离。Stuppner等分析了绒毛钩藤根皮、花菱草和白屈菜中主要生物碱，外标法定量。分离白屈菜中生物碱

20、时，缓冲液中加入了12.5mmol.L-1-环糊精(-CD)，它能与待测物形成包合物，提高了分析的选择性。Zhang等分离了甜菜中的生物碱类成分，样品需柱前衍生化，电解液为50mmol.L-1磷酸盐缓冲液(pH3.5)。用MECC可同时分离吴茱萸碱、吴茱萸次碱和去氢吴茱萸碱等9种生物碱类成分，但去氢吴茱萸碱的峰拖尾严重；改以CZE分析去氢吴茱萸碱，柱效能达到1.89105塔板，拖尾因子为1.19，基本满足定量的要求。Sun等研究9种阿朴啉类生物碱的分离，由于它们结构十分相似，采用MECC模式，分析时间仅9min，与HPLC比约缩短一半。罂粟壳和鸦片中的生物碱主要为吗啡、可待因、罂粟碱、去甲基吗

21、啡、二甲基吗啡、诺司咳平等，目前已有用CZE、MECC和NACE等测定此类成分含量的报道。其中NACE为首次报道，文中考察了乙腈、甲醇、甲酰胺、N-甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲亚砜、二甲基甲酰胺等作为电解液溶剂的可能性。6种生物碱在乙腈、甲醇、甲酰胺和N-甲基甲酰胺作溶剂的条件下能完全分离，但在甲醇、甲酰胺和N-甲基甲酰胺FA和NMF中峰高明显下降，进一步考察乙腈-甲醇混合比对分离选择性的影响，13为最优。Unger等将场放大技术(FieldAmplifiedSampleInjection,FASI)用于生物碱的分析，具体做法是在电迁移进样(16kV，8s)之前进以一小段70%甲醇。实验得到

22、的灵敏度(LOD)比流体动力学进样1s高1000倍。他们建立的CZE方法适用于吲哚类生物碱及生物胺、原小檗类生物碱、-咔啉类生物碱和鸦片中异喹唑啉类生物碱的分离，选用的电解液为：100mmol.L-1醋酸铵(用醋酸调pH至3.1)-50%乙腈。2.1.2黄酮类黄酮类化合物有很多重要的生理活性，广泛存在于植物中，多用MECC模式分离。Aramendia等和Shihabi等以CZE分离了5种异黄酮。Liu等以MECC分离了黄芩中的黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素(Wogonin,W)、汉黄芩素-7-O-葡糖苷酸(WG)、木蝴蝶素A(oroxylinA,O)和木蝴蝶素A-7-O-葡糖苷酸(OG)。Morin

23、等研究了糖基不同的槲皮素糖苷的CZE分离，还比较了香叶木素、香叶木苷、香叶木素-7-O-葡糖苷、橙皮素、橙皮苷、蒙花苷(linarin)、异野漆树苷(isorhoifolin)等的CZE和MECC分离，认为黄酮苷能与硼砂形成带负电的络合物，依络合程度不同而达到分离，不含硼砂的电解液对黄酮苷无分离能力。Pietta等分离了洋接骨木花、金盏花、山金车花、银杏叶等中药中的芦丁、槲皮素、异槲皮素、山奈素等多种黄酮苷和苷元。他们还以pH8.5的硼砂-SDS缓冲液分离了心叶椴和阔叶椴叶子中的8种黄酮苷。Liang等对淫羊藿中的黄酮类化合物的分析进行了研究，以20mmol.L-1硼砂-48mmol.L-1S

24、DS-1mmol.L-11，3-二氨基丙烷(pH8.5)为电解液，20min内14种黄酮苷能完全分离，但淫羊藿苷(icariin)、淫羊藿糖苷B(epimedinB)和淫羊藿糖苷C(epimedinC)的峰部分重叠。根据它们的pKa值(均在10.7左右)，当电解液为30mmol.L-1硼砂-12mmol.L-1SDS(pH10.45)时能完全分离，以胆酸盐(35mmol.L-1)或十六烷基三甲基溴化铵(40mmol.L-1)作为表面活性剂，都能分离十字花科植物中的12种黄酮类化合物。2.1.3蒽醌类此类化合物结构中多有羟基和羧基，用CZE和MECC都能分析。宗玉英等将25mmol.L-13-环

