《蛋白质共价结构》PPT课件.ppt

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1、第第4章章 蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构1 蛋白质通论蛋白质通论1.1 形状和大小形状和大小v按形状和溶解度分类：按形状和溶解度分类：纤维状蛋白质纤维状蛋白质：角蛋白、丝蛋白、胶原蛋白：角蛋白、丝蛋白、胶原蛋白 不溶于水和稀盐溶液；结构作用。不溶于水和稀盐溶液；结构作用。球状蛋白质球状蛋白质：溶解性较好；功能多样。溶解性较好；功能多样。v相对分子质量：相对分子质量：6000到到1x1061.2 构象和组织层次构象和组织层次v构型构型：具有：具有相同结构式相同结构式的立体异构体中取代的立体异构体中取代基在空间的相对取向。基在空间的相对取向。不同的构型间的转变不同的构型间的转变需要需要共价键的

2、断裂和重新形成。共价键的断裂和重新形成。v构象构象：具有：具有相同结构式相同结构式和和相同构型相同构型的分子在的分子在空间里可能的多种状态。空间里可能的多种状态。不同的构象间转变不同的构象间转变不需要不需要共价键的断裂和重新形成。共价键的断裂和重新形成。v蛋白质的天然构象蛋白质的天然构象：每一种蛋白质至少有一每一种蛋白质至少有一种构象在生理条件下是稳定的，并具有生物活性种构象在生理条件下是稳定的，并具有生物活性的构象。的构象。v结构层次结构层次：一级结构一级结构（1）（primary structure)二级结构二级结构（2）（secondary structure）超二级结构超二级结构 （s

3、upersecondary structure）结构域结构域 （structural domain）三级结构三级结构（3）（tertiary structure）四级结构四级结构（4）（quarternary structure）各个结构层次之间的关系可以作下列表示：各个结构层次之间的关系可以作下列表示：一级结构一级结构二级结构二级结构超二级结构超二级结构 结构域结构域三级结构三级结构四级四级结构结构1.3 蛋白质功能的多样性蛋白质功能的多样性v催化催化 (酶酶)v调节调节 (激素、激活剂）激素、激活剂）v转运转运 （血红蛋白、膜转运蛋白）（血红蛋白、膜转运蛋白）v贮存贮存 （卵清蛋白）（卵清

4、蛋白）v运动运动 （肌动蛋白、肌球蛋白）（肌动蛋白、肌球蛋白）v结构成分结构成分 （角蛋白、胶原蛋白）（角蛋白、胶原蛋白）v防御和进攻防御和进攻 （免疫球蛋白、蛇毒的溶血蛋白）（免疫球蛋白、蛇毒的溶血蛋白）P161-162荧光素酶荧光素酶血红蛋白（氧转运蛋白）血红蛋白（氧转运蛋白）角蛋白角蛋白2 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构v一级结构一级结构（primary structure):多肽链的氨基酸的序列。多肽链的氨基酸的序列。主要连接键：主要连接键：肽键肽键 肽链中的氨基酸由于形成肽键时脱水，已不是完整的氨基酸，肽链中的氨基酸由于形成肽键时脱水，已不是完整的氨基酸，所以称为所以称为残基残基肽

5、健肽健2.1 肽键和肽肽键和肽肽键：反式构型肽键：反式构型二肽二肽 三肽三肽 四肽四肽 寡肽（寡肽（oligopeptide）12个以上，个以上，20个以下个以下氨基酸缩合而成氨基酸缩合而成多肽（多肽（Polypeptide）2020个以上氨基酸缩合而成个以上氨基酸缩合而成肽肽（peptide）：由两个或两个以上的氨基酸通过：由两个或两个以上的氨基酸通过肽键肽键连接而连接而形成的化合物。形成的化合物。肽链肽链：氨基酸通过肽键连接起来而形成的链。：氨基酸通过肽键连接起来而形成的链。氨基酸残基氨基酸残基氨基酸残基氨基酸残基N N端端（游离的氨基）（游离的氨基）C C端端（游离的羧基）（游离的羧基）

