生物反应工程生物工程反应.ppt

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1、生物工程反应姜梅第第3章章微生物反应动力学微生物反应动力学本章的重点本章的重点本章的重点本章的重点细胞反应过程计量学有关概念及计算；细胞反应过程计量学有关概念及计算；细胞反应过程计量学有关概念及计算；细胞反应过程计量学有关概念及计算；MonodMonod方程的意义及计算；方程的意义及计算；方程的意义及计算；方程的意义及计算；本章的难点：本章的难点：本章的难点：本章的难点：MonodMonod与与与与米氏方程相同点与不同点；米氏方程相同点与不同点；米氏方程相同点与不同点；米氏方程相同点与不同点；基质消耗动力学。基质消耗动力学。基质消耗动力学。基质消耗动力学。微生物培养的特点微生物培养的特点A.优

2、点优点：n微生物常能分泌或诱导分泌有用的生物化学物质，容易筛选出分泌型突变株，微生物的生长速率快，微生物的代谢产物的产率较高等。n微生物反应是生物化学反应，通常是在常温，常压下进行，并且同一设备可生产多种产物；n原料来源丰富；n易于生产复杂的高分子化合物和旋光性物质；n除产生反应产物外，菌体自身也可是产物，可能成为富含维生素，蛋白质和酶等的有用产物；n通过菌种改良，有可能使同一生产设备的生产能力大大提高。B.缺点缺点n底物不可能全部转化成目的产物，副副产产物物的的产产生生不不可可避避免免。这样，目的产物的提取与精制就很困难，这正是造成目前发酵行业下游操作落后的原因之一。n微生物反应是利用活的生

3、物体进行目的产物生产的反应，因此，产物的获得除受环境因素影响外，也受细胞内因素的影响，并且微生物菌体易发生遗传变异，因此，实际控制相当困难控制相当困难。n原料是农副产品，所以受价格变动影响大。n生产前的准备工作(开发新菌种，扩大培养等)量大，且花费高，相对化学反应器而言，反反应应器器效效率率低低。对于好氧反应，因为要通氧，故增加了费用，且氧的利用率不高。n具有较高的BOD值，需进行处理。细胞反应过程计量学细胞反应过程计量学含细胞的体系作为暗箱含细胞的体系作为暗箱3.1.1微生物反应过程的质量平衡n假设：A.物质平均分子式：CHCHX XO OY YN NZ ZB.基质：有机碳源：CHCHm m

4、O On n无机氮源：NHNH3 3C.产物：完全反应：COCO2 2、H H2 2O O不完全反应（厌氧或兼氧）：CHCHU UO OV VN NW W（胞外）D.电子受体分子态氧（O O2 2）E：细胞的一碳反应摩尔质量定义为含有1mol碳原子的细胞质量。n n方程：方程：碳源+氧+氮源=菌体+有机化合物+CO2+H2OCHCHm mO On n+aO+aO2 2+bNH+bNH3 3=cCH=cCHXO OYN NZ+dCH+dCHUO OVN NW +eH2O+fCO2n n原则：原则：A.A.平均分子式：平均分子式：B.B.元素：元素：C C、N N、H H、O O平衡平衡C.C.呼

5、吸商呼吸商:原则原则D.还原度：（胞外产物的反应，质子-电子平衡）该组分中每1mol碳原子的有效电子数当量数。有效电子数：有效电子数：有效电子数：有效电子数：1mol碳源完全氧化时，所需氧的摩尔数的4倍,如：C C6 6O O1212H H6 6 的摩尔数的摩尔数64=2464=24（6mol O6mol O2 2）a.C=4，H=1，N=-3，O=-2，P=5，S=6O O2 2=-4b.NHb.NH3 3、H2O、CO2为为零零.CHCHm mO On n+aO+aO2 2+bNH+bNH3 3=cCH=cCHxO Oy yN Nz z+dCH+dCHU UO OV VN NW W+eH2

6、O+fCO2细胞X：rX=4+x-2y-3z基质S：rS=4+m-2n产物P：rP=4+u-2v-3w质量平衡：rS-4a=crX+drPa=2.394b=0.085c=0.564d=1.436e=2.6341例2推断分子式细胞反应过程的得率系数细胞反应过程的得率系数得得得得率率率率系系系系数数数数:对对对对碳碳碳碳源源源源等等等等物物物物质质质质生生生生成成成成细细细细胞胞胞胞或或或或其其其其他他他他产产产产物物物物的的的的潜潜潜潜力力力力进进进进行行行行定定定定量量量量评评评评价价价价。最最最最常常常常用用用用的的的的几几几几种种种种得得得得率率率率系系系系数数数数有有有有下述几种下述几种

