《ALT活性测定》PPT课件.ppt

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1、 血清血清ALTALT活性的测定活性的测定生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室【实验目的实验目的】1 1掌握血清掌握血清ALTALT活性测定的基本原理。活性测定的基本原理。2 2了解血清了解血清ALTALT的测定方法的测定方法(赖氏法赖氏法)及临床意义。及临床意义。【实验原理实验原理】丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶(ALT)(ALT)，又称谷丙转氨酶又称谷丙转氨酶(GPT)(GPT)，在在3737、的条件下，可、的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与催化基质（底物）液中的丙氨酸与-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的生

2、成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,42,4二硝基苯肼发生加成反应，二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸生成丙酮酸-2,4-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALTALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中便可算出或通过标准曲线查出血清中ALTALT的活性。的活性。尽管基质液中余下的尽管基质液中余下的-酮戊

3、二酸同样可生成红棕色苯腙硝酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm505nm的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法。监测法的单位

4、使用赖氏法。19811981年全国常规生化检验方法年全国常规生化检验方法学术讨论会认为赖氏法测定学术讨论会认为赖氏法测定ALTALT活性较为合理，全国肝炎活性较为合理，全国肝炎协作会议也建议统一使用改良赖氏法。协作会议也建议统一使用改良赖氏法。ALTALT活性测定主要有活性测定主要有两类方法：两类方法：一是卡门氏（一是卡门氏（KarmanKarman）分光光度法）分光光度法，测定的是酶促反应速率。其原理，测定的是酶促反应速率。其原理如下：如下：由于由于NADHNADH在波长在波长340nm340nm处有特异吸收峰，因此处有特异吸收峰，因此ALTALT的活性可通过的活性可通过NADHNADH的减

5、少量，亦即通过的减少量，亦即通过340nm340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。吸光度的减少量间接作出定量测定。这一方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测酶这一方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测酶ALTALT的底物外，的底物外，还需要加入指示酶还需要加入指示酶LDHLDH及其辅酶及其辅酶NADHNADH，又需用紫外分光光度计，因，又需用紫外分光光度计，因此不易为一般临床化验室推广。此不易为一般临床化验室推广。【方法评价方法评价 】丙酮酸丙酮酸+NADH+H+NADH+H+乳酸乳酸+NAD+NAD+LDHLDH 二是比色测定法，二是比色测定法，如：金氏法（如：金氏法（KingKi

6、ng法）、穆氏法法）、穆氏法（Mohun Mohun 法）和赖氏法（法）和赖氏法（Reitman-FrankelReitman-Frankel法）。其原理、试剂、法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。不同之处在于作用时间：操作步骤及作用温度等完全相同。不同之处在于作用时间：KingKing法法60min 60min，MohunMohun法和法和 ReimanReiman法法30min30min。因此它们的单位。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。定义和标准曲线制备也不同。赖氏法没有制定自身的单位定赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的义，而是

7、以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1 1个个卡门氏单位卡门氏单位的定义是：在温度的定义是：在温度2525，波长，波长340nm340nm，光径，光径1cm1cm的条件下，的条件下，1ml1ml血清使血清使NADHNADH的吸光度下降的转氨酶活性。的吸光度下降的转氨酶活性。可可见卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是用物质的吸光度表见卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位若将卡门氏单位的定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系：的换算关系：1 1卡门氏

8、单位卡门氏单位=0.4821 IU/L(25)=0.4821 IU/L(25)。改原赖氏法的反应温度改原赖氏法的反应温度(40(40改为改为37)37)和底物浓度和底物浓度(改为低改为低浓度浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较为一致，能较好反映酶的真实活性。为一致，能较好反映酶的真实活性。由于赖氏法设计的底物浓度由于赖氏法设计的底物浓度,如如-酮戊二酸不足，反应速度酮戊二酸不足，反应速度只能达到最大速度的只能达到最大速度的65%65%；显