6、肽健肽健肽健肽健肽单位肽单位肽链书写方式肽链书写方式：从左到右，从左到右，N端端C端端 命名：根据氨基酸组成，由命名：根据氨基酸组成，由N端端C端端命名为命名为 某氨酰某氨酰某氨酰某氨酰某氨基酸某氨基酸 丙氨酰谷氨酰甘氨酰赖氨酸丙氨酰谷氨酰甘氨酰赖氨酸AlaGlu-GlyLys(or AEGK)2.2 肽的化学性质肽的化学性质双缩脲反应双缩脲反应：肽和蛋白质特有的。：肽和蛋白质特有的。含有两个或两个以上的肽键化合物与含有两个或两个以上的肽键化合物与CuSO4碱性溶液生成碱性溶液生成紫红色或蓝紫色紫红色或蓝紫色的复的复合物。合物。用分光光度计测定蛋白质含量。用分光光度计测定蛋白质含量。2.3 天

7、然存在的活性肽天然存在的活性肽v活性肽（活性肽（active peptide）:有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在，有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在，通常都具有特殊的生理功能。通常都具有特殊的生理功能。多肽激素多肽激素 多肽抗菌素多肽抗菌素L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-ValL-OrnL-OrnL-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu短杆菌肽短杆菌肽S(S(环十肽环十肽)由由细细菌菌分分泌泌的的多多肽肽，有有时时也也都都含含有有D-D-氨氨基基酸酸和和一一些些非非蛋蛋白白氨氨基基酸酸。如如鸟鸟氨氨酸酸（OrnOrnithine,ithine,缩缩写为写为 Orn Or

8、n）。）。+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-Met-脑啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-脑啡肽 脑啡肽脑啡肽与真核生物的与真核生物的RNARNA聚合酶聚合酶 和和牢固结合牢固结合 鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱vCO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOHCHCH2 2CHCH2 2CHNHCHNH2 2COOHCOOHCH2CH2SHSH 谷胱甘肽谷胱甘肽存在与动、植物及存在与动、植物及微生物中：微生物中：1.1.参与体内氧化还原反应参与体内氧化还原反应 2.2.作为辅酶参与氧化还原反应作为辅酶参与氧化还原反应 保护巯基酶或含保护巯基酶或含Cy

9、sCys的蛋白质中的蛋白质中 SH SH的还原性的还原性 防止氧化物积累防止氧化物积累2GSH2GSHGS-SGGS-SG 谷胱甘肽谷胱甘肽3 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目 拆分蛋白质的多肽链拆分蛋白质的多肽链 断开多肽链内的二硫桥断开多肽链内的二硫桥 分析每一多肽链的氨基酸组成分析每一多肽链的氨基酸组成 鉴定多肽链的鉴定多肽链的N-末端和末端和C-末端残基末端残基 裂解多肽链成较小的片段裂解多肽链成较小的片段 测定个肽段的氨基酸序列测定个肽段的氨基酸序列 重建完整多肽链的一级结构重建完整多肽链的一级结构 确定半胱氨酸残基间

10、形成的确定半胱氨酸残基间形成的S-S交联桥位置交联桥位置Sanger于于1953年第一个测定氨基酸序列年第一个测定氨基酸序列 -牛胰岛素牛胰岛素（insulin）(获获1958年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖)DNFB(2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯)N末端末端2130蛋白质的蛋白质的N-末端或末端或C-末端残基的摩尔数和蛋白末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量质的相对分子质量3.1 测定蛋白质分子中多肽链数目测定蛋白质分子中多肽链数目3.2 拆分蛋白质的多肽链和断开多肽拆分蛋白质的多肽链和断开多肽链内的二硫桥链内的二硫桥非共价键：非共价键：血红蛋白（四聚体）血红蛋白（四聚体）断裂：断裂：8mol

11、/L尿素或尿素或6 mol/L盐酸胍盐酸胍二硫键：二硫键：链内或链间链内或链间还原还原：过量的：过量的-巯基乙醇巯基乙醇（pH89）保护巯基：烷基化试剂（碘乙酸）保护巯基：烷基化试剂（碘乙酸）水解破坏肽健水解破坏肽健氨基酸混合物氨基酸混合物柱层析分离柱层析分离测定氨基酸测定氨基酸（主要是酸水解，（主要是酸水解，同时辅以碱水解同时辅以碱水解 ）3.3 氨基酸组成的分析氨基酸组成的分析氨基酸组成：氨基酸组成：用每摩尔蛋白质中含有氨基酸残基的摩尔数，用每摩尔蛋白质中含有氨基酸残基的摩尔数，或每或每100g蛋白质中含有氨基酸的克数来表示。蛋白质中含有氨基酸的克数来表示。3.4 N末端和末端和C末端氨基