7、下述几种下述几种：n细胞得率或生长得率细胞得率或生长得率YX/Sn对元素的细胞得率对元素的细胞得率YC、YX/On对能量的细胞得率对能量的细胞得率Y-ave、YKJ、YATP细胞得率或生长得率YX/SnYX/S（细胞/基质：g/g、g/mol)n微分细胞得率同一菌种，同一培养基，好氧培养的YX/S比厌氧培的大得多；同一菌株在基本、合成和复合培养基中培养所得YX/S的大小顺序为复合培养基、合成培养基和基本培养基。不同碳源培养基，YX/S不同几种微生物的菌体得率宏观得率与理论得率宏观得率与理论得率n当细胞生长的同时，还伴有其他反应如代谢产物的生成时，则所消耗的基质一部分用于细胞的 生 长，一 部

8、分 用 于 生 成 代 谢 产 物。S=SG（生长）+SR（产物）n宏观得率宏观得率n理论得率理论得率nY*X/SYX/S对元素的细胞得率对元素的细胞得率YC、YX/On nYC碳同化细胞的过程的转化效率。碳同化细胞的过程的转化效率。YC小于1，为XC、SC单位质量细胞和单位基质中所含的碳元素量n nYX/O例3求例题2中酵母细胞(CHNO)的YX/S和YX/O。解：由细胞得率定于及例解：由细胞得率定于及例2，有，有对能量的细胞得率对能量的细胞得率Y-ave、YKJ、YATPnY-ave：基质完全氧化失去：基质完全氧化失去1 mol有效电子时有效电子时的细胞得率。（的细胞得率。（g/g、g/m

9、ol）nYATP：消耗：消耗1 molATP所获的干菌体克数。所获的干菌体克数。（g/mol）nYKJ：1KJ基质燃烧热产生细胞干重得率基质燃烧热产生细胞干重得率.（g/KJ）YKJ=Y-ave部分菌体得率与产物得率例4例43.2细胞生长的非结构动力学细胞生长的非结构动力学细胞反应过程主要特征细胞反应过程主要特征n细胞是反应过程的主体细胞是反应过程的主体n细胞反应过程的本质是复杂的酶催化反应细胞反应过程的本质是复杂的酶催化反应体系体系n细胞反应与酶催化反应也有着明显的不同细胞反应与酶催化反应也有着明显的不同 酶本身不能进行再生产酶本身不能进行再生产；细胞自己能进行再生细胞自己能进行再生产产 ；

10、在细胞反应过程中细胞的形态、组成、活在细胞反应过程中细胞的形态、组成、活性都处在一动态变化过程性都处在一动态变化过程。环境对细胞生长的影响n细胞种类和来源n外环境营养物质的种类和浓度环境的pH、温度、剪切力等温度温度pH细菌：霉菌和酵母：4-6n渗透压好盐细菌：30%NaCl耐糖酵母：70%蔗糖溶液n溶解氧（solvedoxygen,DO）n光光氧型微生物、藻类和植物细胞n剪切力综合因素3.2.3细胞生长动力学的描述方法细胞生长动力学的描述方法A.A.理想的微生物生长模型应具备下列理想的微生物生长模型应具备下列理想的微生物生长模型应具备下列理想的微生物生长模型应具备下列4 4个条个条个条个条件

11、：件：件：件：n要明确建立模型的目的。n明确地给出建立模型的假定条件，这样才能明确模型的适用范网。n希望所含有的参数，能够通过实验逐个确定。n模型应尽可能简单。B.模型分类模型分类n结构模型和非结构模型是否考虑细胞组成变化（均衡生长）n确定论和概率论是否考虑细胞群体中的个体变化与细胞的浓度有关n分立模型和非分立模型是否考虑细胞群体个体差异最理想情况：不考虑细胞内部结构；各种细胞均一；细胞群体做为一种溶质A细胞之间无差异，是均一的，细胞内有多个组分存在B不考虑细胞内部结构；各种细胞不均一C实际情况：细胞内多组分；细胞之间不均一D均衡生长均衡生长非结构模型结构模型平均细胞的近似平均细胞的近似C.C

12、.反应速率反应速率细细胞胞的的生生长长、基基质质的的消消耗耗和和产产物生生成成的变化情况，要描述这种变化，采用绝绝对对速速率率和和比比速速率率两种定义方法。n绝绝对对速速率率(又又简简称称为为速速率率):表表示示为为单单位位时时间间、单位反应体积某一组分的变化量。单位反应体积某一组分的变化量。n比比速速率率:单单位位浓浓度度细细胞胞(或或单单位位质质量量)为为基基准准而而表示的各个组分变化速率表示的各个组分变化速率D.倍增时间td与关系倍增时间与世代时间不同例以乙醇为惟一碳源进行产气气杆菌培养，菌使浓度X03，培养至，菌体浓度为3，如果不考虑延迟期，比生长速率一定，求倍增时间td无抑制的细胞生

