实验八-细胞内溶酶体和线粒体的荧光标记综述优秀PPT.ppt

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1、细胞内溶酶体和线粒体的荧光活体染色试验原理Mito-TrackerGreen是一种线粒体(mitochondria)绿色荧光探针，可以用于活细胞线粒体特异性荧光染色。Mito-TrackerGreen为接受MolecularProbes公司的carbocyanine进行了荧光标记的一种Mito-Tracker，分子量为671.88，可以用作线粒体特异性的荧光探针。和rhodamine123或JC-1相比，Mito-TrackerGreen对于线粒体的染色不依靠于线粒体膜电位。试验原理Lyso-TrackerRed是一种溶酶体(lysosome)红色荧光探针，可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色。

2、Lyso-TrackerRed为接受MolecularProbes公司的DND99进行了荧光标记的带有弱碱性的荧光探针，可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。中性红(NeutralRed)和吖啶橙(AcridineOrange)也都可以对溶酶体进行荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。1.1.试验目的试验目的 驾驭荧光显微镜工作的原理了解细胞器在细胞内的分布了解荧光染料的运用方法Lyso-TrackerRed工作液的配制：a.取少量Lyso-TrackerRed依据1:13333-1:20000的比例加入到细胞培育液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS

3、)中，使最终浓度为50-75nM。例如取1lLyso-TrackerRed加入到20ml或13.33ml细胞培育液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中。2.溶溶酶酶体的体的荧荧光光标记标记：a.去除去除细细胞培育液，加入步胞培育液，加入步骤骤1配制好的并配制好的并28预预温育温育的的Lyso-Tracker Red染色工作液，与染色工作液，与细细胞胞28共孵育共孵育30分分钟钟。b.去除去除Lyso-Tracker Red染色工作液，加入染色工作液，加入500微升微升预预温温的簇新的的簇新的细细胞培育液或胞培育液或PBS漂洗。漂洗。c.取出盖玻片，在取出盖玻片，在载载玻片上滴一滴玻片上滴

4、一滴PBS，将盖玻片反扣，将盖玻片反扣在在载载玻片上，玻片上，荧荧光光视视察察d.用用荧荧光光显显微微镜镜或激光共聚焦或激光共聚焦显显微微镜进镜进行行视视察。此察。此时时可可视视察到溶察到溶酶酶体呈光明的体呈光明的强强荧荧光染色。假如染色效果欠佳，光染色。假如染色效果欠佳，可以提高可以提高Lyso-Tracker Red染色工作液中染色工作液中Lyso-Tracker Red的的浓浓度或在度或在举举荐的荐的时间时间范范围围内适当延内适当延长长染色染色时间时间。运用说明：1.Mito-TrackerGreen储存液的配制：用无水DMSO(anhydrousdimethylsulfoxide)配制

5、Mito-TrackerGreen至终浓度为1mM。配制后可以-20或更低温度避光保存。2.Mito-Tracker Green工作液的配制：工作液的配制：a.取少量取少量1mM Mito-Tracker Green储储存液依存液依据据1:5000-1:50000的比例加入到的比例加入到细细胞培育液胞培育液或适当的溶液或适当的溶液(例如含例如含钙镁钙镁离子的离子的HBSS)中，使最中，使最终浓终浓度度为为20-200nM。例如取。例如取1l Mito-Tracker Green加入到加入到50ml或或5ml细细胞培育液或适当的溶液胞培育液或适当的溶液(例如含例如含钙镁钙镁离子的离子的HBSS)

6、中。混匀后即中。混匀后即为为Mito-Tracker Green工工作液。作液。HBSS with Ca2+&Mg2+(C0219)可以可以向碧云天向碧云天订购订购。b.Mito-Tracker Green工作液运用前需工作液运用前需28预预温育。温育。注：工作液中注：工作液中Mito-Tracker Green的的浓浓度可以依据度可以依据实际实际状况状况进进行行适当适当调调整。整。为为降低背景，在染色效果可以接受的范降低背景，在染色效果可以接受的范围围内，建内，建议议尽量运用尽量运用较较低低浓浓度的度的Mito-Tracker Green。3.线线粒体的粒体的荧荧光光标记标记：a.去除去除细

7、细胞培育液，加入步胞培育液，加入步骤骤2配制好的并配制好的并28预预温育的温育的Mito-Tracker Green染色工作液，与染色工作液，与细细胞胞28共孵育共孵育15-45分分钟钟。b.去除去除Mito-Tracker Green染色工作液，加入染色工作液，加入500微升微升28预预温育温育的簇新的簇新细细胞培育液或胞培育液或PBS漂洗。漂洗。c.取出盖玻片，在取出盖玻片，在载载玻片上滴一滴玻片上滴一滴PBS，将盖玻片反扣在，将盖玻片反扣在载载玻片玻片上，上，荧荧光光视视察。察。d.用用荧荧光光显显微微镜镜或激光共聚焦或激光共聚焦显显微微镜进镜进行行视视察。此察。此时时可可视视察到察到线

8、线粒体呈光明的粒体呈光明的强强荧荧光染色。假如染色效果欠佳，可以提高光染色。假如染色效果欠佳，可以提高Mito-Tracker Green染色工作液中染色工作液中Mito-Tracker Green的的浓浓度或在度或在举举荐的荐的时间时间范范围围内适当延内适当延长长染色染色时间时间。1 1 打开可将光和激发光光源打开可将光和激发光光源（预热（预热1010分钟）分钟）2 2遮光板遮住激发光遮光板遮住激发光3 3 选择选择“1”“1”，在可见光下，在可见光下，聚焦，视察清晰图像，再调聚焦，视察清晰图像，再调到高倍镜下，微调至清晰到高倍镜下，微调至清晰4 4 关掉可见光光源，打开遮关掉可见光光源，打开遮光板，让激发光透过光板，让激发光透过5 5 选择选择“G”“G”视察红色荧光视察红色荧光6 6 选择选择“B”“B”视察绿色荧光视察绿色荧光