生物素亲合素放大技术.ppt

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1、第第十一章十一章 生物素生物素-亲合素放大技术亲合素放大技术生物素（生物素（biotin,Bbiotin,B）是一种是一种小分子生长因子小分子生长因子,又称维生素又称维生素H或辅酶或辅酶R动、植物组织中广泛分布动、植物组织中广泛分布,卵黄和肝含量高卵黄和肝含量高MW 244.31kD.MW 244.31kD.I I环为环为咪唑酮环咪唑酮环，可与亲合可与亲合 素结合素结合环为环为噻吩环噻吩环，C2C2上戊酸上戊酸 侧链的未端羧基是结合生侧链的未端羧基是结合生 物大分子的唯一结构物大分子的唯一结构 I I I I 咪唑酮环咪唑酮环咪唑酮环咪唑酮环 噻吩环噻吩环噻吩环噻吩环 羧基羧基第一节第一节 生

2、物素理化性质与标记生物素理化性质与标记一、活化生物素一、活化生物素 生物素侧链的末生物素侧链的末端羧基经化学修端羧基经化学修饰后制成带各种饰后制成带各种活性基团的衍生活性基团的衍生物物活化生物素活化生物素(生物素化衍生物生物素化衍生物)生物素活化生物素活化活化生物素易活化生物素易与抗原、抗体与抗原、抗体酶及核酸分子酶及核酸分子中相应基团偶中相应基团偶联形成生物素联形成生物素化标记物化标记物 标记蛋白质标记蛋白质氨基氨基的活化生物素的活化生物素 标记蛋白质标记蛋白质醛基醛基的活化生物素的活化生物素 标记蛋白质标记蛋白质巯基巯基的活化生物素的活化生物素 标记标记核酸核酸的活化生物素的活化生物素 C

3、NHNHCHCH2CHCHOS(CH2)4COOHNH2COCH2CH2CONHOHCOONCOOCCH2CH2EDC标记蛋白质氨基的活化生物素标记蛋白质氨基的活化生物素生物素生物素N-N-羟基丁二酰胺羟基丁二酰胺碳二亚胺碳二亚胺生物素羟基生物素羟基琥珀酰亚胺琥珀酰亚胺酯（酯（BNHS BNHS）活化生物素活化生物素BNHSBNHS分子可与蛋白质分子可与蛋白质 赖氨酸的氨基形成肽键赖氨酸的氨基形成肽键 BNHSBNHS适用标记抗体和适用标记抗体和 中性或偏碱性的蛋白质中性或偏碱性的蛋白质如何减小空间位阻？如何减小空间位阻？长臂活化生物素长臂活化生物素（BCNHSBCNHS）：）：生物素和生物素

4、和N-N-羟基丁二酰亚胺之间添羟基丁二酰亚胺之间添加了两个加了两个6-6-氨基已糖分子基团，形氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素与大分子基团的成连结臂，生物素与大分子基团的距离距离 标记蛋白质醛基的活化生物素标记蛋白质醛基的活化生物素生物素酰肼生物素酰肼(BHZ)(BHZ)：水合肼与生物素的合成物水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素肼化生物胞素(BCHZ)(BCHZ)：生物素与赖氨酸连接：生物素与赖氨酸连接 后，再与无水肼反应而成。后，再与无水肼反应而成。除醛基外，除醛基外，BCHZBCHZ还可标记氨基还可标记氨基标记蛋白质巯基的活化生物素标

5、记蛋白质巯基的活化生物素马来酰亚胺马来酰亚胺-丙酰丙酰-生物胞素（生物胞素（MPB)MPB)能特异地与蛋白质巯基结合的活化能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素生物素 标记核酸的活化生物素标记核酸的活化生物素光敏生物素光敏生物素(photobiotin)(photobiotin)侧链上连接的芳香基叠氮物基团侧链上连接的芳香基叠氮物基团,经光照后经光照后,变为芳香变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合,形成形成B-B-核酸探针核酸探针 N3NO2NH(CH2)3N(CH2)3CH3NHC(CH2)4SNHNHO生物素脱氧核苷三磷酸生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dU