9、色剂；显色剂2,4-2,4-二硝基苯肼的用量只二硝基苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半；保温及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min30min的酶促反应后，的酶促反应后，新生成的丙酮酸和未用完的新生成的丙酮酸和未用完的a-a-酮戊二酸存在着无法人为控酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。【试剂试剂】1 1磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(pH7.4)(pH7.4)：将：将420mlNa420mlNa2 2HPOHPO4 4溶液和溶液

10、和2 2POPO4 4溶液混匀，置冰箱保存。溶液混匀，置冰箱保存。2 2基质溶液基质溶液(DL-(DL-丙氨酸丙氨酸200mmol/L200mmol/L，酮戊二酸酮戊二酸2mmo1/L)2mmo1/L)：精确称取：精确称取DL-DL-丙氨酸和丙氨酸和酮戊二，溶于磷酸盐缓冲液中，用酮戊二，溶于磷酸盐缓冲液中，用1mol/LNaOH1mol/LNaOH溶液（约）调至溶液（约）调至pHpH至，再加磷酸缓至，再加磷酸缓冲液至冲液至100ml,100ml,最后加入麝香草酚（每最后加入麝香草酚（每L L可加）防腐，置冰箱中保存，可用一个月。可加）防腐，置冰箱中保存，可用一个月。3 32.42.4二硝基苯肼

11、溶液二硝基苯肼溶液(1mmol/L)(1mmol/L)：称取：称取2.42.4二硝基苯肼二硝基苯肼19.8mg,19.8mg,溶溶100ml/L100ml/L盐酸中，盐酸中，置室温保存。置室温保存。4 4氢氧化钠溶液：氢氧化钠溶液：NaOH16gNaOH16g溶于蒸馏水中调至溶于蒸馏水中调至1000ml1000ml。5 5丙酮酸标准液丙酮酸标准液(2mol/L)(2mol/L)：丙酮酸钠，置于：丙酮酸钠，置于100ml100ml容量瓶中，加硫酸至刻度。容量瓶中，加硫酸至刻度。2 2HPOHPO4 4溶液：称取溶液：称取NaNa2 2HPOHPO4 42H2H2 2溶于少量蒸馏水中，待溶解后加蒸

12、馏水至溶于少量蒸馏水中，待溶解后加蒸馏水至1000ml1000ml，至冰，至冰箱中保存。箱中保存。2 2POPO4 4溶液：称取溶液：称取KHKH2 2POPO4 4溶于少量蒸馏水中，待溶解后加蒸馏水至溶于少量蒸馏水中，待溶解后加蒸馏水至1000ml1000ml，至冰箱中保，至冰箱中保存。存。【器材器材】恒温水浴恒温水浴锅锅，723723型分光光度计，刻度吸量管，滴管，试管等。型分光光度计，刻度吸量管，滴管，试管等。【试剂与器材试剂与器材】【步骤步骤】加入物加入物(ml)管号管号0 01 12 23 34 40.1mol/L0.1mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液0.100.100.100.1

13、00.100.100.100.100.100.102mmol/L2mmol/L丙酮酸标准液丙酮酸标准液0 00.050.050.100.100.150.150.200.20基质溶液基质溶液0.500.500.450.450.400.400.350.350.300.30相当于酶活力单位相当于酶活力单位0 0282857579797150150（2 2）分别向各管加入）分别向各管加入2 2，4 4二硝基苯肼液二硝基苯肼液0.5ml,0.5ml,混匀后置混匀后置3737 水浴箱，水浴箱，2020分钟后取出，分钟后取出，分别向各管加入溶液。分别向各管加入溶液。（3 3）混匀，放置）混匀，放置1010分

14、钟在分钟在505nm505nm波长比色，以蒸馏水调零点，读取各管光密度。各管波长比色，以蒸馏水调零点，读取各管光密度。各管光密度值分别减去光密度值分别减去0 0号光密度，以所得差值与相应的卡门氏酶活力单位作图即得标准曲号光密度，以所得差值与相应的卡门氏酶活力单位作图即得标准曲线。线。（4 4）当血清标本的酶活力单位超过）当血清标本的酶活力单位超过150150时，应将血清用生理盐水稀释时，应将血清用生理盐水稀释5 5倍或倍或1010倍后再进倍后再进行测定。行测定。（5 5）加入）加入2 2，4 4二硝基苯肼溶液后，应充分混匀，使反应完全。二硝基苯肼溶液后，应充分混匀，使反应完全。（6 6）绘制标