12、酸残基的末端氨基酸残基的鉴定鉴定(1)N末端末端 2，4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB)法法*丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNS)法法 苯异硫氰酸酯（苯异硫氰酸酯（PITC)法法*氨肽酶法氨肽酶法DNFB弱碱性溶液中弱碱性溶液中（DNP-蛋白质）蛋白质）黄色化合物黄色化合物（Sanger试剂）试剂）与蛋白质氨基发生反应与蛋白质氨基发生反应酸水解酸水解肽健断开，肽健断开，DNP-基不脱落基不脱落DNP-氨基酸能溶于氨基酸能溶于有机溶剂而与其他有机溶剂而与其他aa分离分离层析鉴定层析鉴定DNP-氨基酸氨基酸 2，4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB)法法DNFBDNP-蛋白质蛋白质DNP-氨基酸氨基酸

13、 丹磺酰氯法（丹磺酰氯法（DNS法）法）原理与原理与DNFB法相同法相同丹磺酰基有强荧光丹磺酰基有强荧光，灵敏度，灵敏度 比比DNFB法高法高100倍倍水解后水解后DNS-氨基酸不需提取氨基酸不需提取 直接用层析鉴定。直接用层析鉴定。(DNS-氨基酸氨基酸)苯异硫氰酸苯异硫氰酸(酯酯)法法（PITC法、法、Edman降解法降解法）PITC弱碱性条件下弱碱性条件下与末端氨基反应与末端氨基反应 PTC-肽肽PTH-氨基酸氨基酸酸性有机溶剂酸性有机溶剂加热加热层析鉴定层析鉴定特点：剩下的肽链仍是完整的。特点：剩下的肽链仍是完整的。每次只从蛋白质的每次只从蛋白质的N端解离和鉴定一个端解离和鉴定一个aa

14、残基残基还可用来测定氨基酸序列还可用来测定氨基酸序列 氨肽酶法氨肽酶法 肽链外切酶，肽链外切酶，从肽链从肽链N-N-末端逐个降解末端逐个降解，释放出游离氨基酸。，释放出游离氨基酸。AlaValGlyAla-Val-Gly局限性：酶对各种肽键敏感性不一样，常常难以判断氨基酸残基的顺序。局限性：酶对各种肽键敏感性不一样，常常难以判断氨基酸残基的顺序。(2)C末端末端 还原法还原法肼解法肼解法 羧肽酶法羧肽酶法C末端氨基酸末端氨基酸硼氢化锂硼氢化锂还原还原氨基醇氨基醇肽链水解肽链水解层析法鉴定层析法鉴定 硼氢化锂还原法硼氢化锂还原法 肼解法肼解法 多肽与肼在无水条件下加热，多肽与肼在无水条件下加热，

15、可断裂所有的肽键可断裂所有的肽键，除，除C末末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物酰肼化合物。肼解下。肼解下来的来的C末端氨基酸可用层析鉴定。末端氨基酸可用层析鉴定。羧肽酶法羧肽酶法 肽链外切酶，肽链外切酶，从肽链从肽链C-C-末端逐个降解末端逐个降解，释放出游离氨基酸。，释放出游离氨基酸。反应时间反应时间氨氨基基酸酸释释放放量量3.5 多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化 酶裂解法酶裂解法*：（酶的专一性）酶的专一性）A A 胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶(Trypsin(Trypsin）：）：）：）：R

16、1=赖氨酸、精氨酸赖氨酸、精氨酸 但但R2=脯氨酸抑制脯氨酸抑制B B 胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）：胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）：胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）：胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）：R R1 1=苯丙氨酸、色氨酸苯丙氨酸、色氨酸苯丙氨酸、色氨酸苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、酪氨酸但但R2=脯氨酸抑制脯氨酸抑制C 嗜热蛋白酶：嗜热蛋白酶：R2=亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸氨酸、甲硫氨酸D 胃蛋白酶胃蛋白酶:R1和和R2=苯丙氨酸苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸 溴化氰（溴化氰（CNBr）:只断裂只断裂Me

