(完整word版)最新植物生理指标测定方法(word文档良心出品).pdf

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1、1 实验一植物叶绿素含量的测定（分光光度法）(张宪政，1992)一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯比尔定律，某有色溶液的吸光度A 与其中溶质浓度 C 和液层厚度 L 成正比，即 ACL式中：比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm 时，为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合

2、提取液中叶绿素a、b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素 a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a 和 b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。叶绿素a 和叶绿素 b 的比值反映植物对光能利用效率的大小，比值高则大，则反之。二、材料、仪器设备及试剂试剂：1）95%乙醇（或 80%丙酮）三、实验步骤称取剪碎的新鲜样品0.20.3g，加乙醇 10ml，提取直至无绿色为止。把叶绿体色素提取液倒入光径 1cm的比色杯内

3、，以 95%乙醇为空白，在波长 663nm和 645nm下测定吸光度。四、实验结果按计算丙酮法（Arnon 法）【可以用于丙酮乙醇混合法和80%丙酮提取法的计算】叶绿素 a的含量（mg/g）=（12.71 OD663 2.59 OD645）V/1000*W 叶绿素 b 的含量（mg/g）=(22.88OD645 4.67OD663)V/1000*W 叶绿素 a、b 的总含量（mg/g）=(8.04 OD663+20.29 OD645)V/1000*W 按 Inskeep公式叶绿素 a的含量（mg/g）=（12.63 OD663 2.52 OD645）V/1000*W 叶绿素 b 的含量（mg/

4、g）=(20.47OD645 4.73OD663)V/1000*W 叶绿素 a、b 的总含量（mg/g）=(7.90 OD663+17.95 OD645)V/1000*W 2 注：1、叶绿素a 和叶绿素b 的比值反映植物对光能利用率【1】比如阳生植物叶绿素a 和叶绿素b 的比值较大【2】阴生植物叶绿素a 和叶绿素b 的比值较小2、丙酮-熔点:-94；沸点:56.48；是一种无色透明液体，有特殊的辛辣气味易溶于水和甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、吡啶等有机溶剂.下一步实验方法比较【1】95%乙醇直接提取（）【2】95%乙醇加热提取（冯瑞云，1985）【3】无水酒精和 80%丙酮等体积混合提取实验二、不良

5、环境对植物细胞膜的伤害（(张宪政，1992)）一、原理植物组织在受到各种不利的环境条件（如干旱、低温、高温、盐渍和大气污染）危害时，细胞膜的结构和功能首先受到伤害，细胞膜透性增大。若将受伤害的组织浸入无离子水中，其外渗液中电解质的含量比正常组织外渗液中含量增加，组织受伤害越严重，电解质含量增加越多。用电导仪测定外渗液电导率的变化，可反映出质膜受伤害的程度。在电解质外渗透的同时，细胞内可溶性有机物也随之渗出，引起外渗液可溶性糖、氨基酸、核苷酸等含量增加，氨基酸和核苷酸对紫外光有吸收，对紫外分光光度计测定受伤害组织外渗液消光值，同样可反映出质膜受伤害的程度。用电导仪法和紫外法测定结果有很好的一致性

6、。二、方法步骤1、取样及处理采用电导法(张宪政，1992)：将选取的幼嫩叶片和成熟叶片剪下，包在密封袋内置于冰盒中带回实验室。将新鲜的叶样先用自来水轻轻冲洗叶片，除去表面沾污物，再用去离子水冲洗 12 次，用滤纸轻轻吸干叶片表面水分，称0.20.3 g 并剪成切段，放入50 mL 带塞试管中，加入 20 mL 去离子 H2O，浸没样品 45 h，各处理浸泡时间和测定温度一致，在室温下进行，用 DDs-11 型电导仪测其电导率，然后沸水浴 15 min，冷却至室温再测一次总电导率值。以相对电导率表示细胞质膜透性大小。2、计算：植物组织浸泡的电导率，特称外渗电导率，此测定方法称外渗电导率法。（1）

7、外渗电导率K（us/cm*g)=SQ=测定电导率/称取质量文档编码:CW3N2O8J9B7 HT6Y1E9L4Q2 ZC4Q6T6B9Z7文档编码:CW3N2O8J9B7 HT6Y1E9L4Q2 ZC4Q6T6B9Z7文档编码:CW3N2O8J9B7 HT6Y1E9L4Q2 ZC4Q6T6B9Z7文档编码:CW3N2O8J9B7 HT6Y1E9L4Q2 ZC4Q6T6B9Z7文档编码:CW3N2O8J9B7 HT6Y1E9L4Q2 ZC4Q6T6B9Z7文档编码:CW3N2O8J9B7 HT6Y1E9L4Q2 ZC4Q6T6B9Z7文档编码:CW3N2O8J9B7 HT6Y1E9L4Q2 ZC

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12、4Q6T6B9Z7文档编码:CW3N2O8J9B7 HT6Y1E9L4Q2 ZC4Q6T6B9Z7文档编码:CW3N2O8J9B7 HT6Y1E9L4Q2 ZC4Q6T6B9Z7文档编码:CW3N2O8J9B7 HT6Y1E9L4Q2 ZC4Q6T6B9Z7文档编码:CW3N2O8J9B7 HT6Y1E9L4Q2 ZC4Q6T6B9Z7文档编码:CW3N2O8J9B7 HT6Y1E9L4Q2 ZC4Q6T6B9Z7文档编码:CW3N2O8J9B7 HT6Y1E9L4Q2 ZC4Q6T6B9Z7文档编码:CW3N2O8J9B7 HT6Y1E9L4Q2 ZC4Q6T6B9Z7文档编码:CW3N2O