25、己氨基-1-丙烷磺酸与25mmol.L-1SDS-乙腈(10010)混合作为电解液(pH10.96)可分离大黄中5种蒽醌类化合物，并测定掌叶大黄、唐古特大黄和藏边大黄中的芦荟大黄素、大黄素和大黄酸。Stuppner等以CZE分离测定了狭叶番泻叶和尖叶番泻叶中的番泻叶苷(sennoside)A、A1和B。2.1.4香豆素类Ochocka等以CZE分离了野菊花中7种香豆素类化合物，包括7-甲氧基香豆素(herniarin)、香豆素、伞形花内酯(umbelliferone)、香豆酸(coumarinicacid)、4-羟基香豆素(4-hydroxycoumarin)、6，7-二羟基香豆素(aescu

26、letin)和二氢香豆素(dihydrocoumarin)。Chen等以SDS为表面活性剂分析测定了独活中的9种香豆素类化合物，包括香豆素、伞形花内酯、补骨脂素(psoralen)、花椒毒素(xanthotoxin)、佛手柑茨烯(bergapten)、奥斯索(osthol)、哥伦比亚醇(columbianetin)、哥伦比亚醇乙酯(columbianetinacetate)和哥伦比亚内酯(columbianadin)。2.1.5酚酸类酚酸类成分解离后带负电荷，以CZE模式分析时在中性成分后出峰，分析时间较长。Jen等分离了14种酚酸类化合物。Chou等测定了厚朴中的和厚朴酚及厚朴酚的含量，最低

27、检测限分别为0.2ng和0.5ng。Kenndler等以0.1mol.L-1硼砂溶液(pH9.5)为电解液，分离熊果叶中的熊果酸、间苯二酚、氢醌和没食子酸。张凤云等测定了氯原酸的含量。Wojiechowski等研究了欧地笋的活性成分的代谢情况，测定了木犀草素(luteolin)、木犀草素-7-葡糖苷(luteolin-7-glycoside)、迷迭香酸(rosmarinicacid)、原儿茶醛、咖啡酸等成分。Liu等在电解液中加入阳离子表面活性剂十二烷基三甲基氯化铵(LTAC)，使EOF的方向翻转(指向正极)，出峰顺序为负离子、中性分子、正离子，这样酚酸类成分的分析时间就大大缩短了。Boyce

28、等在硼砂-磷酸盐缓冲液(pH8.5)中加入100mmol.L-1SDS，能同时分离21种酚酸类成分和香豆素类成分。CITP模式可用于酚酸类成分的分析。Seitz等以pH9.5的15mmol.L-1盐酸-30%甲醇-0.2%羟丙基甲基纤维素(HPMC)为前导电解液，pH10.6的10mmol.L-1甘氨酸-氢氧化钡-30%甲醇-0.2%HPMC为终末电解液，分析了咖啡酸、木犀草素、阿魏酸(ferulicacid)、氯原酸等酚酸类成分。沈红梅等以CITP测定了乌梅中柠檬酸(citricacid)和苹果酸(malicacid)的含量。2.1.6苷类及其它成分Iwagami等分离了7种人参皂苷Rb1、

29、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg等。Hsieh等在硼砂缓冲液(pH10.0)中加入30mmol.L-1SDS和10mmol.L-1-CD，成功地分离了5种柴胡皂苷a、d、c、b1、b2等。Honda等以CZE分离了芍药中的芍药苷、氧化芍药苷(oxypaeoniflorin,OPF)、甲基没食子酸盐、鞣酸和没食子酸。Wu等结合CZE和MECC(以胆酸钠为表面活性剂)分离了芍药中的伪麻黄碱、OPF、苯甲酸、丹皮酚、五倍酰葡萄糖(pentagalloylglucose,PG)、没食子酸、苯芍药苷(bezoylpaeoniflorin，BAF)、白花素(albiflorin,AF)等成分。在pH9

30、.3的硼砂-SDS缓冲液中加入7mol.L-1脲或25mmol.L-1胆酸钠都能分离毛花洋地黄中的强心苷类成分。Stuppner等以CZE分离了甜菜中的甜菜苷(betanin)、异甜菜苷(isobetanin)及苷元。Mauri等用MECC-MS分析了3种二萜糖苷(diterpeneglycoside)，电解液为20mmol.L-1硼砂-30mmol.L-1SDS(pH8.3)。Oehrle以25mmol.L磷酸盐-90mmol.L-1SDS为电解液，成功地分离了银杏叶提取物中的白果内酯(biobalide)、银杏内酯A(ginkolideA)和银杏内酯B(ginkolideB)，分析时间18