17、t的羧基的羧基形成的肽健形成的肽健Met残基残基高丝氨酸内酯残基高丝氨酸内酯残基 化学裂解法：化学裂解法：3.6 肽段氨基酸序列的测定肽段氨基酸序列的测定v肽部分水解后，降解成长短不一的小肽段，用层析或电肽部分水解后，降解成长短不一的小肽段，用层析或电泳分离，然后测序。泳分离，然后测序。Edman化学降解法（化学降解法（PITC）1950年年Edman P.首先提出首先提出多肽的游离末端多肽的游离末端NH2+PITC PTC-多肽多肽 (PTC-氨基酸氨基酸)（环化）（环化）PTH-氨基酸氨基酸+减少一个残基的减少一个残基的肽肽 根据核苷酸序列的推定法根据核苷酸序列的推定法v多用多用两种水解方

18、法降解两种水解方法降解，得到两套肽段，经两套肽，得到两套肽段，经两套肽段序列的段序列的重叠拼接重叠拼接得到整个肽链全长序列。得到整个肽链全长序列。3.7 肽段在多肽链中次序的决定肽段在多肽链中次序的决定氨基末端残基氨基末端残基氨基末端残基氨基末端残基 H H 羧基末端残基羧基末端残基羧基末端残基羧基末端残基 S S第一套肽段第一套肽段OUSPSEOVERLAHOWT第二套肽段第二套肽段SEOWTOUVERLAPSHO末端残基末端残基 H S末端肽段末端肽段 HOWT A APS第一套肽段第一套肽段第一套肽段第一套肽段第二套肽段第二套肽段第二套肽段第二套肽段HOWTHOWTHOHOWTOUWTO

19、UOUSOUSSEOSEOEOVEEOVEVERLVERLRLARLAAPSAPSPSPS溴化氰溴化氰胰蛋白酶胰蛋白酶DNFB38N:(E)Glu断开二硫键断开二硫键K：LysR：ArgM：MetC:(D)Asp3.8 二硫桥位置的确定二硫桥位置的确定胃蛋白酶水解胃蛋白酶水解(专一性低，切点多；作用专一性低，切点多；作用pH（2）防止二硫键发生交换反应）防止二硫键发生交换反应）Brown及及Hartlay的对角线电泳技术的对角线电泳技术（过甲酸断裂二硫键）（过甲酸断裂二硫键）对角线电泳对角线电泳4 蛋白质的氨基酸序列与生物功能蛋白质的氨基酸序列与生物功能同源蛋白质的物种差异与生物进化同源蛋白质

20、的物种差异与生物进化v同源蛋白质同源蛋白质：在不同生物体中行使相同或相似在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质。功能的蛋白质。氨基酸序列同源氨基酸序列同源，如血红蛋白。，如血红蛋白。不变残基、可变残基不变残基、可变残基v细胞色素细胞色素c：含血红素的电子转运蛋白。含血红素的电子转运蛋白。存在于所有真核生物的线粒体中。存在于所有真核生物的线粒体中。28个不变残基。个不变残基。v 两个物种的同源蛋白质的序列间的氨基酸两个物种的同源蛋白质的序列间的氨基酸差差异数目异数目与这些物种间系统发生差异是成比例与这些物种间系统发生差异是成比例的。的。细胞色素细胞色素c 人与黑猩猩人与黑猩猩0；人与其他哺乳动

21、物人与其他哺乳动物10；人与酵母人与酵母40以上。以上。l系统树：分析细胞色素系统树：分析细胞色素c序列并找出连接分支的最小突变残基数的方法。序列并找出连接分支的最小突变残基数的方法。5 肽和蛋白质的人工合成肽和蛋白质的人工合成v1958年，北京大学生物系在国内首次合成具年，北京大学生物系在国内首次合成具有生物活性的八肽有生物活性的八肽-催产素催产素。v1965年年9月，中国科学院生物化学研究所、月，中国科学院生物化学研究所、有机化学研究所和北京大学化学系协作，在有机化学研究所和北京大学化学系协作，在世界上首次人工合成了世界上首次人工合成了结晶牛胰岛素结晶牛胰岛素。肽的人工合成肽的人工合成v液

22、相合成法液相合成法 N端端C端端 氨基和羧基保护剂及激活剂氨基和羧基保护剂及激活剂v 固相肽合成固相肽合成液相合成法液相合成法（1 1）一个氨基酸的）一个氨基酸的氨基氨基和另一个氨基酸的和另一个氨基酸的羧基羧基被保护基封闭被保护基封闭羧基保护基羧基保护基(Z)：甲酯（甲酯（CH3O-）、乙酯（）、乙酯（C2H5O-）在室温下皂化除去在室温下皂化除去保护基：接肽时起保护作用，保护基：接肽时起保护作用，接肽后容易除去，又不引起肽健断裂。接肽后容易除去，又不引起肽健断裂。氨基保护基氨基保护基(Y)：苄氧甲酰基苄氧甲酰基（Cbz）可用催化加氢或用金属钠在液氨中处理除去可用催化加氢或用金属钠在液氨中处理