6、TP）作为作为TTPTTP的结构类似物，可采用缺口移的结构类似物，可采用缺口移 位法掺入到双链位法掺入到双链DNADNA中。中。BNHS和和BHZ 可直接标记核酸，可直接标记核酸，但对但对碱基配对碱基配对有影有影响。响。二、生物素标记蛋白质二、生物素标记蛋白质活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；一个蛋白分子可被多个生物素标记多价性；一个蛋白分子可被多个生物素标记多价性；对对BNHS多标记抗体多标记抗体,BHZ则多标记微酸性抗原；则多标记微酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变；抗原、抗体标记后活性不变；可对标记材料（如酶）标记：可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标

7、记后碱性磷酸酶标记后 活性将降低；活性将降低；选择活化生物素：选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团依抗原或抗体分子所带可标记基团 的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；控制生物素：控制生物素：蛋白质比例蛋白质比例 生物素：生物素：IgG IgG 用量比用量比(mg/mg)宜为宜为2:1,IgG2:1,IgG应用浓度应用浓度 5 5g/ml;生物素生物素1 13 3个个/Ag/Ag，3 35 5个个/Ab/Ab；使用交联臂减少空间阻力使用交联臂减少空间阻力第二节第二节 亲合素、链霉亲合素的理化亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记性质与标记

8、亲合素亲合素(avidin,AV)和链霉亲合素和链霉亲合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特异性结合是生物素的天然特异性结合物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲合素（有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链）或链酶亲合素（酶亲合素（SA）结合。）结合。结构结构 四亚基糖蛋白四亚基糖蛋白 四肽链蛋白四肽链蛋白 无糖基无糖基PI PI 10.5 610.5 6结合位结合位 色氨酸色氨酸 色氨酸色氨酸生物素生物素 4 44 4Ka Ka 10 1015 15 10 101515活性活性 131315 1515 1

9、51818亲合素（亲合素（亲合素（亲合素（A A A A）链霉亲合素链霉亲合素链霉亲合素链霉亲合素(SA)(SA)(SA)(SA)一、理一、理 化化 特特 性性二、亲合素二、亲合素/链霉亲合素标记链霉亲合素标记标记物：小分子示踪物125I、胶体金、荧光素、化学发光物 大分子物质如酶抗原、抗体亲和素的标记：HRP的标记 改良过碘酸钠法 戊二醛法过碘酸盐氧化法过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2AvidinOOONNAvidinAvidinH2ONAvdinNaBH4Schiff碱酶-五炭糖环戊二醛法戊二醛法酶酶NHNH2 2亲和素亲和素NHNH2 2(CH2 2)3

10、3CHOCHO(CH2 2)3 3CHN酶酶CHN亲和素亲和素B-E +A ABC2.亲和素生物素化HRP复合物的制备链霉亲和素的标记方法：过碘酸钠法HRP+NaIO4+SA 透析+KBH4 沉淀过碘酸盐氧化法过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2SAvidinOOONNSAvidinSAvidinH2ONAvdinKBH4Schiff碱酶-五炭糖环第三节第三节 生物素生物素-亲合素系统的特点亲合素系统的特点一、灵敏度高一、灵敏度高二、特异性强二、特异性强三、稳定性好三、稳定性好四、适用性广四、适用性广五、其他五、其他第四节第四节 生物素生物素-亲合素系统的应用亲合素

11、系统的应用生物素与亲合素之间结合的亲合力生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强，各自均可以与各型大小分高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及二者在结合反应时具有的多子结合，以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性，使级放大作用等优越性，使BASBAS及其相关技及其相关技术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领域中，尤其为标记免疫检测自动化分析做域中，尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的贡献。出了极大的贡献。一、生物素一、生物素-亲合素系统基本类型及亲合素系统基本类型及原理原理BABBAB法：法：Ag+BAg+BAb Ag-AbAb Ag-

