黑曲霉基因组与柠檬酸生产菌种改造.ppt

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1、黑曲霉基因组简介黑曲霉基因组简介和和柠檬酸菌种改造初步方案柠檬酸菌种改造初步方案孙际宾孙际宾李寅李寅中国科学院工业生物技术研究所(筹)实例：基因组重测指导赖氨酸高产菌株构建实例：基因组重测指导赖氨酸高产菌株构建Ohnishi et al.2002比较基因组学比较基因组学3个点突变个点突变野生野生型菌株：型菌株：080g/l50h27h1.1.解密黑曲霉解密黑曲霉基因组基因组Nick Read 1991黑曲霉测序大事记黑曲霉测序大事记.荷兰帝斯曼DSM公司启动了对其拥有的黑曲霉菌株的测序计划，采用BAC加shortgun法.测序完成，8倍覆盖率，500 contigs，万基因大约同时，Integ

2、rated Genomics 完成对黑曲霉菌株ATCC 9029测序，4X，1万congtigs2006.美国能源部JGI完成对柠檬酸生产菌黑曲霉ATCC 1015测序，8X.DSM及合作伙伴在Nature Biotechnology上发表论文，对黑曲霉基因组进行系统阐述，并公布序列同期，JGI也公布其序列.德国HZI孙际宾等在Genome Biology杂志上发表论文，对其代谢网络进行比较分析，初步阐明黑曲霉累积柠檬酸的机理SFB578从基因到产品从基因到产品德国研究基金会DFG特别研究领域项目 2001启动，现在刚开始第三期德国HZI/TU Braunschweig主要研究对象:黑曲霉As

3、pergillus niger和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium 16-20个动态子项目子项目：代谢和调控网络的生物信息学黑曲霉黑曲霉CBS 513.88 基因基因组比较组学：揭示高产性状的分子基础比较组学：揭示高产性状的分子基础假设假设比较野生型与高产菌株发比较野生型与高产菌株发现差异现差异高产菌株之所以高高产菌株之所以高产的分子机理是什产的分子机理是什么么生产效率高生产效率高转化率高转化率高副产物少副产物少生长性能好生长性能好形态学优形态学优耐受性高耐受性高TimePHyperproduction mutantWild type strain转录组转录组蛋白组蛋白组代谢组

4、代谢组代谢流组代谢流组Interactome?组组基因组基因组用于比较分析的基因组（用于比较分析的基因组（20072007年）年）StrainAbbrev.size of proteomeBiological or biotechnological relevanceA.niger CBS 513.88ands14165柠檬酸和工业酶生产A.niger ATCC 9029anig13937工业酶生产A.niger ATCC 1015anjg11200柠檬酸生产A.oryzaeaor12059food and beverageA.fumigatusafm9923pathogenic and al

5、lergenic A.nidulansani9541model for genetics and cell biologyF.graminearumfgra11640plant pathogenM.griseadmgr11109plant pathogenN.crassadncr10620model for geneticsS.cerevisiaesce5863food,beverage,and model organismAnd other 12 eukaryotes曲霉属基因组曲霉属基因组20092009Aspergillus(Emericella)nidulansAspergillus

6、aculeatusAspergillus awamoriNBRC 4314Aspergillus carbonariusITEM 5010Aspergillus carbonariusITEM 5010Aspergillus clavatusNRRL1Aspergillus flavusAspergillus flavusNRRL3357Aspergillus flavusNRRL3357Aspergillus fumigatusA1163(CEA10)Aspergillus nidulansFGSC A26(biA1)Aspergillus nigerCBS 513.88Aspergillu

7、s nigerATCC 1015Aspergillus nigerATCC 9029Aspergillus parasiticusAspergillus terreusATCC 20542Aspergillus terreusNIH 2624Aspergillus terreus18个菌株已经个菌株已经被测序或正在被测序或正在进行测序进行测序Gene and pathways of protein secrectionGene and pathways of protein secrectionNERVEPGEntry into ERProcesses in ERProtein misfold

8、ingProtein complexes involved in protein transport Vesicle formation and dockingER to Golgi andintra-Golgi transportGolgi and post-Golgi protein sortingGlycosylationIn cooperation with B4 and the annotation team黑曲霉基因组测序和注释黑曲霉基因组测序和注释帝斯曼公司等帝斯曼公司等26个研究机构个研究机构合作合作全面的基因组注释全面的基因组注释33M 碱基对碱基对14165基因基因初步代谢