13、长动力学无抑制的细胞生长动力学A.Monod方方程程：细细胞胞的的生生长长为为均均衡衡式式生生长长，细细胞胞的的比比生生长长速速率率与与限限制制性性基基质质浓浓度度的的存存在在着着关关系。系。a.假设：假设：细细胞胞的的生生长长为为均均衡衡式式生生长长，细细胞胞生生长长的的唯唯一一变量是细胞的浓度；变量是细胞的浓度；培培养养基基中中只只有有一一种种基基质质是是生生长长限限制制性性基基质质，而其他组分为过量，不影响细胞的生长；而其他组分为过量，不影响细胞的生长；细细胞胞的的生生长长视视为为简简单单的的单单一一反反应应，细细胞胞得得率率为一常数。为一常数。方程方程Ks饱和常数（g/L）比生长速率是

14、最大比生长速率是一半时的限制性基质的浓度。max微生物的最大比生长速率（s-1)方程适用范围：方程适用范围：适用于细胞生长较慢和细胞密度较低的环境适用于细胞生长较慢和细胞密度较低的环境。如如果果基基质质消消耗耗速速率率过过快快，则则极极有有可可能能产产生生有有害害的的副副产产物物；在在细细胞胞浓浓度度很很高高时时，则则有有害害的的副副产产物物可可能能更更多多。因因此此，人人们们又又提提出出另另外外一一些些无无抑抑制制的的细细胞胞生生长长动动力力学学。式中Cs0基质初始浓度；Kso无因次初始饱和常数。其他方程若干常见微生物max与Ks值微生物限制性底物max/h-1Ks/(mg/L)大肠杆菌37

15、）葡萄糖0.8-1.42-4大肠杆菌37）甘油0.872大肠杆菌37）乳糖0.820酿酒酵母30）葡萄糖0.5-0.625热带假丝酵母葡萄糖0.525-75产气可雷伯氏菌甘油0.859产气气杆菌葡萄糖1.221-10与S关系与S关系d与S关系当限制性基质浓度很低时，SKs时，=max，若继续提高基质浓度，细胞生长速率基本不变。此时细胞比生长速率与基质浓度无关，为零级动力学特点。c.当S处于上述两种情况之间，则与Cs关系符合Monod方程关系。rX例例乙醇为唯一碳源进行面包生产，获得如下数乙醇为唯一碳源进行面包生产，获得如下数据：据：求求和和Ks。SS（g/Lg/L)0.400.400.330.

16、330.180.180.100.100.0710.0710.0490.0490.0380.0380.0200.0200.0140.014(h(h-1-1)0.1610.1610.1690.1690.1690.1690.1490.1490.1330.1330.1350.1350.1120.1120.09090.09090.07350.0735解：由图可知：=0.18(h=0.18(h-1-1)3 3)例例采用合成培养基，在采用合成培养基，在1m3生物反应器中进行大肠杆生物反应器中进行大肠杆菌分批培养，菌体的生长变化利用菌分批培养，菌体的生长变化利用Monod方程描述，已方程描述，已知知max-1

17、，3，基质初使浓度，基质初使浓度50kg/m3,菌体菌体X0=0.1kg/m3，YX/S=0.6kg/kg,（以细胞（以细胞/基质），求当基质），求当80%的基质已的基质已反应时所需时间。反应时所需时间。解：当80%的基质反应时，S=50（1-80%）=10kg/m33则（1）YX/S恒定，生成菌体量（S0-S）YX/S=400.6=24（kg)当t=t0,t=t时，菌体量有增至24kg，对（1）积分b.Monod与米氏方程的比较：与米氏方程的比较：n相同：形似；在一定条件下使用。Monod方程往往必须在具体条件下进行适当修正。n不同：Monod方程经验表达式；而米氏方程数学推导式。细胞利用营

18、养成分的过程与单一酶促反应过程不同，因前者与细胞的生理、营养、代谢有关。不同：酶在反应完成后，其数量保持不变(假定不失活)，但微生物反应完成后细胞量却发生变化(自催化反应)。米氏方程是反应速率与底物浓度之间的对应关系，而Monod方程表明了比生长速率与限制性基质浓度之间的对应关系。比生长速率不直接参与反应，是一系列生化反应的间接结果。如果在细胞生长中蛋白质合成是限制因素，则两式趋于近似。米氏常数的大小，表明了酶对底物亲和力的强弱，Ks的大小则表明细胞对限制性基质的依赖性的大小。逻辑方程：式中(1-x)综合描述了因营养物质匮乏和有毒代谢物积累等各种限制和抑制细胞生长的因素。适用于营养成分复杂、生