31、min。Hu等分离了紫丹参中的3种二萜醌类成分，即隐丹参酮(cryptotanshinone)、二氢丹参酮(dihydrotanshinone)和丹参酮A(tanshinoneA)。将多糖水解成单糖再衍生化后，以pH10.5的硼砂缓冲液为电解液可以测定洋甘菊和药蜀葵根中的糖类成分。紫杉醇(taxol，T)是一种二萜胺，具有抗癌作用，主要由红豆杉科植物的树皮中提取，Chan等以T、cephalomannine(C)和浆果赤霉素(baccatin，B)为指标，考察了松针替代树皮作为紫杉醇来源的可能性。王九一等以峰高定量测定紫杉醇样品含量，最低检测限为20g.mL-1。鬼臼毒素(podophyllo

32、toxin，P)和4-去甲基鬼臼毒素(4-desmethylpodophyllotoxin，DP)属木脂素类化合物，具有抗癌活性，以pH9.7的15mmol.L-1磷酸氢二钠-50mmol.L-1SDS-30%甲醇为电解液仅能使P和DP部分分离。Davis等对麦瓶草属植物中的脱皮素类(ecdysteroids)成分进行了分析。2.2中药复方制剂的成分分析中药复方制剂由多种药材组成，成分十分复杂。目前控制其质量的方法是测定其中一种或多种主要活性成分的含量，常用的分析手段是HPLC。在HPCE成功地用于中药材成分分析以后，很多分析工作者对多种成分的同时测定进行了深入研究。台湾的Liu等以CZE测定

33、19种含麻黄的中药制剂(小青龙汤、大青龙汤、清脾汤、麻黄汤等)中的麻黄碱和伪麻黄碱的含量，分析时间仅3min，回收率98.0%102.3%；以0.2mol.L-1醋酸钠-50%乙腈为电解液测定23种黄连或黄柏制剂(黄连汤、清胃汤、芍药汤、排毒散、白头翁汤等)中的黄连碱、小檗碱和巴马汀的含量，回收率98.0%101.9%；以CZE测定甘草及开胃芍药散、桂皮汤、排毒散等中甘草酸和甘草次酸含量，回收率为98.1%101.4%；还测定了5种中药制剂中甘草酸和肉桂酸的含量；用反向EOF-CZE方法分离当归散中的烟酸、阿魏酸和苯二甲酸，仅需3min。对于中药制剂来说应用得更多的是MECC模式。Liu等以M

34、ECC成功地分离了柴芩汤、小柴胡汤、三黄泻心汤、芍药汤等汤剂中的黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和汉黄芩素-7-O-葡糖苷酸。Lu等测定了13种中药复方中的苦杏仁苷(amygdalin)及普济消毒饮中的6种黄酮苷和4种生物碱类成分。他们还测定了大黄及制剂中的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、番泻叶苷A和B等成分。Sheu等对中药制剂中多种有效成分的同时测定进行了深入研究，测定了小承气汤(大黄、枳实、厚朴)中的柚皮苷、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素、番泻叶苷A和B，以及三黄泻心汤(黄连、黄芩、大黄)中的小檗碱、巴马汀、黄芩苷、大黄素、番泻叶苷A和B；对I-tzu-tang(升麻、柴胡、甘草、黄芩、大黄、当归)中的大

35、黄素、芦荟大黄素、番泻叶苷A和B、黄芩苷、黄芩素、OG、WG、W、阿魏酸、咖啡酸、甘草酸等12种活性成分进行分析，运行时间仅14min；结合CZE和MECC分析测定了变通丸和甘露散(黄连、吴茱萸)中的7种黄连生物碱、4种吴茱萸生物碱和6种喹诺酮类生物碱。Huang等测定了桂枝汤(桂枝、白芍、甘草、干姜、大枣)中肉桂醛(cinnamaldehyde)、肉桂酸、芍药苷、甘草酸和6-姜辣素(6-gingerol)等成分的含量，还测定了柴胡散和小柴胡汤中5种柴胡皂苷的含量。Iwagami等测定了葛根汤等6种制剂中的甘草酸，以及加味逍遥散等4种中成药中的甘草酸和芍药苷。Kang等以CZE测定了中药制剂中