13、8J9B7 HT6Y1E9L4Q2 ZC4Q6T6B9Z7文档编码:CW3N2O8J9B7 HT6Y1E9L4Q2 ZC4Q6T6B9Z7文档编码:CW3N2O8J9B7 HT6Y1E9L4Q2 ZC4Q6T6B9Z7文档编码:CW3N2O8J9B7 HT6Y1E9L4Q2 ZC4Q6T6B9Z73 或K（us/cm*g*ml）=SQ=测定电导率/称取质量*量取体积（2）相对电解质渗出率.电解质渗出率（%）=L1（浸泡液电导率）/L2（煮沸后电导率）100 电解质渗出率(%)=L1(浸泡液电导率)-本底电导率/L2（煮沸后电导率）-本底电导率 100 式中：L1：组织杀死前外渗液的电导值；L2

14、 组织杀死后外渗液的电导值。注：1、事先测定水的电导率2、用吸水纸吸干探头的水分实验三植物体内游离脯氨酸含量的测定一、目的在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。二、原理磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中

15、。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。三、材料、仪器及试剂1.试剂及配制：（1）2.5酸性茚三酮溶液配制：将 1.25g 茚三酮溶于30ml 冰醋酸和 20ml 6mol L1磷酸中（原液稀释 2.3 倍），搅拌加热（70）溶解，贮于 4冰箱中，2-3 日有效。（2）3磺基水杨酸配配制：3.496g 磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。（3）10gml-1 脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量

16、蒸馏水溶解，再倒入200ml 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100gml1 脯氨酸母液），再吸取该溶液 10ml，加蒸馏水稀释定容至100ml，即为 10gml-1 脯氨酸标准液。四、实验步骤文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3

17、D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S

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23、管含量为012g 的脯氨酸标准液。加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却。以去离子水溶液为空白对照，在520mm 波长处测定吸光度（A）值。1.3标准曲线的绘制以 15 号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。2.样品的测定2.1 脯氨酸的提取称取 0.2 0.3g 叶片于 20ml 试管+10ml 3 磺基水杨酸溶液沸水浴10min（提取过程中要经常摇动）冷却过滤于干净的试管中脯氨酸提取液。2.2 测定吸取酶提取液 2ml+2ml H2O+2ml 冰醋酸+4ml 2.5 酸性茚三酮沸水浴30min溶液呈红色冷却取上层液于比色杯520mm 处测定吸光度（A）值。五

24、、计算结果从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：X提取液总量（ml）脯氨酸含量（gg1Fw）样品鲜重（g）测定时提取液用量（ml）公式中：X 从标准曲线中查得的脯氨酸含量（g）试剂管号0 1 2 3 4 5 10gml-1 脯氨酸标准液（ml）蒸馏水（ml）冰醋酸（ml）3%磺基水杨酸2.5 酸性茚三酮（ml）0 2 2 2 4 0.2 1.8 2 2 4 0.4 1.6 2 2 4 0.6 1.4 2 2 4 0.8 1.2 2 2 4 1.0 1.0 2 2 4 每管脯氨酸含量（g）0 2 4 6 8 10 文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T

25、1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5

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31、K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D75 实验四植物体内丙二醛含量的测定一、原理丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，通常利用 硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5三

32、甲基恶唑 2、4二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织中 MDA 时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在 532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为 10030

33、0gg1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入 Fe3的终浓度为 0.5nmol L 1。在 532nm、600nm和 450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。二、实验步骤（1）提取采用硫代巴比妥酸显色法（赵世杰等，2002）。称取0.2 0.3 g样品，加10%三氯乙酸 2 mL和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml 三氯乙酸进一步研磨，匀浆后4000 rpm，离心 10min。（2）显色取上清液 5 mL，加0.6%TBA 5 mL，混合后在 100水浴上煮沸 30 min，迅速在冰浴上冷却后再离心一次。分别测定上清液在450nm、532 nm和600 nm处的吸光度值，方法一

34、：MDA 质量摩尔浓度(nmol/g)=(A532-A600)VZ V1/(0.155W V2)式中：VZ:反应液总量(4 mL)；V1:提取液体积(10 mL)；V2:测定用用提取液量(2 mL)；W:取样叶鲜重(g)0.155:为MDA 的消光系数（nmol/l）方法二：方程组：A450=（85.4103）C 糖文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 H

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40、档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2

41、Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D76（A532A600）=（155103）CMDA+（7.4103）C 糖解得：A450 C 糖=11.71A450（mmolL1）85.4103 CMDA=6.45（A532A600）0.56A450（molL1）公式中：A450在 450nm 波长下测得的吸光度值A532在 532nm波长下测得的吸光度值A600在 600nm波长下测得的吸光度值 1.55105为摩尔比吸收系数C 糖、CMDA 分别是反应混合液中可溶性糖、MDA 的浓度。1.按下式计算提取液中MDA 浓度反应液体积（ml）CMDA 1000 提取液中 MDA 浓度（mol

42、ml1）=测定时提取液用量（ml）2.按下式计算样品中MDA 含量提取液中 MDA 浓度（molml1）提取液总量（ml）MDA 含量（molg1 Fw）=植物组织鲜重（g）试剂：1、10三氯乙酸：称取三氯乙酸55.5556g 加水溶解定容至 500ml 2、0.6 硫代巴比妥酸（用10三氯乙酸配制）：称 0.6707g TBA 用少量 1mol/L 氢氧化钠溶解后加 10TCA溶解定容至 100ml（4贮存）文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S

43、8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T

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45、Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S

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48、W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT

49、5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D7文档编码:CT5S4S8Q2Z2 HL4K10T1L1I4 ZI1F3W5Y3D77 实验五、SOD 活力测定(NBT 还原法)植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的自由基

50、主要有超氧自由基（O2）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸（VC）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2、H2O2、OH.和 O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。超氧自由基（O2.）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质