12、AbB B A A Ag-Ab Ag-AbB-A B-A B BE E Ag-Ab Ag-AbB-A-BB-A-BE E 特点：以游离特点：以游离A A分别连接分别连接B-AbB-Ab和和B-E B-E+A+A ABC ABC法法 A+BA+BE A-BE A-BE-ABCE-ABC Ag+B Ag+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B ABCABC Ag-Ab Ag-AbB-B-ABC ABC 特点特点:将将BABBAB法中的法中的A A先与先与B-EB-E结合，制备成复合物结合，制备成复合物ABCABC+ABCB-E +A ABCAb-Ag-Ab-B+ABC Ab-Ag-Ab-B-AB

13、C BABA法法Ag+BAg+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B A AE E Ag-Ab Ag-AbB-AB-AE E特点：以特点：以A-E/SA-EA-E/SA-E代替代替BABBAB法中的法中的A A，省，省 却了加却了加B-EB-E的步骤的步骤 Ag-Ab1-Ab2-B +A-E Ag-Ab1-Ab2-B-A-E+A-EBAS实验方法及反应层次方法反应层次直接法BAAg-(Ab-B)-A*BABAg-(Ab-B)-A-B*ABCAg-(Ab-B)-AB*C间接法BAAg-Ab1-(Ab2-B)-A*BABAg-Ab1-(Ab2-B)-A-B*ABCAg-Ab1-(Ab2-B)-A

14、B*C二、生物素二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定亲合素系统在酶免疫测定中的应用中的应用BASBAS在在ELISAELISA中的应用中的应用 生物素生物素-亲合素系统在均相酶免疫测定亲合素系统在均相酶免疫测定 AB固相化抗原或抗体B电化学发光免疫测定示意图电化学发光免疫测定示意图 用于终反应的放大三、生物素三、生物素-亲合素系统在荧光免疫亲合素系统在荧光免疫技术中的应用技术中的应用 BAS BAS用于荧光抗体技术，通常采用用于荧光抗体技术，通常采用BABA法，即用法，即用荧光素直接标记亲合素（或链酶亲合素）；荧光素直接标记亲合素（或链酶亲合素）；也可采用游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥，也可采用

15、游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素（生物素（BABBAB法）或荧光标记的抗亲合素（或法）或荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素）抗体的夹心法。链酶亲合素）抗体的夹心法。四、生物素四、生物素-亲合素系统在放射免疫亲合素系统在放射免疫测定中的应用测定中的应用BASBAS主要与免疫放射分析主要与免疫放射分析(IRMA)(IRMA)检测体系偶检测体系偶联，用于对终反应的放大（联，用于对终反应的放大（BABA法）法）BASBAS也可用于也可用于IRMAIRMA反应后反应后B B、F F成分的分离成分的分离 五、生物素五、生物素-

16、亲合素系统在分子生物亲合素系统在分子生物学中的应用学中的应用以生物素标记核酸探针进行的定位检测以生物素标记核酸探针进行的定位检测用用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化纯化将免疫测定技术与将免疫测定技术与PCR结合建立免疫结合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测用于抗原的检测 Anti-HCVSandwich principle.Total duration:18minutes.1st incubation:40L of sample,60 L of reagent containing biotinylated HCV antigens a

17、nd 60 L of a reagent containing HCV antigens labeled with a ruthenium complex react to form a sandwich complex.2nd incubation:After addition of strepetavidin-coated microparticles,the complex becomes bound to the solid phase via interaction of biontin and streptavidin.The reaction mixture is aspirat

18、ed into the measuring cell where the microparticles are magnetically captured onto the surface of the electrode.Unbound substances are then removed with ProCell.Application of a voltage to the electrode then induces chemiluminescent emission which is measured by a photomultiplier.Results are determi