9、分析初步代谢分析详尽的蛋白质分泌途径详尽的蛋白质分泌途径Pel et al.(2007)Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger.Nature Biotechnology,25:221-231.重构黑曲霉基因组规模代谢网络重构黑曲霉基因组规模代谢网络重建黑曲霉代谢网络重建黑曲霉代谢网络999 EC numbers2443生化反应生化反应2349代谢物代谢物8倍于文献报道数据倍于文献报道数据柠檬酸产生相关代谢途径柠檬酸产生相关代谢途径提出基因冗余作为有机酸过量提出基因冗余作为有机酸

10、过量生产的自然机制生产的自然机制提出了提出了多个代谢工程靶位点多个代谢工程靶位点AOX和和CSSun et al.Genome Biology,2007,8:R182为什么黑曲霉生产柠檬酸供氧至关重要？为什么黑曲霉生产柠檬酸供氧至关重要？葡萄糖葡萄糖+2ADP+2NAD 2丙酮酸丙酮酸+2ATP+2NADH丙酮酸丙酮酸+CoA+NAD 乙酰乙酰CoA+NADH+CO2丙酮酸丙酮酸+ATP+CO2 草酰乙酸草酰乙酸+ADP乙酰乙酰CoA+草酰乙酸草酰乙酸 柠檬酸柠檬酸+CoA葡萄糖葡萄糖+ADP+3NAD 柠檬酸柠檬酸+ATP+3NADHATP ADP:生长，维持，穿膜运输，产热生长，维持，穿膜

11、运输，产热3H2O1.5O29ADP9ATP呼吸链呼吸链AOX-AOX-alternative mitochondrial alternative mitochondrial oxidoreductaseoxidoreductase 其他线粒体氧化还原酶其他线粒体氧化还原酶Citrate production:ATP and NADH excessiveAOXCytochrome/electron transfer chain independentcritical role in the citric acid productionKnockout/overexpression of the

12、 know AOX have no effect on citrate productionadditional and unique AOX now found in strains小结小结过量表达黑曲霉特异性的柠檬酸合成酶，可能会加快柠檬酸合成速度过量表达可能加强NADH的循环，从而消除瓶颈，加快柠檬酸产生速度 但是，并不能降低O2的消耗和热量的产生问题：问题：如何将如何将NADH循环而不消耗氧气和产生热量？循环而不消耗氧气和产生热量？2.2.柠檬酸生产菌株改造方案柠檬酸生产菌株改造方案q基因组测序作为分子改造基础基因组测序作为分子改造基础q阻断草酸合成阻断草酸合成q加快柠檬酸合成速度加快

13、柠檬酸合成速度q高温柠檬酸发酵菌种高温柠檬酸发酵菌种超高速基因组排序技术超高速基因组排序技术illumina/Solexa-每个机器排序周期（每个机器排序周期（5天）产生天）产生20GB 数据数据-相当于将黑曲霉测相当于将黑曲霉测70次次Roche 454 technology/FLX-小时将大肠杆菌排序小时将大肠杆菌排序20次次-材料费材料费 1万欧元万欧元 ABI/SOLiD未来数年内：未来数年内：人类基因组人类基因组1000$细菌基因组细菌基因组100$超高速、廉价超高速、廉价 Roche 454 technology比较野生型与生产菌株基因组，将比较野生型与生产菌株基因组，将鉴定更多的

14、靶点拷贝数、新酶酶的表达调控酶的构象与活性调控大大加快分子生物学改造工作大大其他系统生物学手段的应用，阐明高产机理，大幅度改造菌种 长期目标转录组、蛋白质组、代谢组2.2.柠檬酸生产菌株改造方案柠檬酸生产菌株改造方案q基因组测序作为分子改造基础基因组测序作为分子改造基础q阻断草酸合成阻断草酸合成q加快柠檬酸合成速度加快柠檬酸合成速度q高温柠檬酸发酵菌种高温柠檬酸发酵菌种草酸合成途径草酸合成途径草酰乙酸水解酶：草酰乙酸+水 草酸+乙酸exclusively produced via oxaloacetate(Kubicek et al.1988;Pedersen et al.2000a;Ruij