36、的小檗碱、肉桂酸和甘草酸。张国华等也以CZE测定了香连丸、二妙丸、白带丸、牛黄上清丸、黄连上清丸、朱砂安神丸等成药中的小檗碱、巴马汀、药根碱等成分的含量。3展望HPCE在中药成分分析中的应用虽然起步较晚，但发展十分迅速。目前应用范围已从生物碱、黄酮及其苷类扩展到香豆素类、各种苷类、酚酸类等多种成分。HPCE可作为中药材的鉴别和标准品的纯度检查的方法。胡平等用CZE对不同品种菟丝子中的植物蛋白进行鉴别。Iwagami等对购得的番泻叶苷A标准品进行纯度检查，结果纯度为93.6%99.2%。很多研究者致力于活性成分含量测定方法的建立，并对药材来源(品种、产地)制剂工艺(提取方法、炮制方法)及体内代谢

37、进行了广泛的研究。一些新技术也应用于这一领域，如场放大进样技术(FASI)能提高方法的灵敏度，NACE可改变分离的选择性，CE-MS联用可以在定量的同时对每种成分进行结构解析。另外，新出现的CEC模式结合CE的高效和HPLC的高选择性，将会在中药分析中得到有效的应用。综上所述，HPCE作为一种高效、快速、简便的分离技术，在中药分析领域大有可为，它必将在推动中药走向世界的进程中作出巨大贡献。毛细管电泳技术发展及应用前景毛细管电泳技术（Capillary Electrophoresis, CE）又称高效毛细管电泳（HPCE）或毛细管分离法（CESM），毛细管电泳方法虽新工艺，但历史悠久，它是在电泳

38、技术的基础上发展的一种分离技术。电泳作为一种技术出现，已有近百年的历史，但真正被视为一种在生物化学中有重要意义的技术，是由1937年A. Tiselius 首先提出。传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热，1967年Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳（Capillary Zone Electro-phoresis, CZE）。但他没有完全克服传统电泳的弊端。现在所说的毛细管电泳技术（CE）是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他们使用了75mm的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳，

39、开创了毛细管电泳的重要分支：胶束电动毛细管色谱（MEKC）。1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。同年，Cohen发表了毛细管凝胶电泳的工作。近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的应用范围。 当电泳从凝胶板上移到毛细管中以后，发生了奇迹般的变化：分析灵敏度提高到能检测一个碱基的变化，分离效率达百万理论塔片数；分析片段能大能小，小到分辨单个核苷酸的序列，大到分离Mb到DNA；分析时间由原来的以小时计算缩减到以分、秒计算。CE可以说是经典电泳技术与现代微柱分离技术完美结合的产物。它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃

40、至单分子分析成为可能。长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。毛细管电泳技术是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术，迅速发展于80年代中后期，它实际上包含电泳技术和色谱技术及其交叉内容，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使细胞分析，乃至单分子分析成为可能。是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，是近几年来分析化学中发展最为迅速的领域之一。毛细管电泳技术的基本原理是根据在电场作用下离子迁移的速度不同而对组分进行分离和分析，以两个电

41、解槽和与之相连的内径为20100m的毛细管为工具，毛细管电泳所用的石英毛细管柱，在 pH3的情况下，其内表面带负电，和缓冲液接触时形成双电层，在高压电场的作用下，形成双电层一侧的缓冲液由于带正电荷而向负极方向移动形成电渗流。同时，在缓冲液中，带电粒子在电场的作用下，以不同的速度向其所带电荷极性相反方向移动，形成电泳，电泳流速度即电泳淌度。在高压电场的作用下，根据在缓冲液中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异，带正电荷的分子、中性分子和带负电荷的分子依次流出，带电粒子在毛细管缓冲液中的迁移速度等于电泳淌度和电渗流的矢量和，各种粒子由于所带电荷多少、质量、体积以及形状不同等因素引起迁移速度不同而实

42、现分离；在毛细管靠负极的一端开一个视窗，可用各种检测器。目前已有多种灵敏度很高的检测器为毛细管电泳提供质量保证，如紫外检测器（UV）、激光诱导荧光检测器（LIF）、能提供三维图谱的二极管阵列检测器（DAD）以及电化学检测器（ECD）。由于毛细管的管径细小、散热快，即使是高的电场和温度，都不会向常规凝胶电泳那样使胶变性，影响分辨率。 毛细管电泳技术的分离模式和检测模式的发展同样也是多方面的，经典的分离模式有毛细管区带电泳、毛细管胶束电动色谱、毛细管凝胶电泳等；新方法的发展研究难度大，但近年来却有不小的进展，其中建立新的分离模式和联用技术最为突出。比如建立了阵列毛细管电泳（CAE），亲和毛细管电泳