19、ned automatically by the Elecsys software by comparing the electrochemiluminescence signal obtained from the sample with the cutoff value obtained by anti-HCV calibration.HBsAgIISandwich principle.Total duration of assay:18 minutes.1st incubation:50 L of sample,two biotinylated monoclonal anti-HBsAg

20、 antibodies,and a mixture of monoclonal anti-HBsAg antibody and polyclonal anti-HBsAg antibodies labeled with a ruthenium complex form a sandwich complex.2nd:incubation:After addition of streptavidin-coated microparticles,the complex becomes bound to the solid phase via interaction of biotin and str

21、eptavidin.Anti-HBeCompetition principle.1st:incubation:Anti-HBe in the sample(35 L)binds to the added HBeAg.2nd incubation:After addition of biotinylated antibodies and ruthenium complex-labeled antibodies specific for HBeAg,together with streptavdin-coated microparticles,the still-free binding site

22、s on the HBe-antigens become occupied.The entire complex is then bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavdin.Anti-HAV IgM-Capture test principle.Total duration of assay:18 minutes.1st incubation:Pretreatment of 10 L of the automatically 1:400 diluted sample(using Elecsys Dilue

23、nt Universal)with anti-Fdy reagent to block specific in the presence of the monoclonal anti-HAV antibodies labeled with ruthenium complex.2nd incubation:After addion of biotinylated monoclonal h-IgM-specific antibodies,HAV antigen,and streptavdin-coated microparticles,the anti-HAV IgM antibodies pre

24、sent in the sample form a sandwich complex with the HAV antigen and the ruthenium-labeled anti-HAVantibody which becomes bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavidin.Anti-HBsSandwich principle.1st incubation:Anti-HBs in the sample(40L),biotinylated HBsAg(ad/ay),and HBsAg(ad/ay

25、)labeled with a ruthenium complex react to form a sandwich coplex.2nd incubation:After addition of strepavdin-coated microparticles,the comples becomes bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavidin.小小 结结生生物物素素亲亲合合素素（链链霉霉亲亲合合素素）系系统统具具有有的的多多级级放放大大独独特特效效应应，可可极极大大地地提提高高分分析析测测定定的的灵灵

26、敏敏度度；二二者者之之间间的的高高亲亲和和、高高特特异异结结合合以以及及既既可可偶偶联联生生物物大大分分子子，又又可可连连接接标标记记材材料料的的特特性性，使使该该系系统统在在标标记记免免疫疫分分析析技技术术领领域域中中的的应应用用具具有有很很强强的的稳稳定定性性和和适适用用性性。该该系系统统有有二二种种基基本本类类型型：以以游游离离亲亲合合素素为为中中间间物物，分分别别连连接接包包含含生生物物素素化化大大分分子子的的待待检检反反应应体体系系和和标标记记生生物物素素的的BABBAB法法或或ABCABC技技术术；另另一一类类是是直直接接用用标标记记亲亲合合素素连连接接生生物物素素化化大大分分子子

27、反反应应体体系系进进行行检检测测的的BABA法或法或LABLAB。重点名词解释：活化生物素名词解释：活化生物素1.1.活化生物素种类活化生物素种类2.2.生物素的结构特点，亲和素特点生物素的结构特点，亲和素特点3.3.生物素亲和素系统基本类型及原理生物素亲和素系统基本类型及原理选择题若形成Ag生物素化Ab亲和素 酶标生物素复合物，采用的是哪种BAS法法法法法BAB法BAS放大系统应用于间接法ELISA时，以下哪一种成分被生物素化A.抗原B.第二抗体C.抗原特异抗体D.固相抗体直接法BAB的反应模式为（AbB）A*（AbB）AB*（AbB）AB*CAb1（Ab2B）A*（AbA）B*可与蛋白质氨基结合的活化生物素是A.生物素羟基丁二酰胺酯（BNHS）B.光敏生物素C.生物素酰肼（BHZ）D.马来酰亚胺丙酰生物胞素（MPB）