19、长限制因素不清楚的情形。在生态学和间歇发酵动力学广泛应用。其他不同方程所获得的菌体浓度与时间的变化关系基质消耗动力学基质消耗表达方法A.基质消耗速率仅用于维持细胞生长n基质消耗速率n基质比消耗速率B.基质消耗速率用于维持细胞生长和维持代谢的消耗n基质消耗速率n基质比消耗速率-=g()C.基质消耗速率用于产物的消耗a.与能量偶联同Bb.与能量间接偶联n基质消耗速率n基质比消耗速率与能量关系氧的消耗速率A.消耗速率仅用于生长B.消耗速率用于生长和代谢关系代谢产物的生成动力学n模型类型：相关、部分相关、非相关相关模型：n产物是细胞能量的代谢的结果nrP=Yp/xrx=-YP/SXn乙醇、葡萄糖酸、乳

20、酸n曲线：变化趋于同步，rP,max，max同步模型类型：相关、部分相关、非相关变化曲线部分相关模型n产物是能量代谢的间接结果；nrP=rX+x,=+n柠檬酸、氨基酸n曲线：，非相关模型n产物的生成与细胞的生长无直接关系nrP=x，=n抗菌素、微生物毒素n曲线例证明下列反应速率动力学为=+的形式。相对分子质量：1804644各物质中的含碳量：vs=0.40vp=0.52vCO2=0.27CO2的生成量为不考虑有其他产物生成时，反应系统的碳平衡式为（-）=vs（vs为单位质量菌体中的含碳量，为常数）（-）=vs又有其中m维持常数YG无维持代谢的细胞最大得率，常数因此，故证明乙醇发酵反应速率动力学

21、符合=+的形式，其中、为常数。其中，m、YG、vx为常量，则上式可写为=+的形式。模型3.5细胞死亡动力学细胞死亡动力学n营养细胞对数死亡动力学VD积分kd是温度函数，kd芽孢死亡动力学n菌体循序死亡模型（非对数）RSD积分krks3.5.2灭菌原理n微生物灭菌的原理来源于细胞死亡动力学，对于不同的细胞其死亡难易程度不同。一般来说营养细胞容易被杀死，而芽孢则因有致密的外皮和干燥的内含物，难以致死。因此，在设计灭菌操作时，总以芽孢为灭菌对象，只要杀死了芽孢，其他杂菌也一定能杀灭。同时要考虑灭菌的同时，减少培养基有效成分的损失。由于温度变化对营养成分破坏的影响，明显小于芽孢的热死亡，因此，多采用高

22、温、瞬时的灭菌方法。n通常认为细胞浓度10-4个/ml为无菌。灭菌原理n根据动力学分析。微生物受热死亡时的活化能一般比营养成受热分解的活化能大得多，因此，当温度升高时，微生物的死亡速率的增加要比营养成分破坏速率的增加大得多。受热物质E（J/mol）维生素B12维生素B1盐酸盐嗜热脂肪芽孢杆菌孢子肉毒梭菌孢子枯草杆菌孢子9623292048283257343088317984灭菌温度（C）达到灭菌程度的时间（min）维生素B1的损失（%）100110120130140150843757.60.8510.1070.01599.9989271031例例为了发酵，采用蒸汽对分批发酵罐中液体培养基进行为

23、了发酵，采用蒸汽对分批发酵罐中液体培养基进行灭菌，已知其含有杂菌的初始浓度为灭菌，已知其含有杂菌的初始浓度为108个杂菌个杂菌/L。细胞死细胞死亡速率可用一级动力学表示。根据要求，最终可以接受的亡速率可用一级动力学表示。根据要求，最终可以接受的含杂菌浓度为含杂菌浓度为10-3个杂菌个杂菌/L。现假定该杂菌为嗜热脂肪芽。现假定该杂菌为嗜热脂肪芽孢杆菌，已知其热死活化能为孢杆菌，已知其热死活化能为283kJ/mol,阿累尼乌斯常数阿累尼乌斯常数为为10s-1。若处理的培养基为。若处理的培养基为1m3，试求分别在，试求分别在80、121和和140进行灭菌时，各需要多长时间？进行灭菌时，各需要多长时间

24、？解：由题意可得：第4章微生物反应器操作n微生物反应器 一般由反应器、空气系统、检测系统、阀门、管道和附属设备组成。实罐灭菌时，蒸汽可从进气口、排料口和取样口进入，从其它口排出，即所谓“三进四出”或“三进五出”物流物流：空气蒸汽水物料（补料）检测：检测：pHT溶氧消泡气生式发酵罐n由喷嘴、升管和降管组成，利用喷嘴功能和流体在发酵罐的重度造成循环流动来实现发酵液的搅拌混合和溶氧（图3）41微生物反应器操作基础n按是否供养，分厌氧和好氧。好氧分为(1)液体表面培养(如使用浅盘)；(2)通风固态发酵；(3)通氧深层培n操作方式而言，深层培养可分为：(1)分批式操作。(2)反复分批式操作(3)半分批式