15、ter et al.1999)catalyzed by oxaloacetate hydrolase(EC 3.7.1.1).Pedersen et al.2000b：克隆了该酶基因oah，并随后证明将该酶缺失，则完全阻断草酸合成(Pedersen et al.2000a).生物信息学分析表明黑曲霉有至少8个基因与oah有同源性，不排除发生微量副反应的可能性实验方案：敲除实验方案：敲除oahoah基因基因难点：考虑柠檬酸的食品应用，基因敲除菌株不能包含有外源DNA片段策略：两次敲除野生型；野生型；第一次依靠同源重组将第一次依靠同源重组将oah大部分以抗大部分以抗性标记性标记+GFP蛋白替换，抗

16、性为选择标蛋白替换，抗性为选择标记；记；第二次同源重组将抗性基因和第二次同源重组将抗性基因和GFP以不以不完整的完整的oah基因替换，选择标记为菌落基因替换，选择标记为菌落颜色颜色oah抗性抗性GFPLRRLoah2.2.柠檬酸生产菌株改造方案柠檬酸生产菌株改造方案q基因组测序作为分子改造基础基因组测序作为分子改造基础q阻断草酸合成阻断草酸合成q加快柠檬酸合成速度，缩短加快柠檬酸合成速度，缩短发酵周期发酵周期q高温柠檬酸发酵菌种高温柠檬酸发酵菌种Black box gray box white boxMediumpH,pO2,rpmproductsX-OMICS+Dynamics+Regula

17、tion方案：加快柠檬酸合成速度，缩短发酵周期方案：加快柠檬酸合成速度，缩短发酵周期过量表达柠檬酸合成酶和第二个AOX将NADH导向有益的物质合成途径比较组学阐明机理，在野生型菌株基础上鉴定和整合更多突变计算生物学数据集成与分析计算生物学数据集成与分析;全细胞网络模型化全细胞网络模型化;理性代谢工程设计理性代谢工程设计系统生物技术菌种改造系统生物技术菌种改造流程流程系统代谢工程操作系统代谢工程操作转录组蛋白组代谢组代谢流组Interactome?组基因组实验室小试及工艺优化实验室小试及工艺优化中试放大、项目转让中试放大、项目转让高通量组学，定量描述细胞生理高通量组学，定量描述细胞生理野生型野生

18、型工业生产菌工业生产菌高通量筛选突变株高通量筛选突变株不同来源菌株不同来源菌株高通量筛选突变株高通量筛选突变株发酵过程组学测定发酵过程组学测定过程数据整合过程数据整合新型构建策略新型构建策略2.2.柠檬酸生产菌株改造方案柠檬酸生产菌株改造方案q基因组测序作为分子改造基础基因组测序作为分子改造基础q阻断草酸合成阻断草酸合成q加快柠檬酸合成速度加快柠檬酸合成速度q高温柠檬酸发酵菌种高温柠檬酸发酵菌种对对“急需高温发酵菌株急需高温发酵菌株”的理解的理解现有柠檬酸菌株在高温下可以生长但柠檬酸产生能力差由于发酵过程产生大量发酵热，必须连续移除才能控制发酵温度在合适水平（34度）由于冷却塔产生的冷却水与发

19、酵温度差别较小、换热效率低，特别是在炎热的夏天，造成控温换热消耗的动力（能耗）大这部分能耗占发酵成本相当大的比例方案：解决移除发酵热的能耗问题方案：解决移除发酵热的能耗问题控制发酵热产生的源头：不将NADH传递给氧，不产生过剩的热量对氧气需求减弱，节省供氧所需要的成本，包括简化反应器设计，降低搅拌能耗，降低空气压缩和预处理成本（可能产生额外的环境效益减排和产生额外的能源节能）选育高温发酵菌株40度正常发酵不能使用基于机理的定向改造的方法黑曲霉的传统诱变育种选用其他菌株，比如耐高温酵母高温发酵菌株的高通量筛选高温发酵菌株的高通量筛选全自动化：平皿制备、涂布、平板初筛、点种、液体接种、发酵、样品处理、分析高效率：几十万克隆每天黑曲霉基因组简介和黑曲霉基因组简介和柠檬酸菌种改造初步方案柠檬酸菌种改造初步方案孙际宾孙际宾李寅李寅中国科学院工业生物技术研究所(筹)-谢谢！谢谢！-