15、准曲线：第）绘制标准曲线：第1-41-4管的光密度值值分别减去管的光密度值值分别减去0 0管光密度值值，所得差值为纵坐管光密度值值，所得差值为纵坐标；对应的卡门氏单位为横坐标，作图，画出标准曲线。标；对应的卡门氏单位为横坐标，作图，画出标准曲线。（标准曲线已绘）（标准曲线已绘）1 1标准曲线的制作：标准曲线的制作：(1)(1)取取5 5支试管，编号，按下表操作支试管，编号，按下表操作：加入物（加入物（ml）测定管测定管对照管对照管血清血清0.10.10.10.1基质溶液基质溶液0.50.5混匀，置水浴箱中保温混匀，置水浴箱中保温30分钟分钟2,4-2,4-二硝基苯肼液二硝基苯肼液0.50.50

16、.50.5基质溶液基质溶液0.50.5混匀，置水浴箱中保温混匀，置水浴箱中保温20分钟分钟0.4mol/L0.4mol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液5.05.05.05.02.2.在测定前将底物液在在测定前将底物液在3737水浴中预温水浴中预温5 5分钟，然后按下表操作：分钟，然后按下表操作：【参考值参考值】5-255-25卡门氏单位卡门氏单位。室温放置室温放置1010分钟后，在分钟后，在505nm505nm波长，以蒸馏水校正零点，读取各管的光密度值，波长，以蒸馏水校正零点，读取各管的光密度值，测定管光密度值减去对照管光密度值后，从标准曲线查出测定管光密度值减去对照管光密度值后，从标准曲线查出。

17、1.1.酶测定中，温度、时间对酶的活力影响很大，故应控制好测定时的温度酶测定中，温度、时间对酶的活力影响很大，故应控制好测定时的温度（要求准确到（要求准确到3737），并准确掌握保温时间。），并准确掌握保温时间。2.2.丙酮酸的显色受温度影响，故应于季节变化时及底物成份之批号更换时丙酮酸的显色受温度影响，故应于季节变化时及底物成份之批号更换时重新制作标准曲线。重新制作标准曲线。3.3.因为因为-酮戊二酸也能与二硝基苯肼作用生成苯腙而显色，为了减少其酮戊二酸也能与二硝基苯肼作用生成苯腙而显色，为了减少其对丙酮酸测定的干扰作用，底物中对丙酮酸测定的干扰作用，底物中-酮戊二酸的浓度很低，不能保证酶酮

18、戊二酸的浓度很低，不能保证酶反应的充分进行；且二硝基苯肼的浓度也比较低，因此标准曲线不呈直线。反应的充分进行；且二硝基苯肼的浓度也比较低，因此标准曲线不呈直线。【注意事项注意事项】谷丙转氨酶广泛存在于机体组织中，在肝细胞中此酶活性极谷丙转氨酶广泛存在于机体组织中，在肝细胞中此酶活性极强，心肌细胞中此酶活性亦很强，故在肝疾患强，心肌细胞中此酶活性亦很强，故在肝疾患(如肝炎、肝癌如肝炎、肝癌等等)及心肌受损时，该酶可大量释放入血，使血清谷丙转氨酶及心肌受损时，该酶可大量释放入血，使血清谷丙转氨酶活性大大增加。临床上常借此帮助诊断。另外，血细胞中亦活性大大增加。临床上常借此帮助诊断。另外，血细胞中亦含有谷丙转氨酶，若取血时发生溶血，血清谷丙转氨酶也可含有谷丙转氨酶，若取血时发生溶血，血清谷丙转氨酶也可增高，故应避免溶血。增高，故应避免溶血。【临床意义临床意义】1.1.血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义？血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义？2.2.血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要避免溶血？血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要避免溶血？【思考题思考题】THANK YOU