25、操作(4)反复半分批式操(5)连续式操作4.2分批操作分批操作n简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化物浓度等参数都随时间变化对于初级代谢产物，在对数生长期初期就对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，而次级代谢产物则在对开始合成并积累，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大量合成。数生长期后期和稳定期大量合成。分批操作的优缺点分批操作的优缺点优点优点 操作简单，

26、周期短，染菌机会少，操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握；生产过程和产品质量容易掌握；缺点缺点 产率低，不适于测定动力学数据产率低，不适于测定动力学数据4.2分批操作4.2.1生长曲线n迟缓期特点：细细胞胞质质量量浓浓度度在在一一段段时时间间内内无无明明显显增增加加的这一阶段的这一阶段。延迟期的时间一般由实验确定延迟期的时间一般由实验确定n对数生长期细胞生长速率与细胞浓度是一级动力学关系。细胞生长速率与细胞浓度是一级动力学关系。一定一定当t=tlag时，令X=X0，积分，有n减速期：在减速期内，细胞生长速率与细胞浓度仍在减速期内，细胞生长速率与细胞浓度仍符合一级动力学关系，

27、即：符合一级动力学关系，即：X X K Kd dX X 但其中但其中 值受到基质浓度的限制。值受到基质浓度的限制。n静止期细胞的纯生长速率为零细胞的纯生长速率为零。X K X Kd dX=0X=0衰退期：n底物消耗尽X=Xstexp(kdt)Monod方程变为S=04.2.2状态方程n培养过程的代谢参数：、DO、DCO2、P、S、X基质：菌体：产物：O2：CO2：t=0时，S=S0，X=X0，P=0，=0，=0=0，=，=例以甘油为基质进行阴沟气杆菌（Aerobacter cloacae)分批培养。时间t=0时，X0，S0=50g/L。反应方程式可以用Monod方程表示，max-1，Ks=1.

28、2310-2g/L，YX/S=0.53g/g(以细胞/葡萄糖计），若不考虑诱导期和死亡期，求培养6h的菌体浓度。解：由菌体得率定义，代入已知数值，有（1）因此，基质浓度与菌体浓度有如下关系（2）由（1）式变形可得（3）因为（4）将（3）式代入（4）中，整理积分，得(5)将已知条件代入（5），得X=16g/L4.2.3反复分批培养操作设培养液体积V（一定），培养液取出率，滤液取出率，培养液加入量(+)V=F则，根据物料平衡菌体XiV=XfV-XfV产物PiV=PfV-(PfV+PfV)生产能力生产能力 反复分批培养操作例在有氧条件下，杆菌在甲醇上生长，在进行间歇培养时得到结果如表所示：时间/hX

29、/(g/l)S/(g/l)时间/hX/(g/l)S/(g/l)00.29.23123.24.620.2119.21145.60.9240.3059.07166.150.07780.988.03186.200101.776.8试求：（1）max值。（2）Yx/s值。（3）细胞质量倍增时间td值。（4）饱和常数KS值。（5）在t=10h时比生长速率值。解：由题意可得解：由题意可得小结:n原始数据:X、S、P、tn数据处理：n对细胞动力学，变换为线性方程，作图计算细胞动力学参数Ks和n由细胞动力学参数Ks和，计算底物消耗动力学参数和产物动力学参数。小结：n根据实验绘图X、S、P-tn判断对数生长期，

30、利用，积分形式绘图和，得直线，直线斜率流加操作流加操作n在分批培养过程中补入新鲜的料液，以在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。缺点。n在此过程中只有料液的加入没有料液的在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。中采用这种方法很多。特点特点优点优点：在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制

31、合理的补料速率，稳定最佳生产工艺,即能够任意控制反应液中基质浓度。缺点：缺点：由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降；由于有物料的加入增加了染菌机会。4.3流加操作n目的：可以减缓基质对细胞生长的抑制；实现细胞高密度培养提高生产能力。n解决的核心问题：流加什么和怎么流加n流加方式：无反馈控制定流量流加指数流加最优量流加有反馈控制间接直接定值程序根据控制参数根据底物浓度情况反应液体积变化4.3.1无反馈控制的流加操作n若基质流加量=基质消耗量，得XmaxdS/dt0，n若S、X近似恒定，dX/dt0，=F/V=D定流量流加操作n ndV/dt=F=dV/dt=F=定值，定值，t=0

32、,S=St=0,S=S0 0,X=X,X=X0 0,V=V,V=V0 0n n微生物成线性增长微生物成线性增长n n菌体恒算菌体恒算 t=tt=t，指数流加操作n定值，S为常数，dX/dt=0在拟稳定条件下，培养液体积V=V0exp(t)菌体量XV=X0V0exp(t)流量F=F0exp(t)流加4.3.2有反馈控制的流加操作 发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。一般地，达到稳态后，整个过程中菌的一般地，达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定浓度，产物浓度，