23、除去（2 2）在）在缩合剂缩合剂作用下缩合形成二肽作用下缩合形成二肽(肽键不能自发形成肽键不能自发形成)缩合剂：缩合剂：N，N-二环己基碳二亚胺（二环己基碳二亚胺（DCC）（3 3）接肽完成后除去保护基）接肽完成后除去保护基缺点：步骤多，产率低缺点：步骤多，产率低固相肽合成固相肽合成 （1 1）第一个氨基酸）第一个氨基酸(N端端被保护被保护)的的羧基端羧基端先和先和(氯甲氯甲基聚苯乙烯基聚苯乙烯)树脂树脂反应，形成苄酯。反应，形成苄酯。（3 3）第二个氨基酸（）第二个氨基酸（氨基预先用叔丁氧甲酰基保护氨基预先用叔丁氧甲酰基保护）,以以DCCDCC为缩合剂，接在第一个氨基酸的氨基上。重为缩合剂，

24、接在第一个氨基酸的氨基上。重复这个方法。复这个方法。（4 4）最后使多肽与树脂分离，同时除去保护基。）最后使多肽与树脂分离，同时除去保护基。（2）除去该氨基酸）除去该氨基酸N端的保护基端的保护基固固相相肽肽合合成成挂接挂接去去保保护护活化羧基活化羧基氨基保护氨基保护缩合缩合断裂与去保护断裂与去保护Exercisev由下列信息求八肽的序列。由下列信息求八肽的序列。v（a）酸水解得）酸水解得 Ala，Arg，Leu，Met，Phe，Thr，2Val；v（b）Sanger试剂处理得试剂处理得DNP-Ala；v（c）胰蛋白酶处理得）胰蛋白酶处理得Ala，Arg，Thr 和和 Leu，Met，Phe，2

25、Val，当以，当以Sanger试剂处理时分别得到试剂处理时分别得到DNP-Ala和和DNP-Val；v（d）溴化氰处理得）溴化氰处理得 Ala，Arg，高丝氨酸内酯，高丝氨酸内酯，Thr，2Val，和，和 Leu，Phe，当用，当用Sanger试剂处理试剂处理时，分别得时，分别得DNP-Ala和和DNP-Leu。答答：（1）酸水解得）酸水解得 Ala，Arg，Leu，Met，Phe，Thr，2Val；v可知氨基酸的种类和数量可知氨基酸的种类和数量（2）Sanger试剂处理得试剂处理得DNP-Alav由于由于Sanger试剂试剂(DNFB)反应可鉴定反应可鉴定N末端氨末端氨基酸残基，所以基酸残基

26、，所以Ala 位于此八肽的位于此八肽的N端。端。vN末端末端:Ala(3)胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理以以Sanger试剂处理试剂处理,v胰蛋白酶：水解胰蛋白酶：水解Lys和和Arg的羧基形成的肽健的羧基形成的肽健Ala，Arg，Thr 和和 DNP-Ala vN末端末端:Alav三肽顺序为三肽顺序为Ala-Thr-Arg Leu，Met，Phe，2Val，和，和DNP-ValvN末端末端:ValvAla-Thr-Arg Val.(4)溴化氰处理溴化氰处理Sanger试剂处理试剂处理v由于溴化氰（由于溴化氰（CNBr）断裂）断裂Met的羧基形成的肽健的羧基形成的肽健Ala，Arg，高丝氨酸内酯，高丝氨酸内酯，Thr，2Val和和 DNP-AlavN末端末端:AlaMet Leu，Phe 和和DNP-Leu vN末端末端:Leu vLeu-Phe所以所以AlaMet-Leu-Phe(5)重叠肽段法重叠肽段法:vAla，Arg，Leu，Met，Phe，Thr，2Valv八肽的八肽的N末端末端AlavAla-Thr-Arg-Val.vAlaMet-Leu-Phe所以八肽氨基酸序列为所以八肽氨基酸序列为:Ala-Thr-Arg-Val-Val-Met-Leu-Phe名词解释名词解释v蛋白质的一级结构（蛋白质的一级结构（primary structure)作业题vP195:2vP196:4，6