43、技术（ACE），芯片毛细管电泳（CCE），非水毛细管电泳技术（NACE）；本文作者尝试将分子信标技术与毛细管电泳技术相结合进行基因检测，取得较满意效果；国外已开始探索利用CE对PCR产物作DNA单链构象多态性（single strand conformation polymorphism, SSCP）分析筛查点突变。毛细管电泳技术发展迅速，是色谱最活跃的领域之一。毛细管电泳技术分离模式主要有以下几种。（1）毛细管区带电泳（Capillary Zone Electrophoresis, CZE）用以分析带电溶质。为了降低电渗流和吸附现象，可将毛细管内壁涂层。CZE是最基本也是最常见的一种操作模式

44、，应用范围最广，可用于多种蛋白质、肽、氨基酸的分析。（2）胶束电动毛细管色谱（Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography, MECC）在缓冲液中加入离子型表面活性剂如十二烷基硫酸纳，形成胶束，被分离物质在水和胶束相（准固定相）之间发生分配并随电渗流在毛细管内迁移，达到分离。MECC是唯一一种既能用于中性物质的分离又能分离带电组分的CE模式。（3）毛细管凝胶电泳（Capillary Gel Electrophoresis, CGE）在毛细管中装入单体，引发聚合形成凝胶。CGE分凝胶和无胶筛分两类，主要用于DNA、RNA片段分离和顺序、PCR产

45、物分析及蛋白质等大分子化合物的检测。（4）亲和毛细管电泳，在毛细管内壁涂布或在凝胶中加入亲和配基，以亲和力的不同达到分离。可用于研究抗原-抗体或配体-受体等特异性相互作用。（5）毛细管电色谱，（Capillary Electrochromatography, CEC）是将高效液相色谱（HPLC）的固定相填充到毛细管中，或在毛细管内壁涂布固定相，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程。此模式兼具电泳和液相色谱的模式。（6）毛细管等电聚焦电泳（Capillary Isoelectric Focusing, CIEF）是通过内壁涂层使电渗流减到最小，在两个电极槽分别装酸和碱，加高电压后，在毛细管内壁建立p

46、H梯度，溶质在毛细管中迁移至各自的等电点，形成明显区带。聚焦后，用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值使溶质通过检测器。CIEF已经成功用于测定蛋白质等电点，分离异构体等方面。（7）毛细管等速电泳，（Capillary isotachophoresis, CITP）采用先导电解质和后继电解质，使溶质按其电泳淌度不同得以分离。（8）CE/MS联用，CE的高效分离与MS的高鉴定能力结合，成为微量生物样品，尤其是多肽、蛋白质分离分析的强有力工具。可提供分子量及结构信息，适于目标化合物分析或窄质量范围内扫描分析，如多环芳香碳氢化合物（PAH）、寡聚核苷酸分析等。毛细管电泳技术兼有高压电泳及高效液相色

47、谱等优点，其突出特点是：（1）所需样品量少、仪器简单、操作简便。（2）分析速度快，分离效率高，分辨率高，灵敏度高。（3）操作模式多，开发分析方法容易。（4）实验成本低，消耗少。（5）应用范围极广。 毛细管电泳技术可检测多种样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液或组织及其实验动物活体实验；且可分离分析多种组分，如核酸/核苷酸、蛋白质/多肽/氨基酸、糖类/糖蛋白、酶、碱氨基酸、微量元素、小的生物活性分子等的快速分析，以及DNA序列分析和DNA合成中产物纯度测定等，甚至可用于碱性药物分子及其代谢产物、无机及有机离子/有机酸、单细胞分析、药物与细胞的相互作用和病毒的分析，如在缓冲液中加入表面活

48、性剂则可用于手性分离中性化合物。毛细管电泳技术不仅在基础科学中得到广泛应用，在临床医学等领域的应用也有较多应用。如临床疾病诊断、临床蛋白分析、临床药物监测、代谢研究、病理研究、同工酶分析、PCR产物分析、DNA片段及序列分析等。随着人类基因组计划的实施，人类基因组计划的完成比预期时间一再提前，其主要工具是毛细管电泳仪。但是人类基因组图谱并没有告诉我们所有基因的“身份”以及它们所编码的蛋白质。人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色，其中可能藏着开发疾病诊断方法和新药的“钥匙”。“后基因时代”，一个以“蛋白质组”为重点的生命科学的新时代到来，需要对蛋白质更多的研究，毛细管电泳技术将发挥更大的作用。在医学研究中毛细管电泳技术越来越受到重视，但其临床应用尚属起步阶段，随着毛细管电泳技术的不断发展和完善，CE将在临床研究和基础研究