33、限制性基质浓度都是恒定的。的。4.4连续式操作n分类：CSTR(continuousstirredtankrector)恒化器法（chemostat):基质流速一定 恒浊器法（turbidstat):细胞浓度一定 营养物恒定法(nutristat):培养基的成分 细胞浓度一定CPFR(continuous piug flow rector):多用于酶反应n应用：单细胞培养、面包酵母、小球藻连续培养的优缺点连续培养的优缺点优点：控制稀释速率可以使发酵过程最优点：控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。由优化。发酵周期长，得到高的产量。由于于D，通过改变稀释速率可以比较容，通过

34、改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学。易的研究菌生长的动力学。缺点：菌种不稳定的话，长期连续培养会缺点：菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。菌机会大大增加。恒化器法连续操作单级连续培养培养基只有一种限制成分n状态方程变化量=流入量+生成量-流出量菌体基质产物培养系统培养系统培养系统培养系统FF培养液流入与流出速度，培养液流入与流出速度，培养液流入与流出速度，培养液流入与流出速度，L/hL/h。稀释率分析稳定操作的条件：dX/dt=0，即=D自平衡能力稀释率判断A.D，dX/dt0,X,S=DB.D，dX/

35、dt0,X,S=D根据这一特点调节生长环境，考察微生物的生长特性X、S、P与D的关系冲馈现象冲馈现象A.定义定义：当D增大到某一数值max时，S迅速增大，X迅速下降至零，这种在稳定状态丧失所有生物体的现象就叫冲馈现象。B.原因原因：基质在反应器内停留的时间太短，以至菌体来不及生长繁殖，基质已流出反应器外。C.Dcri临界稀释率临界稀释率：菌体浓度为零的稀释率。D.可测定max。E.若SinKSD=max菌体产量DX产物量DP最高产物产率的稀释率最高产物产率：DmaxXmax例、葡萄糖为限制性基质进行呼吸缺陷性酵母发酵突变株的单级连续培养（恒化器法）。请给出存在乙醇有抑制和无抑制两种情况下稀释率

36、D与菌体浓度X、基质浓度S与产物（乙醇）浓度P的关系。已知原料中不含产物乙醇（P=0)，S0=10g/L。解：稳定状态下，X的关联式为：对于产物抑制，由表查得抑制方程动力学为（1）将已知数据代入（1）（3）式，计算相应的X、S和P值，结果见图（3）无抑制有抑制（2）例求青霉素连续发酵稳定状态下最大菌体生成速率(DX)max及此时的D、X和S。已知（菌体生长可用monod方程表达）S0=30g/L,YX/S=0.45,max=0.18h-1,KS解：将数值代入得具有反馈的单级连续培养具有反馈的单级连续培养n特点；提高系统内的稳定范围，减小冲洗现象出现的几率；使发酵罐在菌体较高的情况下运作，有利于

37、菌体的繁殖、生长和提高发酵产物的产率。n衡算g菌体浓缩系数（1）r在循环反应液的比例（0）（返回的反应液与供给的新鲜液的体积比）D D为为“外部外部”稀释率，对稀释率，对于反应器本身，还要用于反应器本身，还要用一个一个“内部内部”稀释率稀释率DD的概念，它等于的概念，它等于D D加上加上rDrD，有有反反馈馈的的单单级级或或多多级级连连续续培培养养中中，稳稳态态下下的的稀稀释释率率都都高高于于比比生生长长速速率率。这这与与常常规规单单级级连连续续培培养养（保保持持）不不同同。前前者者流流入入反反应应器器的的培培养养液液体体积积要要相相对对多多一一些些。这这一一方方法法在在生生物物法法废废水水处

38、处理理过过程程之之一一的的活活性性污污泥泥法法中中普普遍遍采采用用，因因为为其有利于提高除污能力。其有利于提高除污能力。n理论上，反馈操作使菌体产率增大，但实际运用理论上，反馈操作使菌体产率增大，但实际运用并不尽然。反应液中菌体的浓度取决于收率和底并不尽然。反应液中菌体的浓度取决于收率和底物消耗的数量，即物消耗的数量，即 n因此，无其它限制因子时，微生物菌体浓度在一因此，无其它限制因子时，微生物菌体浓度在一定范围内受底物浓度的制约。如果采用控制底物定范围内受底物浓度的制约。如果采用控制底物浓度的方法来控制菌体浓度，可使无反馈反应系浓度的方法来控制菌体浓度，可使无反馈反应系统中的菌体浓度达到反馈

39、条件时的菌体浓度的同统中的菌体浓度达到反馈条件时的菌体浓度的同样数值，此时，反馈对于提高菌体产率并不显示样数值，此时，反馈对于提高菌体产率并不显示优越性。相反，由于分离后反应液中菌体浓度降优越性。相反，由于分离后反应液中菌体浓度降低，对菌体生产（如面包酵母生产）反而不利。低，对菌体生产（如面包酵母生产）反而不利。对于具有反馈的单级系统来讲，还要考虑排出反应对于具有反馈的单级系统来讲，还要考虑排出反应液中菌体的浓度。菌体分离装置处的菌体恒算式为液中菌体的浓度。菌体分离装置处的菌体恒算式为所以，所以，即菌体产率等于比生长速率与即菌体产率等于比生长速率与 的乘积。的乘积。由于具有反馈时的由于具有反馈

40、时的 大于无反馈时的大于无反馈时的 ，因此，因此，反馈使反应器的产率增加了反馈使反应器的产率增加了 倍。倍。所以，从菌体分离装置处流出的菌体浓度为所以，从菌体分离装置处流出的菌体浓度为4.4.1.34.4.1.3多级多级CSTRCSTR串联串联串联串联A.分类分类n单流多级串联：后级对前一级无影响（无循环）n多级多流：第二级相同D独立、前后级不影响n带循环多级串联：D之间有关系（优点：基质利用充分转化率高、操作复杂）B B单流多级串联系统单流多级串联系统n假设一般进料、稳态操作；各级CSTR体积相同；每一个反应器为全混流，各反应器内无返混；各反应器操作条件相同，得率为常数。n方程建立X：S：，

41、Dn应用解决不同生产阶段有不同生产要求的矛盾；若不是细胞本身，而是细胞分泌（次级代谢产物）单罐连续发酵不如双罐串联解决快速生长和营养充分利用矛盾；充分利用基质4.4.2恒浊器法连续操作nmax操作nX保持一定，进行反馈控制（F变量）n测定参数，通过pH、CO和S进行控制理想X（细胞流变仪），初期通过光电装置测定浊度.4.4.3固定化微生物反应器的连续操作n由于微生物固定于载体上，不受操作上“冲出”想象制约，流加基质的流量可适当增大（D范围）n能够在一定程度上避免悬浮液微生物连续反应中最为危险的杂菌污染问题n单细胞悬浮液微生物的反应速率几乎不受物质传递的影响，但固定化微生物反应速率却受到物质传递

42、的影响。4.5其他模型最简单的结构模型两室模型 Williams于1967年提出的两室模型(two compartmental model)。两室模型将细胞分为两部分：合成室(synthetic compartment)，简称K室，由RNARNA和 前前 体体 物物 质质 等 组 成；遗 传 室(structural-genetic compartment)，简称G室，由DNA和蛋白质等组成。单位体积细胞中K室和G室的密度分别记为 和 。细胞完全由细胞完全由细胞完全由细胞完全由K K K K室和室和室和室和G G G G室组成室组成室组成室组成。因此细胞的密度c为 c=k+G将反应器体积和反应

43、体系中的细胞总体积分别记为VR和VC,则反应体系中细胞的质量浓度X与细胞总体积的关系为X=cVc/VRn n细细细细胞胞胞胞内内内内G G G G室室室室质质质质量量量量的的的的加加加加倍倍倍倍(即即即即DNADNADNADNA复复复复制制制制完完完完成成成成)是是是是细细细细胞胞胞胞分分分分裂裂裂裂的的的的充充充充分分分分必必必必要要要要条条条条件件件件，也就是说，从宏观上看细胞的数量与反应体系中G室的质量(GVC)成正比。假设K K室、室、G G室和细胞外环境中底物的关系图室和细胞外环境中底物的关系图 在细胞内,K室按一定的速率转化为G室，反应速率与K室和G室在细胞中浓度的乘积(KG)成正

44、比。n n细胞吸收底物将其转化为细胞吸收底物将其转化为K K室组分室组分，该反应的速率与反应体系中的细胞浓度(X)和底物浓度(S)成正比，底物转化为细胞组分的得率系数为YX/S;特点n描述间歇生长的迟滞期，以及在生长过程中因细胞尺寸的变化导致细胞生物量的增加与细胞数目增加的不同步现象。Williams两室模型模拟的间歇生长过程（接种用的细胞是对数生长期末期的细胞）细胞分裂细胞分裂最简单的分立模型细菌成熟模型1971年，Blanch和Rogers提出了菌龄分布模型n短杆菌肽S（细菌次生代谢产物）n内容：1）细胞群体按菌龄人为地分为两类，即不成熟细胞(X1)和成熟细胞(X2)，两类细胞的元素组成和

45、大小完全相同。不成熟细胞X1产物Monod方程老化过程老化过程成熟细胞X2X=X1+X2内容1）新生细胞按一定的速率转化为成熟细胞(这个过程称为老化过程或成熟过程)，一个成熟细胞可以通过分裂繁殖形成两个新生细胞。细胞老化的速率与新生细胞的浓度成正比。成熟细胞的分裂速率则用Monod方程描述。2）假设限制性底物完全消耗在成熟细胞分裂为新生细胞的过程中，也就是说限制性底物被完全用来合成新的生物量，每次细胞分裂需要消耗的底物量恰好足以合成一个新细胞。3）非生长偶联型产物的生成速率与成熟细胞的积累速率成正比。菌龄分布模型拟合短杆菌S发酵过程细胞生长曲线符合Monod方程描述。第第5章章动植物细胞培养的

46、动力学动植物细胞培养的动力学动植物培养的特点：动植物培养的特点：动植物细胞培养与微生物培养性能的对比 项 目 哺乳动物细胞 植物细胞 微生物细胞大小m悬浮生长营养要求倍增时间h细胞分化环境的敏感性细胞壁kLah-1产物物存在产物浓度/含水量/产物种类10-100可以，多采用贴壁很复杂15-100有非常敏感无1-25胞内或胞外低7085疫苗、激素、抗体、生长因子、免疫调节剂等10-100可以，但细胞易聚集复杂15-100有限分化敏感有20-30胞内低90酶、生物碱、天然色素、有机化合物等1-10可以简单0.55无般有100-1000胞内或胞外高75发酵食品、抗生素、有机化合物、酶等A.A.优点优

47、点优点优点1.可以利用细胞融合技术，由融合动物细胞即杂交瘤细胞，生产任何一种结构完全相同的抗体即单克隆抗体。这也是广泛开展动物细胞培养研究的原因。2.明显地表达产物。nB缺点：缺点：1.培养其组成复杂，价格昂贵，反应过程成本高，主要培养其组成复杂，价格昂贵，反应过程成本高，主要用于高附加值产物的生产。用于高附加值产物的生产。2.2.生长速率慢，易被微生物污染。生长速率慢，易被微生物污染。3.3.代谢废物阻碍细胞生长。代谢废物阻碍细胞生长。4.4.承受机械冲击能力差（细胞个大无臂，对环境敏感）。承受机械冲击能力差（细胞个大无臂，对环境敏感）。5.5.设备放大是一新课题，不能完全按照微生物反应过程

48、设备放大是一新课题，不能完全按照微生物反应过程的经验。的经验。C产品大致可分为产品大致可分为4大类：大类：疫苗疫苗干扰素；干扰素；单克隆抗体；单克隆抗体；遗传重组遗传重组产品。产品。植物细胞培养的特点植物细胞培养的特点：n1937年前后，法国和美国科字家分别成功地进行了胡萝卜和烟草的组织培养。n紫草悬浮培养物生产紫草宁、人参皂苷、花青素、长春花碱、黄连素、抗癌药物紫杉醇和烟草细胞的大量培养等植物培养细胞具有如下特点植物培养细胞具有如下特点：n细细胞胞个个大大（10100/m）并并且且细细胞胞壁壁是是以以纤纤维维素素为为主主要成分，耐拉不耐扭，因此，抗剪切能力低；要成分，耐拉不耐扭，因此，抗剪切

49、能力低；n与与动动物物细细胞胞培培养养类类同同，生生长长速速率率慢慢，为为防防止止培培养养过过程程中染菌，需加抗生素；中染菌，需加抗生素；n细细胞胞培培养养需需氧氧，而而培培养养液液黏黏度度大大，且且不不能能强强力力通通风风搅搅拌；拌；n产物在细胞内且产量低；产物在细胞内且产量低；n培培养养的的植植物物细细胞胞常常生生长长成成各各种种大大小小的的团团块块(从从几几个个细细胞胞到几百个细胞到几百个细胞)，增加了悬浮培养的难度等。，增加了悬浮培养的难度等。n植植物物细细胞胞具具有有坚坚固固的的细细胞胞壁壁，通通常常次次级级代代谢谢产产物物不不分分泌泌到到胞胞外外，而而包包含含在在细细胞胞内内。因因

50、此此，要要得得到到大大量量次次级级代谢产物，就必须进行高密度培养。代谢产物，就必须进行高密度培养。生长模型与培养条件生长模型与培养条件5.2.15.2.1动植物细胞的生长模型动植物细胞的生长模型n碳源与生长模型碳源与生长模型烟草细胞分批培养Monod方程n呼吸与生长模型呼吸与生长模型烟草细胞n胞内物质与生长模型胞内物质与生长模型微生物培养中，把细胞内RNA含量作为描述其生长速率的指标。且随微生物比生长速率的增加，RNA含量增大。在植物细胞的培养中也有类似的报道。吉田等在进行人参细胞培养中发现，在对数生长期，细胞的RNA含量显著增大。RNA=36+25 综上所述，动植物细胞生长动力学的研究，在很